Summary
Artikeln beskriver detaljerad metod för att effektivt differentiera humana pluripotenta stamceller till kardiomyocyter genom att selektivt modulera Wnt pathway, följt av flödescytometrianalys av referensmarkörer för att bedöma homogenitet och identitet av befolkningen.
Abstract
Det finns ett akut behov av att utveckla metoder för att reparera det skadade hjärtat, upptäcka nya terapeutiska läkemedel som inte har toxiska effekter på hjärta, och förbättra strategier för att exakt modell hjärtsjukdom. Potentialen att utnyttja inducerad teknik mänskliga pluripotenta stamceller (hiPSC) för att generera hjärtmuskeln "i en skål" för dessa tillämpningar fortsätter att generera hög entusiasm. Under de senaste åren har förmågan att effektivt generera cardiomyogenic celler från humana pluripotenta stamceller (hPSCs) förbättrats avsevärt, erbjuder oss nya möjligheter att modellera mycket tidiga stadier av människans hjärt utveckling annars inte tillgängliga. Till skillnad från många tidigare metoder, beskrev cardiomyocyte differentieringsprotokoll här kräver inte cellaggregation eller tillsats av Aktivin A eller BMP4 och robust genererar kulturer av celler som är mycket positiv för kardiellt troponin I och T (TNNI3, TNNT2), iroquois- klass homeodomän-proteinIRX-4 (IRX4), myosin reglerande lätt kedja 2, ventrikulära / hjärtmuskeln isoform (MLC2v) och myosin reglerande lätt kedja 2, förmaks isoform (MLC2a) vid dag 10 i alla mänskliga embryonala stamceller (hESC) och hiPSC linjer testade enligt datum. Celler kan passe och underhållas under mer än 90 dagar i odling. Strategin är tekniskt enkelt att genomföra och kostnadseffektiv. Karakterisering av cardiomyocytes härrör från pluripotenta celler innehåller ofta analys av referensmarkörer, både på mRNA och proteinnivå. För proteinanalys, flödescytometri är ett kraftfullt analysverktyg för att bedöma kvaliteten på celler i odling och bestämma subpopulation homogenitet. Däremot kan teknisk variation i provberedning påtagligt påverka kvaliteten på flödescytometri uppgifter. Därför bör standardisering av färgningsprotokoll underlätta jämförelser mellan olika differentieringsstrategier. Följaktligen optimerad färgningsprotokoll för analys av IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 och TNNT2 med flödescytometri beskrivs.
Introduction
Genereringen av cardiomyocytes från hPSCs, inklusive stamceller från mänskliga embryon och hiPSC, kan fungera som en modell för mycket tidiga humana hjärt utvecklingsprocesser in vitro, som ger en inblick i etapper annars är svårtillgängliga för mekanistiska studier. Detta modellsystem ger unika möjligheter att studera de molekylära vägar som kontrollerar hjärt härstamning engagemang och cell öde specifikation. Under de senaste åren har förmågan att effektivt generera cardiomyogenic celler från hPSCs förbättrats avsevärt 1-15. Men bland protokoll finns cellinje variation med avseende på effektivitet i att generera cardiomyogenic celler och tidpunkten vid vilken cellerna uttrycker kammarspecifika markörer (t.ex., ventrikeln och Atria). Helst för framtida tillämpningar av denna modellsystem är mer homogena populationer av funktionellt definierade celler önskas. I motsats till tidigare metoder, beskrev cardiomyocyte differentieringsprotokoll här kräver inte cell aggregering eller tillsats av Aktivin A eller benmorfogenesprotein 4 (BMP4) och kraftigt genererar kulturerna mycket positivt för TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v och MLC2a dag 10 celler över testade hittills alla hESC och hiPSC linjer. Strategin är tekniskt enkelt att genomföra, särskilt i jämförelse med tredimensionella kulturer, masskultur, eller embryoid kropp baserade strategier 4-9, och har nyligen definierats i en studie som beskriver en liten molekyl med selektiv toxicitet för hPSCs (Boheler et al. ) 65. Funktioner i detta protokoll omfattar differentiering av hPSCs i enskiktskultur med en enda skikt av en hESC kvalificerad matris (Matrigel), fullt definierade media med små molekyler för att modulera Wnt signalering (liknande, men ändå distinkt från 1,2,7,13), och optimerad flödescytometri färgningsmetoder för utvärdering av differentiering effektivitet och cellidentitet. Sammanfattningsvis fördelarna med detta protokoll jämfört med tidigare rapporter innehåller den kostnads effectiveness, reproducerbarhet, och dess höga effektivitet för att generera cardiomyocytes bland flera HPSC linjer, inklusive hESC och hiPSC linjer.
Flödescytometri är ett kraftfullt analysverktyg för att bedöma kvaliteten på celler i odling och bestämma subpopulation homogenitet, och med ordentlig experimentell design kan ge kvantitativa mätningar. Som med alla strategier antikroppsbaserade, korrekt tolkning av experimentella resultat kräver att delar av analys designen inklusive antikroppskoncentrationen och fixering och permeabilization förhållanden (då riktar intracellulära antigener) är noggrant testade för varje antikropp som suboptimala förhållanden påtagligt påverka effektiviteten av antikropp bindning, och därför, tolkning av resultat. Viktigt är, om kvantifiering önskas, monoklonala antikroppar är mycket viktiga, eftersom polyklonala antikroppar kan känna igen multipla epitoper och är benägna att batch-till-batch variation. För närvarande har ett antal olika antikroppar (polyclonal och monoklonala) och färgningsprotokoll har beskrivits för bedömningen av in vitro-differentiering, vilket gör det svårt att jämföra effektiviteten hos cardiomyogenesis bland protokollen 1,2,9,11. Av den anledningen är monoklonala antikroppar som används när tillgängliga för alla flödescytometri analyser. Framöver förväntas det att standardisering av dessa färgningsprotokoll, särskilt med avseende på kvantifiering bör bättre möjliggöra jämförelser mellan differentieringsstrategier.
