Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

التمايز كفاءة عالية من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان لالعضلية وتوصيف بواسطة التدفق الخلوي

Published: September 23, 2014 doi: 10.3791/52010
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 3, 2, 4,5, 1,6
1Department of Biochemistry, Medical College of Wisconsin, 2Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 3Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, Hong Kong University, 5Division of Cardiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Cardiovascular Research Center, Biotechnology and Bioengineering Center, Medical College of Wisconsin
* These authors contributed equally

Summary

توضح هذه المقالة منهجية مفصلة للتمييز كفاءة الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان في العضلية عن طريق تحوير انتقائي مسار WNT، تليها تحليل التدفق الخلوي من علامات مرجعية لتقييم تجانس وهوية السكان.

Abstract

هناك حاجة ملحة لوضع نهج للإصلاح القلب التالفة، واكتشاف العقاقير العلاجية الجديدة التي ليس لها آثار سامة على القلب، وتحسين استراتيجيات لنموذج بدقة أمراض القلب. لا تزال إمكانية استغلال الإنسان الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSC) التكنولوجيا لتوليد عضلة القلب "في طبق" لهذه التطبيقات لتوليد حماسة عالية. في السنوات الأخيرة، والقدرة على توليد خلايا بكفاءة cardiomyogenic من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) قد تحسنت كثيرا، وتقدم لنا فرصا جديدة لنموذج المراحل المبكرة جدا من التنمية البشرية القلب لا يمكن الوصول إليها على خلاف ذلك. على النقيض من العديد من الطرق السابقة، وصفت بروتوكول التمايز cardiomyocyte هنا لا يتطلب تجميع خلية أو إضافة Activin A أو BMP4 ويولد بقوة الثقافات من الخلايا التي هي ايجابية للغاية لتروبونين القلب الأول وT (TNNI3، TNNT2)، iroquois- بروتين الدرجة homeodomainIRX-4 (IRX4)، ميوسين التنظيمية سلسلة ضوء 2، شكل الإسوي البطين / عضلة القلب (MLC2v) والميوسين التنظيمية سلسلة ضوء 2، شكل الإسوي الأذيني (MLC2a) بعد يوم 10 في جميع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESC) وخطوط hiPSC اختبار ل التاريخ. خلايا يمكن passaged ويحتفظ به لأكثر من 90 يوما في الثقافة. استراتيجية بسيطة من الناحية الفنية لتنفيذ وفعالة من حيث التكلفة. توصيف العضلية المستمدة من الخلايا المحفزة غالبا ما تتضمن تحليل علامات مرجعية، سواء على مستوى مرنا والبروتين. لتحليل البروتين، والتدفق الخلوي هو أداة تحليلية قوية لتقييم نوعية الخلايا في الثقافة وتحديد الفئات السكانية التجانس. ومع ذلك، والتباين الفني في إعداد العينات يمكن أن تؤثر بشكل كبير نوعية التدفق الخلوي البيانات. وبالتالي، يجب توحيد بروتوكولات تلطيخ تسهيل المقارنات بين استراتيجيات التمايز المختلفة. وفقا لذلك، بروتوكولات تلطيخ الأمثل لتحليل IRX4، MLC2v، MLC2a، TNNI3، وTNNT2 التدفق الخلوي موصوفة.