Valet av markörer och deras motsvarande antikroppar, används för att bedöma renheten av in vitro cardiomyogenesis varierar bland rapporter. TNNT2 har ansetts vara en indikator på celler engagerade i cardiomyogenic öde och används rutinmässigt för att bedöma effektiviteten av hjärtdifferentieringsprotokoll. Emellertid är TNNT2 uttrycks också i skelettmuskler under tidig chick och råtta utveckling 16,17 och den är närvarande i human glatt muskulatur 18 in vitro. MLC2v och MLC2a används rutinmässigt som surrogatmarkörer för ventrikulära och förmaks subtyper, respektive. Men utmaningarna med att förlita sig på MLC2v och MLC2a att bestämma cardiomyocyte subtyp i samband med in vitro differentiering uppstår från det faktum att dessa genprodukter inte kan begränsas till en viss kammare hela hjärt utveckling, från hjärtat röret genom vuxen. I gnagare loopas hjärtat är MLC2a mRNA dominerar i förmaks / inflöde tarmområdet och MLC2v mRNA dominerar i de ventrikulära / utflöde regioner. I det kretsade hjärtat, är samtidigt uttryck för MLC2a och MLC2v mRNA observeras i inflödeskanalen, atrioventrikulärt kanalen och utflöde 19,20. Av 3 dagar efter födseln, är MLC2v mRNA begränsad till ventrikeln och med 10 dagar efter födseln, är MLC2a begränsad till förmaken i nyfödda råttor hjärtat 19. Därför tolkningav uppgifter om cardiomyogenesis effektivitet och subtyp identitet får inte bara tänka på närvaron och mängden av referensmarkörnivåer, utan måste ta hänsyn till utvecklingsstadiet (er) till vilka tidpunkter av differentiering som analyseras motsvarar. Detta är särskilt viktigt med tanke på att mognadsstadium cardiomyogenic celler som genereras av in vitro differentiering av hPSCs liknar närmast de av embryonal / fosterutveckling 21-25. Således, förlitar sig på en markörs spatial expression i den postnatala hjärtat inte kan vara lämpliga för bedömning av HPSC-härledda celler, åtminstone i vissa fall.
I ett försök att underlätta utvecklingen av mer specifika kriterier för att definiera cardiomyocyte identitet in vitro, är TNNI3 anses vara en värdefull markör för utvärdering cardiomyogenesis in vitro eftersom det är begränsat till hjärtmuskeln under embryogenes i chick och zebrafisk 15,20och är frånvarande i human fetal skelettmuskel 26. Medan TNNI1 är närvarande i humant fetalt hjärta, är TNNI3 den enda TNNI isoformen närvarande i normal vuxen hjärta 27,28. Beträffande cardiomyocyte subtyp identitet, IRX4 29-31 är en informativ markör för celler med en kammar öde. På proteinnivå, har IRX4 nyligen visat sig vara begränsad till ventrikeln från linjära hjärtröret genom neonatal stadier i musen 32. Följaktligen är optimerade färgningsprotokoll för analys av TNNI3 och IRX4 med flödescytometri beskrivits. Såvitt vi vet är detta den första beskrivningen av ett förfarande för effektiv antikroppsbaserad färgning och analys av IRX4 nivåer i humana kardiomyocyter genom flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Lösning och Media Förberedelse
- hESC Kvalificerade Matrisbeläggningsförrådslösning
- Långsamt tina hESC kvalificerad matris (5 ml) på is vid 4 ° C över natten. Fördela portioner i förväg kylda, 1,5 ml sterilt mikrocentrifugrör och omedelbart i -20 ° C.
OBS! Volymen av det delprov varierar beroende på mycket och vanligtvis sträcker sig från 270 till 350 | il. Tillverkare tillhandahåller uppgifter om volymen av delprov som krävs för att uppnå en 1x koncentration vid spädning i 25 ml enligt beskrivningen i steg 2.1.
- Långsamt tina hESC kvalificerad matris (5 ml) på is vid 4 ° C över natten. Fördela portioner i förväg kylda, 1,5 ml sterilt mikrocentrifugrör och omedelbart i -20 ° C.
- HPSC Media stamlösningar
- Använd ultrarent vatten som ett utspädningsmedel, om inte annat anges. Sterilisera alla komponenter med hjälp av en 0,22 m filter. Lagra följande som bulklösningar vid 4 ° C: natriumbikarbonat (75 mg / ml); citronsyra (10 mM, pH = 3).
- Sterilisera alla komponenter med 0,2 pm sprutfilter och lagra varje som alikvoter vid -20 ° C: Rho-kinas (ROCK) hämmare Y-27632 (10mM i DPBS, 100 | il alikvot); L-askorbinsyra 2-fosfat (64 mg / ml, 500 | il alikvot); natriumselenit (70 | ig / ml, 100 | il alikvot); transferrin (50 mg / ml, 107 | il alikvot); fibroblasttillväxtfaktör 2 (FGF2, 200 ng / l i DPBS, 250 pl alikvot); transformerande tillväxtfaktor beta 1 (TGFβ1, 100 ng / | il i kall 10 mM citronsyra, 10 | il alikvot).
- HPSC Media E8 Solution Sammansättning
- Förbered media med alikvoter som framställts i Steg 1,2: DMEM / F12 (med L-glutamin och HEPES; 500 ml), natriumbikarbonat (3,62 ml; slutlig: 543 | ig / ml), L-askorbinsyra 2-fosfat (500 pl; slutliga : 64 | ig / ml), natriumselenit (100 pl; slutlig: 140 ng / ml), transferrin (107 | il; slutlig: 10,7 ug / ml), insulin (1 ml; slutlig: 20 pg / ml), FGF2 (250 pl; slutlig: 100 ng / ml), TGFβ1 (10 ul; slutlig: 2 ng / ml).
- Kombinera alla komponenter, filtrera sterilisera och förvara vid 4 ° C i upp till 2 veckor.
- HPSC Media E8 med ROCK Inhibitor
- Lägg 15 pl ROCK-inhibitor till 12 ml E8 medier framställda såsom ovan och blanda väl. Se till att den slutliga koncentrationen är 10 ^ M efter tillsats av celler / media i steg 3.7.
- Stamlösningar av Wnt Modulatorer
- Förvara följande alikvoter vid -20 ° C. Chir 99.021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1 H -imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile; 10 mM i DMSO, 15 pl alikvot). IWR-1 (4-(1,3,3a, 4,7,7a-hexahydro-1.3-dioxo-4,7-metano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-kinolinyl-bensamid; 10 mM i DMSO, 6 pl alikvot).
- Differentiering av medier
- Förbered differentiering media # 1 med RPMI 1640 (med L-glutamin) med 2% B27 minus insulintillskott.
- Förbered differentieringsmedia # 2 med RPMI 1640 (med L-glutamin) med 2% B27 plus insulintillägg och 2% FBS.
- Cell tvättlösning feller cellodling
- Använd Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) utan kalcium eller magnesium.
- Cell tvättlösning för flödescytometri
- Använd fosfatbuffrad saltlösning (PBS, utan kalcium eller magnesium) med 1% FBS. Förvara vid 4 ° C.
- Cellunderhålls lösning flödescytometri
- Använd Hanks balanserade saltlösning (HBSS; utan kalcium eller magnesium) med 5% FBS. Förvara vid 4 ° C.
- Fixering Lösningar för flödescytometri
- Använd Cytofix buffert som fixeringslösning för TNNI3 och IRX4 antikroppar.
- Använd 4% paraformaldehyd i 1x PBS (göra färsk) som fixeringslösning för TNNT2 och MLC2a antikroppar.
- Använd 70% metanol / 30% aceton som fixeringslösning för MLC2v antikropp.
- Lagra alla lösningar vid 4 ° C.
- Permeabilisering Lösningar för flödescytometri
- Använd Phosflow Perm Buffer III som permeabilization lösning feller TNNI3 och IRX4 antikroppar. Förvara i rumstemperatur (25 ° C).
- Använd 0,2% Triton X-100 i 1 x PBS som permeabilization lösning för TNNT2, MLC2v och MLC2a antikroppar. Förvara vid 4 ° C.
- Blocking Solution
- Använd 10% getserum i 1x PBS. Gör färsk och förvara vid 4 ° C fram till användning.
2. Plate Beläggning
- Långsamt tina en alikvot av hESC kvalificerad matrisen vid 4 ° C under 30 min, tillsätt till 25 ml kyld DMEM / F12 och blanda väl i steriliserat vävnadsodling huva omedelbart före beläggning 6-brunnars plattor.
- Lägg 1 ml per brunn i en 6-brunnsplatta under steriliserade vävnadskultur huv (en alikvot av hESC kvalificerade matrisen är tillräcklig för att belägga fyra 6-brunnsplattor).
- Tillåt hESC kvalificerad matris för att ställa till 30 min vid rumstemperatur under huven. Sug överskottet stamceller från mänskliga embryon kvalificerad matris och tillsätt 2 ml E8 media med ROCK-hämmare till varje brunn. Använd plattorna omedelbart, eller om desired, förvara vid 4 ° C omedelbart efter bordläggning i upp till 1 vecka och anta rumstemperatur i 30 minuter före användning.
3 Passaging och underhåll av diverse hPSCs i monolager kultur
- Behåll hPSCs i monolagerkultur i 6-brunnsplattor och utföra alla stegen under en steril vävnadsodling huva.
- Använd HPSC linjer som är väl etablerade (> P20) och uppvisar en homogen morfologi utan närvaro av celler med ett neuralt, epithelial- eller fibroblastliknande morfologi. Säker celler prolifererar kraftigt, och i genomsnitt passagen vart tre dagar vid 75% sammanflytning när ympades vid 0,75 x 10 6 per brunn.
- Passage hPSCs med dissociation till den enda cellnivå minst 5x före start av differentiering för att säkerställa maximal effektivitet differentiering. För passage hPSCs, aspirera E8 media och tvätta cellerna två gånger med 4 ml 1x DPBS (värmts upp till rumstemperatur). Tillsätt 1 ml cell detachningslösning (värmts upp till rumstemperatur) till varje brunn och lämnar väl orörd i 3-7 minuter, tills cellgränserna börjar round-up.
- Använd en bomulls-ansluten glaspipett med bulb att få bort celler och överför till en 15 ml koniskt rör innehållande 1 ml DMEM / F12 media (för att inaktivera cellen lossnar lösning).
- Ta bort 10 ul alikvot av celllösning och blanda med 10 pl trypanblått i ett mikrocentrifugrör. Räkna celler (t.ex. automatiserade eller manuella hemocytometer) medan resten av cellerna genom centrifugering vid 130 xg under 5 minuter vid rumstemperatur. Med hjälp av detta protokoll, förväntar 70-80% viabilitet med hjälp av en automatiserad hemocytometer och framåt, bas alla cell nummer på totala kroppar.
- Aspirera media och resuspendera cellpelleten i DMEM / F12 till en slutlig koncentration av 0,75 x 10 6 celler per 500 ^.
- Lägg 500 | il av cellsuspension till varje brunn i en 6-brunnars platta där varje well contains 2 ml E8 media med ROCK-hämmare, framställd i steg 2.3. Lämnar platta på bänkskivan, rör försiktigt i en front-to-back och sida-till-sida rörelse att likformigt fördela celler i hela väl. Återgå celler till inkubator vid 5% CO2, 37 ° C.