Introduction

توليد العضلية من hPSCs، بما في ذلك HESC وhiPSC، يمكن أن تعمل لتكون نموذجا في المختبر من العمليات التنموية القلب الإنسان في وقت مبكر جدا، وتوفير نظرة ثاقبة مراحل لا يمكن الوصول إليها إلا للدراسات الميكانيكية. ويوفر هذا النظام نموذجا فرصا فريدة لدراسة المسارات الجزيئية التي تتحكم في التزام النسب القلب ومواصفات مصير الخلية. في السنوات الأخيرة، والقدرة على توليد خلايا cardiomyogenic بكفاءة من hPSCs قد تحسنت كثيرا 1-15. ومع ذلك، من بين البروتوكولات هناك خط الخلية الاختلاف فيما يتعلق الكفاءة في توليد خلايا cardiomyogenic والتوقيت في الخلايا التي تبدي علامات غرفة محددة (على سبيل المثال، البطين والأذين). من الناحية المثالية، للتطبيقات المستقبلية لهذا النظام النموذجي، والمطلوب السكان أكثر تجانسا من خلايا محددة وظيفيا. على النقيض من الطرق السابقة، وصفت بروتوكول التمايز cardiomyocyte هنا لا يتطلب متجميع ليرة لبنانية أو إضافة Activin A أو العظام تخلقية بروتين 4 (BMP4) وبقوة يولد الثقافات إيجابية للغاية لTNNI3، TNNT2، IRX4، MLC2v، وMLC2a بعد يوم 10 خلايا في جميع HESC وhiPSC خطوط اختبار حتى الآن. استراتيجية بسيطة من الناحية الفنية لتنفيذ، لا سيما بالمقارنة مع الثقافات ثلاثية الأبعاد، الثقافة الجماهيرية، أو استراتيجيات الجسم مضغي الشكل مقرها 4-9، وحددت مؤخرا في الدراسة أن يصف جزيء صغير مع سمية انتقائية لhPSCs (Boheler وآخرون. ) 65. ميزات هذا البروتوكول تشمل تمايز hPSCs في الثقافة أحادي الطبقة باستخدام طبقة واحدة من HESC مصفوفة المؤهلة (Matrigel)، ووسائل الإعلام تعرف تماما باستخدام جزيئات صغيرة لتعدل إشارات WNT (مماثلة، متميزة بعد من 1،2،7،13)، و التدفق الأمثل الخلوي أساليب تلطيخ لتقييم كفاءة التمايز والهوية الخلية. باختصار، مزايا هذا البروتوكول مقارنة تتضمن التقارير السابقة، فعاليه التكاليفeness، استنساخ، والكفاءة العالية لتوليد العضلية بين خطوط hPSC متعددة، بما في ذلك HESC وhiPSC خطوط.

التدفق الخلوي هو أداة تحليلية قوية لتقييم نوعية الخلايا في الثقافة وتحديد الفئات السكانية التجانس، ومع التصميم التجريبي المناسب، ويمكن أن توفر القياسات الكمية. كما هو الحال مع جميع الاستراتيجيات المعتمدة على الأجسام المضادة، وتفسير دقيق للنتائج التجريبية يتطلب أن عناصر التصميم بما في ذلك فحص تركيز الأجسام المضادة وتثبيت والظروف permeabilization (عند استهداف مستضدات الخلايا) يتم اختبارها بعناية لكل الأجسام المضادة كشروط دون المستوى الأمثل تؤثر تأثيرا كبيرا على فعالية الأجسام المضادة ملزمة، وبالتالي، وتفسير النتائج. الأهم من ذلك، إذا كان مطلوبا الكميات، والأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضرورية، كما يمكن التعرف على الأجسام المضادة الحواتم متعددة وعرضة لاختلاف دفعة إلى دفعة. حاليا، ومجموعة متنوعة من الأجسام المضادة (أ ف بوقد وصفت lyclonal وحيدة النسيلة) وتلطيخ بروتوكولات لتقييم التمايز في المختبر، مما يجعل من الصعب مقارنة كفاءة cardiomyogenesis بين بروتوكولات 1،2،9،11. لهذا السبب، وتستخدم الأجسام المضادة وحيدة النسيلة عندما تكون متاحة لجميع يحلل تدفق الخلوي. للمضي قدما، فمن المتوقع أن توحيد هذه البروتوكولات تلطيخ، وخاصة فيما يتعلق الكميات، يجب أن تسمح أفضل مقارنة بين استراتيجيات التمايز.