- Med början 24 timmar efter passage, byt media dagligen med 2 ml / brunn E8 utan ROCK-hämmare. Optimera seedning densitet för att uppnå 100% sammanflödet före start av differentiering. Seed 0.75 x 10 6 celler / brunn fyra dagar före start av differentiering, men optimera för varje cellinje som behövs.
4 cardiomyocyte Induktion av hPSCs genom selektiv modulering av Wnt Pathway
- Uppdatera media (2 ml / brunn) dagligen under dagarna 0-7, och varannan dag efter dag 8.
- På dag 0, börjar differentieringsprocess genom att ersätta E8 media med differentiering media # 1. Tillsätt 1,2 l Chir (6 ^ M slutlig) till varje brunn. Upprepa dag 1.
- På dagarna 2-3, ersätt med färsk differenfinfördelning på djupet media # 1.
- På dag 4, ersätt med färsk differentiering media # 1. Tillsätt 1 l IWR-1 (5 ^ M slutlig) till varje brunn. Upprepa på dag 5.
- På dag 6-7, ersätt med färsk differentiering media # 1.
- På dag 8, ersätt med färsk differentiering media # 2.
- Fortsätt att ersätta med differentiering media # 2 varannan dag för önskad tid för kultur.
- Om så önskas, passage cardiomyocytes som använder cellen lossnar lösningen efter stegen i 3,3-3,6, men ersätta media med differentiering media # 2. Under passage, dissociera kardiomyocyter i små kluster av ~ 3-10 celler. Seed på ~ 6 x 10 5 celler per brunn med hjälp hESC kvalificerade matris belagda brunnar och differentiering media # 2.
5. Insamling av celler för flödescytometri
- Utför alla återstående aspekter av stegen 5-9 på laboratoriebänken (dvs inte steril).
- Sug tillväxtmedium och tvätta cellerna två gånger med 1x PBS.Tillsätt 1 ml cell lossnar lösningen (värmts upp till rumstemperatur) till varje brunn och låt ostört i 3-7 minuter, tills cellgränserna börjar round-up. Använd en bomulls-ansluten borosilikatglas disponibel 9 "pipett med lampan för att få bort celler och överför till en 15 ml koniskt rör på is.
- Under resten av protokollet, underhålla celler på is och utföra centrifuge vid 200 xg under 5 minuter vid 4 ° C.
- Samla cellerna genom centrifugering och aspirera lösningen. Resuspendera cellerna i 10 ml celltvättlösning med hjälp av en 10 ml serologisk pipett med upprepad rivning för att säkerställa cellklumpar fördelas i enskilda celler. Räkna celler som i steg 3,5, medan återstoden av cellerna uppsamlades genom centrifugering.
- Resuspendera cellerna i celltvättlösning noga med att helt dela upp cellpellet och delprov 1 x 10 6 celler per rund botten rör. Samla cellerna genom centrifugering och aspirera lösningen.
6. Fixering ochPermeabilisering av celler för intracellulära antigen färgning
- Lägg 100 | il fixeringslösning till cellpelleten. Lägg lösningen droppvis med kontinuerlig varsam skakning och sedan ställa på is i 15 min.
- Lägg 3 ml celltvättlösningen. Samla cellerna genom centrifugering och aspirera lösningen.
- Tillsätt 100 pl permeabilization lösning på cellpellet. Lägg lösningen droppvis med kontinuerlig varsam vortexa sedan ställa på is i 30 min. Använd fixering och permeabilisering betingelser såsom beskrivs för varje antikropp i tabell 1.
- Lägg 3 ml celltvättlösningen. Samla cellerna genom centrifugering och aspirera lösningen. Upprepa för totalt två tvättar efter permeabilization.
| Primary Antibody (klon) | Immunogen / epitop som känns igen | Istotype Kontroll | Mängd primär antikropp per 1 x 10 6 celler i 100 | il | Fixering Lösning | Permeabilization Lösning | Sekundär antikropp | Mängd sekundär antikropp / 1 x 10 6 celler i 100 | il | |
| För procent positiva mätningar | För Antigen Kvantifiering | |||||||
| TNNI3 (284 (19C7) | ISASRKLQL (människa) | Mus IgG2b | 1,0 | ig | 3,0 | ig | BD Cytofix | BD Phosflow perm III | Get-anti-mus-IgG2b-Alexa488 | 600 ng |
| TNNT2 (1C11) | Full längd renat nativt humant troponin T-protein. | Mouse IgG1 | 1,0 | ig | 2,0 | ig | 4% PFAi 1% PBS | 0,2% Triton X-100 i 1% PBS | Get-anti-mus-lgG1 - Alexa 488 | 600 ng |
| MLC2v (330G5) | FDPEGKG | Mus IgG2a | 2,0 | ig | 3,0 | ig | 70% metanol / 30% aceton | 0,2% Triton X-100 i 1% PBS | Get-anti-mus-IgG2a - Alexa 647 | 600 ng |
| MLC2a (4E7) | fullängds humant rekombinant protein av humant MYL7 producerat i E. coli | Mouse IgG1 | 0,5 | ig | 3,0 | ig | 4% PFA i 1% PBS | 0,2% Triton X-100 i 1% PBS | Get-anti-mus-lgG1 - Alexa 488 | 600 ng |
| IRX4 | LQEHRKNP YPTKGEKI MLAIITKM TLTQVST | Kanin IgG | 0,5 | ig | 0,5 | ig | BD Cytofix | BD Phosflow perm III | Get-anti-raBBIT IgG-PE | 600 ng |
Tabell 1 Antikropp Koncentrationer. Noterade är den primära antikroppen, klon (om monoklonala), optimerade koncentrationer och fixering och permeabilisering villkor för varje primär och sekundär antikropp som används för flödescytometri analyser. Som antikropp stock koncentrationerna kan variera mellan leverantörer av samma klon, slutliga koncentrationer av varje antikropp per 1 x 10 6 celler i en fast analysvolym, snarare än utspädningar, tillhandahålls. Immunogenet används för att generera antikroppen, eller epitop igen av antikroppar, som tillhandahålls av tillverkaren, är noterat men var inte experimentellt verifierat här.
7 Antibody färgning
- För varje experiment inkluderar en ofärgade kontroll per fixering / permeabilization skick och lämplig isotypkontroll för varje primär antikropp används. Inkludera ej cardiomyocyte celltyper som negativa kontroller (t.ex. pluripotenta stamceller eller fibroblaster). Använd isotypkontroller vid samma koncentration som motsvarande primär antikropp (se tabell 1).
- Resuspendera cellerna i 100 l blockerande lösningen med en P200 pipett för att dela upp celler. Set prover på is i 25 minuter med försiktig skakning.
- Utan avlägsnande av blockeringslösning, tillsätt primära antikroppen eller isotypkontroll per riktlinjerna i Tabell 1. Inkubera 45 min på is med försiktig skakning.
- Lägg 3 ml celltvättlösningen. Samla cellerna genom centrifugering och aspirera lösningen. Upprepa för totalt två tvättar efter primär antikroppsmärkning.
- Om en fluorofor-konjugerad primär antikropp används, fortsätt till 8,1. När en icke-konjugerad primär antikropp används (till exempel för alla markörer som beskrivs här), utföra märkning med sekundär antikropp som är konjugerad till en fluorofor enligt följande.
- Resuspendera cellerna i 100 l blockerande lösning med hjälp av en P200 pipett till disaggregate celler.
- Lägg sekundär antikropp per riktlinjerna i Tabell 1. Inkubera 30 min på is med försiktig skakning.
- Lägg 3 ml celltvättlösningen. Samla cellerna genom centrifugering och aspirera lösningen. Upprepa för totalt två tvättar efter sekundär märkning antikropp.
8 Beredning av celler för flödescytometri
- Resuspendera cellerna i 400 l cellunderhållslösning med en P1000 pipett för att dela upp celler.
- Förbered en cell sil mössa på en rund botten rör genom förvätning med 50 ^ cellunderhållslösning. Ställ röret på is. Använd cell sil lock för att förhindra cellaggregat täpper flödescytometern.
- Överför cellösning till cell sil lock och låt cellsuspensionen rinna av tyngdkraften. Knacka botten av röret försiktigt på bänk som nödvändigt så att cellerna uppsamlas i röret och ställs tillbaka på is så snabbt som möjligt. Skölj sil med 250 pl underhåll så cellenlution för att säkerställa maximal återvinning av celler.
- Behåll celler på is och skydda den mot ljus tills analyseras med flödescytometri.
9. flödescytometrianalys
Detaljerade förvärvsinställningar varierar mellan instrumenten. Grundläggande parametrar att tänka på för insamling optimal uppgifter beskrivs nedan.
- För optimal ström stabilitet, se till att munstycket storleken överskrider 5-6x diametern på cellen som analyseras.
OBS: Det kan variera mellan instrumenten, men är en viktig faktor för både testare och välja lämplig munstycke för cellsortering. Den genomsnittliga diametern på dagen 10 hjärtmuskelceller är 11 m (varierar 8-14 mikrometer); således, en standard 150 ^ m provinjektion röret på en analysator fungerar bra. - Omedelbart före dataanalys, till vortex varje rör ögonblick för att sprida cellaggregat.
- Optimera framåt och sidospridning spänningsinställningar för varje celltyp baserat påofärgade kontroll för varje fixering / permeabilization villkor som används i försöket så att populationerna av intresse är på skalan och centrerad (Figur 2A).
- Bibehåll dessa inställningar under ett enda experiment och vara konsekvent från experiment till experiment på samma instrument, som betydande förskjutningar kan indikera potentiella problem med flödescytometern eller provberedning.
- För varje fluorofor, analysera isotypkontroll och justera lämplig laserspänning för att bestämma den minimistyrka som krävs för att få en fluorescens histogram som visar både vänster och höger kanter toppen. Behåll laser inställningar för varje isotypkontroll vid förvärv uppgifter om motsvarande antikroppsfärgade prover.
NOTERA: Signal glida ofta sker med tiden på samma instrument. Det är viktigt att justera laser inställningar i början av varje försök grundar sig på lämplig isotypkontroll. - Samla minst10.000 evenemang. 50.000 händelser är att föredra.
- För statistiska analyser, till gate levande cellpopulationen utesluta skräp (Figur 2A). Bestäm procent positiva celler inom gated befolkningen utifrån markörplacering som gör ≤2% bidrag isotypkontroll, som visas i figur 2B, C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
På dag 0, celler är 100% sammanflytande med kompakt morfologi och minimal cellrester. På dagarna 1-2, är det vanligt att observera betydande celldöd (40-50%), men bifogade celler behåller kompakt morfologi (Figur 1A). Under denna tid, är media orange och grumlig. Pink medier tyder driven celldöd, och i detta fall, bekräfta med trypanblått och avbryta om celldöd överstiger 70%. Celler kommer återhämta sig under dagarna 3-4 och densiteten ökar. Under dagarna 5-6, inträffar minimal celldöd och täta fläckar kan börja visas. Genom dagarna 7-8, är ett sammanhängande monoskikt uppnås med kompakt morfologi varvas med täta fläckar. Celler börjar spontant upphandlande dag 8 och de första värkarna kommer ofta att synas i de täta fläckar. Vid dag 10, är mer robust kontraktion observerats och kommer att fortsätta att spridas över hela kulturen i efterföljande dagar. Immunocytokemi färgning för α-aktinin och TNNT2 show sarcomere struktur(Figur 1A). Mätt med kvantitativ realtid polymeraskedjereaktion (QRT-PCR), mRNA-nivåer av referensmarkörer mesoderm och cardiomyogenic display engagemang tidsprofiler som väntat (Figur 1B), med robust uttryck av hjärtmarkörer homeobox protein Nkx-2.5 (Nkx2.5 ), TNNI3, MLC2a, MLC2v, och myosin-6 (MYH6). Mycket låg till icke-detekterbara nivåer av glatt muskulatur (myosin tung kedja 11, MYH11) och skelettmuskler (myogenin, MYOG) markörer är rutin. I överensstämmelse med tidig utveckling där uttryck observeras i både hjärta och skelettmuskel innan de begränsas till skelettmuskulaturen i den vuxna 20,27,28, troponin isoformer TNNI1 och TNNI2 är robust upptäcks under dagarna 7-8.