اختيار علامات، والأجسام المضادة يناظرها، وتستخدم لتقييم نقاء في المختبر cardiomyogenesis يختلف بين التقارير. وقد اعتبر TNNT2 مؤشرا على خلايا ملتزمة مصير cardiomyogenic ويستخدم بشكل روتيني لتقييم كفاءة بروتوكولات التمايز القلب. ومع ذلك، أعرب TNNT2 أيضا في العضلات والهيكل العظمي خلال فرخ الجرذ والتنمية في وقت مبكر 16،17 وكان موجودا في العضلات الملساء الإنسان 18 في المختبر. تستخدم MLC2v وMLC2a بشكل روتيني كعلامات بديلة البطيني والأذيني فرعية، على التوالي. ومع ذلك، مع الاعتماد على التحديات MLC2v وMLC2a لتحديد النوع الفرعي cardiomyocyte في سياق التمايز في المختبر تنشأ من حقيقة أن هذه المنتجات الجين قد لا يقتصر على غرفة محددة في جميع أنحاء التطوير القلب، من القلب عن طريق أنبوب الكبار. في القوارض يحلق القلب، MLC2a مرنا هو السائد في الأذيني / تدفق منطقة القناة وMLC2v مرنا غير السائد في المناطق المسالك البطين / تدفق. في قلب يحلق، ويلاحظ وشارك في التعبير عن MLC2a وMLC2v من mRNAs في الجهاز تدفق، القناة الأذينية البطينية، والمسالك تدفق 19،20. قبل 3 أيام بعد الولادة، ويقتصر MLC2v مرنا إلى البطين و10 يوما بعد الولادة، ويقتصر MLC2a إلى الأذينين في القلب الفئران حديثي الولادة 19. وبالتالي، تفسيرالبيانات المتعلقة الكفاءة cardiomyogenesis وهوية النوع الفرعي يجب أن لا تنظر فقط وجود وكمية من مستويات علامة مرجعية، ولكن يجب النظر في مرحلة التطوير (ق) التي تكون timepoints التمايز التي تتوافق تحليلها. هذا مهم خصوصا أن مرحلة نضوج خلايا cardiomyogenic التي تولدها في المختبر تمايز hPSCs الأكثر شبها تلك الجنينية الإنمائي / الجنين 21-25. وهكذا، والاعتماد على التعبير علامة في المكاني في قلب ما بعد الولادة قد لا يكون مناسبا لتقييم hPSC الخلايا المشتقة، على الأقل في بعض الحالات.

في محاولة لتسهيل وضع معايير أكثر تحديدا لتحديد هوية cardiomyocyte في المختبر، ويعتبر TNNI3 أن تكون علامة قيمة لتقييم cardiomyogenesis في المختبر كما هو يقتصر على عضلة القلب طوال مرحلة التطور الجنيني في الفرخ والزرد 15،20وتغيب في الإنسان العضلات الهيكلية الجنين 26. بينما TNNI1 موجود في قلب الجنين البشري، TNNI3 هو الوحيد الحاضر في شكل الإسوي TNNI الكبار العادي القلب 27،28. وفيما يتعلق cardiomyocyte هوية النوع الفرعي، IRX4 29-31 هو علامة بالمعلومات الخلايا مع مصير البطين. على مستوى البروتين، تم مؤخرا أظهرت IRX4 أن يقتصر على البطين من أنبوب القلب الخطي من خلال مراحل الولدان في الماوس 32. وفقا لذلك، يتم وصف البروتوكولات تلطيخ الأمثل لتحليل TNNI3 وIRX4 بواسطة التدفق الخلوي. على حد علمنا، هذا هو الوصف الأول من طريقة لكفاءة تلطيخ القائم على الأجسام المضادة وتحليل مستويات IRX4 العضلية في الإنسان من خلال التدفق الخلوي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الحل وإعداد وسائل الإعلام

  1. HESC مصفوفة المؤهلين طلاء محلول المخزون
    1. ذوبان الجليد ببطء HESC مصفوفة المؤهلة (5 مل) على الجليد في 4 درجة مئوية خلال الليل. الاستغناء مأخوذة إلى ما قبل المبردة، 1.5 مل العقيمة أنابيب microcentrifuge وتخزينها مباشرة في -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: تختلف حجم قسامة استنادا الكثير وعادة ما يتراوح 270-350 ميكرولتر. توفر الشركة المصنعة التفاصيل بشأن حجم قسامة المطلوبة لتحقيق تركيز 1X على التخفيف إلى 25 مل كما هو موضح في الخطوة 2.1.
  2. hPSC وسائل الإعلام حلول المالية
    1. استخدام الماء عالى النقاء بأنه مخفف ما لم يذكر خلاف ذلك. تعقيم جميع المكونات باستخدام مرشح 0.22 ميكرون. تخزين التالية كحلول الأكبر في 4 درجة مئوية: بيكربونات الصوديوم (75 ملغ / مل). حامض الستريك (10 ملي، ودرجة الحموضة = 3).
    2. تعقيم جميع المكونات باستخدام 0.2 ميكرون تصفية المحاقن وتخزين كل ما aliquots في -20 درجة مئوية: كيناز رو (ROCK) المانع Y-27632 (10ملي في DPBS، 100 ميكرولتر قسامة). حمض الاسكوربيك L-2-الفوسفات (64 ملغ / مل، قسامة 500 ميكرولتر). زيلونيت الصوديوم (70 ميكروغرام / مل، و 100 ميكرولتر قسامة). ترانسفيرين (50 ملغ / مل، 107 ميكرولتر قسامة). عامل نمو الخلايا الليفية (2 FGF2، 200 نانوغرام / ميكرولتر في DPBS، 250 ميكرولتر قسامة). تحويل عامل النمو بيتا 1 (TGFβ1، 100 نانوغرام / ميكرولتر في البارد 10 ملم حمض الستريك، 10 ميكرولتر قسامة).
  3. hPSC الإعلام E8 الحل التركيب
    1. إعداد الوسائط باستخدام مأخوذة أعدت في الخطوة 1.2: DMEM / F12 (مع L-الجلوتامين وHEPES، 500 مل)، بيكربونات الصوديوم (3.62 مل، المباراة النهائية: 543 ميكروغرام / مل)، وحمض الأسكوربيك L-2-الفوسفات (500 ميكرولتر، نهائي : 64 ميكروغرام / مل)، زيلونيت الصوديوم (100 ميكرولتر. النهائي: 140 نانوغرام / مل)، ترانسفيرين (107 ميكرولتر. النهائي: 10.7 ميكروغرام / مل)، الأنسولين (1 مل، المباراة النهائية: 20 ميكروغرام / مل)، FGF2 (250 ميكرولتر. النهائي: 100 نانوغرام / مل)، TGFβ1 (10 ميكرولتر. النهائي: 2 نانوغرام / مل).
    2. الجمع بين جميع المكونات، فلتر تعقيم وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
  4. hPSC الإعلام E8 مع ROCK المانع
    1. إضافة 15 ميكرولتر ROCK المانع إلى 12 مل من وسائل الإعلام E8 أعدت على النحو الوارد أعلاه وتخلط جيدا. ضمان تركيز النهائي هو 10 ميكرومتر بعد إضافة خلايا / وسائل الإعلام في الخطوة 3.7.
  5. حلول المخزون من WNT المغيرون
    1. تخزين التالية مأخوذة في -20 درجة مئوية. CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5​-methyl-1 H -imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethy​l]amino]-3-pyridinecarbonitrile; 10 ملم في DMSO، 15 ميكرولتر قسامة). IWR-1 (4- (1،3،3a، 4،7،7a-Hexahydro-1،3-dioxo-4،7-methano-2H-isoindol-2-YL) -N-8-quinolinyl بينزاميد. 10 ملم في DMSO، 6 ميكرولتر قسامة).
  6. التمايز وسائل الإعلام
    1. تعد وسائل الإعلام التمايز # 1 مع RPMI 1640 (مع L-الجلوتامين) مع 2٪ B27 ناقص الأنسولين الملحق.
    2. تعد وسائل الإعلام التمايز رقم 2 مع RPMI 1640 (مع L-الجلوتامين) مع 2٪ B27 بالإضافة إلى الأنسولين ملحق و 2٪ FBS.
  7. خلية محلول الغسيل وأو خلية ثقافة
    1. استخدام الفوسفات مخزنة المالحة Dulbecco ل(DPBS)، دون الكالسيوم أو المغنيسيوم.
  8. خلية محلول الغسيل لالتدفق الخلوي
    1. استخدام الفوسفات مخزنة المالحة (PBS دون الكالسيوم أو المغنيسيوم) مع 1٪ FBS. تخزين عند 4 درجة مئوية.
  9. الحل صيانة للخلية التدفق الخلوي
    1. استخدام محلول الملح هانك المتوازن (HBSS، وبدون الكالسيوم أو المغنيسيوم) مع 5٪ FBS. تخزين عند 4 درجة مئوية.
  10. حلول لتثبيت التدفق الخلوي
    1. استخدام عازلة Cytofix كحل لتثبيت TNNI3 وIRX4 الأجسام المضادة.
    2. استخدام بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني 1X (جعل الطازجة) كحل لتثبيت TNNT2 وMLC2a الأجسام المضادة.
    3. استخدام الميثانول 70٪ / 30٪ الأسيتون كحل لتثبيت MLC2v الأجسام المضادة.
    4. تخزين كل الحلول عند 4 درجة مئوية.
  11. حلول Permeabilization عن التدفق الخلوي
    1. استخدام Phosflow بيرم العازلة الثالث كما permeabilization حل وأو TNNI3 وIRX4 الأجسام المضادة. تخزين في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية).
    2. استخدام 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 1X كحل permeabilization عن الأجسام المضادة TNNT2، MLC2v، وMLC2a. تخزين عند 4 درجة مئوية.
  12. عرقلة الحل
    1. استخدام 10٪ مصل الماعز في 1X PBS. جعل الطازجة وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.