I linje med andra rapporter, genererar denna in vitro differentiering strategi cardiomyocytes med egenskaper tidiga hjärt stamceller (rundad morfologi, samuttryck av MLC2a, MLC2v) 19 30,32. I flödescytometri, kommer ljusspridningen profilerna varierar mellan celltyper och förändras avsevärt bland fixering / permeabilization förhållanden (Figur 2A). Under dessa olika beredningscell förhållanden, flödescytometri analys visar isotypkontroller med enstaka toppar med en tydlig distinktion mellan isotypkontroll och antikropp (Figur 2B). Pluripotenta celler eller andra icke-cardiomyocyte celler är negativa för de markörer som används här.
Genom att använda denna differentiering och färgningsprotokollet, är den resulterande cellpopulationen vanligen 99% TNNI3, 96% IRX4 +, 91% MLC2v +, och 96% MLC2a + dag 10 av differentiering mätt med flödescytometri. 99% TNNT2 + celler observeras (fig 2C, 2D), men såsom beskrivits ovan, inte är unik TNNT2till kardiomyocyter under utveckling och därmed påståendet att cellerna är 99% autentiska hjärtmuskelceller efter dag 10 är baserad på TNNI3 protein. Det noteras att med fortsatt odling utanför dag 10, kommer proteinnivåer av strukturella proteiner fortsatt höga även om relativa genuttryck nivåer kommer att minska i förhållande till topp uttryck som övervakas av QRT-PCR, i linje med proteinstabilitet och omsättningshastigheter på 3,2 och 3,5 dagar, respektive för TNNI och TNNT 33. Ett exempel på denna observation visas för TNNT2 (topp mRNA-uttryck vid dag 11 (Figur 1B), robusta proteinnivåer vid dag 20 + (Figur 2E).
Figur 1 Övergripande schema över cardiomyocyte differentiering från hPSCs och representativa uppgifter. (A) Schematisk bild av cardiomyocyte differentiatio n-protokollet kommenterad med motsvarande skede av härstamning och / eller cell öde engagemang. Representativa fas kontrastrika bilder av celler vid större stadier av differentieringsprocessen. Scale bar = 10 | im. Längst till höger = immunocytokemi bild av α-actinin (grön) överdragen med TNNT2 (röd) och kärnor (blå). (B) QRT-PCR-analys (för sonduppsättningen, se tabellen Materials) på 18 referens mesoderm och hjärtutvecklingsmarkörer under de första 17 dagarna av differentiering. All data är i genomsnitt tre biologiska replikat vardera analyseras i tre exemplar, där felstaplar representerar standardfel av medelvärdet, och normaliseras till aktin (ACTB). Meddelandenivåer för alla tidpunkter är i förhållande till den första dagen av differentiering där Ct-värdena är detekterbara (dvs Ct <35). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 Karaktärisering av hjärtmuskelceller efter flödescytometri och elektrofysiologi. (A) ljusspridning profiler dag 10 hiPSC-härledda kardiomyocyter under olika fixering och permeabilisering förhållanden. 50.000 evenemang togs och gated befolkningen (dvs. exklusive skräp) som används för statistiska analyser visas i rött. (B) Histogram av IRX4 på dag 10 av differentiering med hjälp av tre olika fixering / permeabilization förhållanden, som illustrerar skillnader i färgning effektivitet bland metoderna. Inläggningar skillnad med färgning av IRX4 på hiPSCs använder varje tillstånd. Dessa data visar varför metanol / aceton undviks för IRX4 grund av låga, men detekterbara, färgning på hiPSCs. (C) Histogram av TNNI3, TNNT2, MLC2v, MLC2a på dag 10 av differenti ation med användning av optimerade färgnings villkor för maximal procent positiva celler som beskrivs i tabell 1. (D) Histogram av TNNT2 från antikroppstiter experiment illustrerar att 0,5 | ag är den minsta mängd som krävs för att mäta 99% TNNT2 + celler, men att 2 pg är mättnadspunkten krävs för kvantifiering. Endast en enda isotypkontroll visas, men titreringsexperiment beräknas utifrån jämförelse av varje antikropp till dess motsvarande titrering av isotypkontroll. (E) Kvantifiering av TNNT2 protein på kardiomyocyter på dagarna 0-24 av differentiering, representerade som medianfluorescensintensiteten skillnad mellan antikropp och isotyp-kontroll för varje tidpunkt. (F) Action potential registrerades från en enda spontant contracting kammarliknande cardiomyocyte på dag 46 av differentiering med användning av helcell-aktuell konfiguration klämman av patch clamp-tekniken.es / ftp_upload / 52010 / 52010fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Accutase cell detachment solution | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | 53817 | |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | |
| Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor | R&D Systems | 1254 | |
| L-Ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261-10G | |
| Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) | Invitria | 777TRF029 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | R&D Systems | 4144-TC-01M | |
| Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) | Peprotech | 100-21 | |
| DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| CHIR-99021 HCl | Sellekchem | S2924 | |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Life Technologies | 11875-093 | |
| B-27 Supplement Minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B-27 Supplement (with Insulin) | Life Technologies | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| Flow Cytometry Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (10x) | Quality Biological Inc. | 119-069-151 | |
| Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14175-095 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Phosflow perm buffer III | BD Biosciences | 558050 | |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28906 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 179957-4L | |
| Acetone | Mallenckrodt Chemicals | 2440-16 | |
| Triton X-100 | Amresco | M236-10ML | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Materials | |||
| 5 ml Round bottom polystyrene tube (without cap) | Corning | 352008 | For preparation of cells for flow cytometry |
| 5 ml Round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) | Corning | 352235 | For preparation of cells for flow cytometry |
| 2 ml rubber bulbs | Fischer Scientific | 03-448-24 | |
| 9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets | BioExpress | P-2904-2 | |
| 0.65 ml Microcentrifuge tubes, graduated, green | GeneMate | C-3259-G | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes, graduated, red | GeneMate | C-3260-R | |
| TC20 automated cell counter | BioRad | 145-0102 | |
| Counting slides for TC20 | BioRad | 145-0011 | |
| 6-well Flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
| 20 ml Syringes | BD Plastipak | 300613 | For filter sterilization of aliquots |
| Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone | VWR | 28145-501 | For filter sterilization of aliquots |
| 250 ml Filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding | Corning | 431096 | For filter sterilization of bulk media |
| 500 ml filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding | Corning | 431097 | For filter sterilization of bulk media |
| Antibodies and Isotype Controls | |||
| Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) | Abcam | ab19615 | Primary antibody |
| Anti-TNNT2 (clone: 1C11) | Thermo Scientific | MA1-16687 | Primary antibody |
| Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) | Synaptic Systems | 310111 | Primary antibody |
| Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) | Abcam | AB131661 | Primary antibody |
| Anti-IRX4 | Bioss | BS-9464R | Primary antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1 | Life Technologies | A21121 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a | Life Technologies | A21241 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b | Life Technologies | A21141 | Secondary antibody |
| Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG | R&D Systems | F0110 | Secondary antibody |
| Mouse IgG1 | BD Biosciences | 557273 | Isotype Control |
| Mouse IgG2a | eBiosciences | 16-4724-81 | Isotype Control |
| Rabbit IgG-PE | R&D Systems | IC105P | Isotype Control |
| TaqMan Probesets for qRT-PCR | |||
| ACTB | Life Technologies | Hs01060665 | |
| Brachyury T | Life Technologies | Hs00610080 | |
| CASQ2 | Life Technologies | Hs00154286 | |
| IRX4 | Life Technologies | Hs01100809 | |
| ISL1 | Life Technologies | Hs00158126 | |
| MESP1 | Life Technologies | Hs01001283 | |
| MYH11 (SMMHC) | Life Technologies | Hs00224610 | |
| MYH6 | Life Technologies | Hs01101425 | |
| MYL2 (MLC2v) | Life Technologies | Hs00166405 | |
| MYL7 (MLC2a) | Life Technologies | Hs01085598 | |
| MYOG | Life Technologies | Hs01072232 | |
| NKX2.5 | Life Technologies | Hs00231763 | |
| NPPA | Life Technologies | Hs01081097 | |
| POU5F1 | Life Technologies | Hs04260367 | |
| SOX17 | Life Technologies | HS00751752 | |
| TNNI1 | Life Technologies | Hs00913333 | |
| TNNI2 | Life Technologies | Hs00268536 | |
| TNNI3 | Life Technologies | HS00165957 | |
| TNNT2 | Life Technologies | Hs00165960 | |
References
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E1848-E1857 (2012).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8, 162-175 (2013).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8, 228-240 (2011).
- Willems, E., et al. Small-molecule inhibitors of the Wnt pathway potently promote cardiomyocytes from human embryonic stem cell-derived mesoderm. Circ Res. 109, 360-364 (2011).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
- Elliott, D. A., et al. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods. 8, 1037-1040 (2011).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
- Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Res. 21, 579-587 (2011).
- Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, e23657 (2011).
- Hudson, J., Titmarsh, D., Hidalgo, A., Wolvetang, E., Cooper-White, J. Primitive Cardiac Cells from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells Dev. 21, 1513-1523 (2011).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111, 1125-1136 (2012).
- Ban, K., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons that target cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128, 1897-1909 (2013).
- Toyota, N., Shimada, Y. Differentiation of troponin in cardiac and skeletal muscles in chicken embryos as studied by immunofluorescence microscopy. J Cell Biol. 91, 497-504 (1981).
- Saggin, L., Gorza, L., Ausoni, S., Schiaffino, S. Cardiac troponin T in developing, regenerating and denervated rat skeletal muscle. Development. 110, 547-554 (1990).
- Kajioka, S., et al. Endogenous cardiac troponin T modulates Ca(2+)-mediated smooth muscle contraction. Sci Rep. 2, 979 (2012).
- Franco, D., et al. Myosin light chain 2a and 2v identifies the embryonic outflow tract myocardium in the developing rodent heart. Anat Rec. 254, 135-146 (1999).
- Franco, D., Lamers, W. H., Moorman, A. F. Patterns of expression in the developing myocardium: towards a morphologically integrated transcriptional model. Cardiovasc Res. 38, 25-53 (1998).
- Poon, E., et al. Transcriptome-guided functional analyses reveal novel biological properties and regulatory hierarchy of human embryonic stem cell-derived ventricular cardiomyocytes crucial for maturation. PLoS One. 8, e77784 (2013).
- Lieu, D. K., et al. Absence of transverse tubules contributes to non-uniform Ca(2+) wavefronts in mouse and human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 18, 1493-1500 (2009).
- Cao, F., et al. Transcriptional and functional profiling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. PLoS One. 3, e3474 (2008).
- Satin, J., et al. Calcium handling in human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 26, 1961-1972 (2008).
- Itzhaki, I., et al. Calcium handling in human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. PLoS One. 6, e18037 (2011).
- Bodor, G. S., Porterfield, D., Voss, E. M., Smith, S., Apple, F. S. Cardiac troponin-I is not expressed in fetal and healthy or diseased adult human skeletal muscle tissue. Clin Chem. 41, 1710-1715 (1995).
- Hunkeler, N. M., Kullman, J., Murphy, A. M. Troponin I isoform expression in human heart. Circ Res. 69, 1409-1414 (1991).
- Bhavsar, P. K., et al. Developmental expression of troponin I isoforms in fetal human heart. FEBS Lett. 292, 5-8 (1991).
- Christoffels, V. M., Keijser, A. G., Houweling, A. C., Clout, D. E., Moorman, A. F. Patterning the embryonic heart: identification of five mouse Iroquois homeobox genes in the developing heart. Dev Biol. 224, 263-274 (2000).
- Bruneau, B. G., et al. Cardiac expression of the ventricle-specific homeobox gene Irx4 is modulated by Nkx2-5 and dHand. Dev Biol. 217, 266-277 (2000).
- Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283, 1161-1164 (1999).
- Nelson, D. O., Jin, D., Downs, K., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Dev Dyn. 243, 381-392 (2013).
- Martin, A. F. Turnover of cardiac troponin subunits. Kinetic evidence for a precursor pool of troponin-I. J Biol Chem. 256, 964-968 (1981).
- Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22, 1991-2002 (2013).
- Farrell, H. M., et al. Nomenclature of the proteins of cows" milk--sixth revision. Journal of dairy science. 87, 1641-1674 (2004).
- Micusan, V. V., Borduas, A. G.
- Lyons, G. E. In situ analysis of the cardiac muscle gene program during embryogenesis. Trends Cardiovasc Med. 4, 70-77 (1994).
- Nakagawa, O., Nakagawa, M., Richardson, J. A., Olson, E. N., Srivastava, D. H. R. T. 1 HRT2, and HRT3: a new subclass of bHLH transcription factors marking specific cardiac, somitic, and pharyngeal arch segments. Dev Biol. 216, 72-84 (1999).
- Xin, M., et al. Essential roles of the bHLH transcription factor Hrt2 in repression of atrial gene expression and maintenance of postnatal cardiac function. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7975-7980 (2007).
- Davis, L. M., Rodefeld, M. E., Green, K., Beyer, E. C., Saffitz, J. E. Gap junction protein phenotypes of the human heart and conduction system. J Cardiovasc Electrophysiol. 6, 813-822 (1995).
- Minamisawa, S., et al. Atrial chamber-specific expression of sarcolipin is regulated during development and hypertrophic remodeling. J Biol Chem. 278, 9570-9575 (2003).
- Larsen, T. H. Atrial natriuretic factor in the heart of the human embryo. Acta Anat (Basel. 138, 132-136 (1990).
- Claycomb, W. C. Atrial-natriuretic-factor mRNA is developmentally regulated in heart ventricles and actively expressed in cultured ventricular cardiac muscle cells of rat and human). Biochem J. 255, 617-620 (1988).
- Franco, D., et al. Divergent expression of delayed rectifier K(+) channel subunits during mouse heart development. Cardiovasc Res. 52, 65-75 (2001).
- Hoogaars, W. M., et al. The transcriptional repressor Tbx3 delineates the developing central conduction system of the heart. Cardiovasc Res. 62, 489-499 (2004).
- Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol Cell Biol. 15, 3813-3822 (1995).
- Srivastava, D., Cserjesi, P., Olson, E. N. A subclass of bHLH proteins required for cardiac morphogenesis. Science. 270, 1995-1999 (1995).
- Firulli, A. B., McFadden, D. G., Lin, Q., Srivastava, D., Olson, E. N. Heart and extra-embryonic mesodermal defects in mouse embryos lacking the bHLH transcription factor Hand1. Nat Genet. 18, 266-270 (1998).
- Calejo, A. I., et al. Differences in the expression pattern of HCN isoforms among mammalian tissues: sources and implications. Mol Biol Rep. 41, 297-307 (2013).
- Stevens, S. M., Pu, W. T. HCN4 charges up the first heart field. Circ Res. 113, 350-351 (2013).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nat Cell Biol. 15, 1098-1106 (2013).
- Davis, R. P., vanden Berg, C. W., Casini, S., Braam, S. R., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell models of cardiac disease and their implication for drug discovery and development. Trends Mol Med. 17, 475-484 (2011).
- Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. , 107-2733 (2003).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
- Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 1011-1018 (2011).
- Samal, R., et al. OMICS-based exploration of the molecular phenotype of resident cardiac progenitor cells from adult murine heart. J Proteomics. 75, 5304-5315 (2012).
- Van Hoof, D., et al. Identification of cell surface proteins for antibody-based selection of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. J Proteome Res. 9, 1610-1618 (2010).
- Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics Clin Appl. 2, 892-903 (2008).
- Gundry, R. L., Burridge, P. W., Boheler, K. R. Pluripotent Stem Cell Heterogeneity and the Evolving Role of Proteomic Technologies in Stem Cell Biology. Proteomics. 11, 3947-3961 (2011).
- Gundry, R. L., et al. A Cell Surfaceome Map for Immunophenotyping and Sorting Pluripotent Stem Cells. Mol Cell Proteomics. , 303-316 (2012).
- Bryder, D., Rossi, D. J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cells: the paradigmatic tissue-specific stem cell. Am J Pathol. 169, 338-346 (2006).
- Kondo, M., et al. Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application. Annu Rev Immunol. 21, 759-806 (2003).
- Shizuru, J. A., Negrin, R. S., Weissman, I. L. Hematopoietic stem and progenitor cells: clinical and preclinical regeneration of the hematolymphoid system. Annu Rev Med. 56, 509-538 (2005).
- Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112, 3543-3553 (2008).
- Boheler, K. R., Bhattacharya, S., Chuppa, S., Riordon, D. R., Kropp, E., Burridge, P. W., Wu, J. C., Wersto, R. P., Wollscheid Rao,, Gundry, B., L, R. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals New Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Reports. , 185-203 (2014).