طلاء 2. بلايت

  1. ذوبان الجليد ببطء 1 قسامة من HESC مصفوفة المؤهلة في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، إضافة إلى 25 مل من المبرد DMEM / F12 وتخلط جيدا تعقيم الأنسجة في غطاء الثقافة مباشرة قبل طلاء لوحات 6 جيدا.
  2. إضافة 1 مل لكل بئر من لوحة 6 جيدا تعقيمها تحت غطاء زراعة الأنسجة (1 قسامة من HESC مصفوفة مؤهلة كافية لأربعة معطف 6 لوحات جيدا).
  3. تسمح HESC مصفوفة المؤهلة لتعيين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت غطاء محرك السيارة. نضح الزائدة HESC مصفوفة المؤهلة وإضافة 2 مل من وسائل الإعلام E8 مع ROCK المانع إلى كل بئر. استخدام لوحات فورا، أو إذا قصرIRED، مخزن في 4 درجات مئوية على الفور بعد الطلاء لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع وتتوازن إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.

3. الركض وصيانة مشوه hPSCs في أحادي الطبقة الثقافة

  1. الحفاظ على hPSCs في الثقافة أحادي الطبقة في 6 لوحات جيدا وأداء جميع خطوات تحت غطاء نسيج الثقافة العقيمة.
  2. استخدام خطوط hPSC التي يتم راسخة (> P20) ومعرض مورفولوجيا متجانسة من دون وجود الخلايا العصبية مع والصرف epithelial- أو تشبه الخلايا الليفية. ضمان تكاثر الخلايا بقوة، وعلى المتوسط، مرور كل ثلاثة أيام عند 75٪ عند التقاء المصنف عند 0.75 × 10 6 لكل بئر.
  3. hPSCs مع مرور التفكك إلى مستوى خلية واحدة على الأقل قبل 5X لبدء التمايز لضمان أقصى قدر من الكفاءة التمايز. لhPSCs مرور، ووسائل الإعلام نضح E8 وغسل خلايا مرتين مع 4 مل من 1X DPBS (تسخينه مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة). إضافة 1 مل من فصل الخليةمنة الحل (تسخينه مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة) إلى كل بئر وترك دون عائق جيدا لمدة 3-7 دقائق، حتى تبدأ حدود الخلية لجولة المتابعة.
  4. استخدام الزجاج ماصة القطن توصيله مع لمبة لإزاحة الخلايا ونقل إلى 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي على 1 مل من DMEM سائل الإعلام / F12 (لتعطيل الحل مفرزة الخلية).
  5. إزالة قسامة 10 ميكرولتر من محلول الخلية والاختلاط مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق في أنبوب microcentrifuge. عد الخلايا (على سبيل المثال الآلي أو اليدوي عدادة الكريات)، في حين تبقى من خلايا يتم تجميعها بواسطة الطرد المركزي في 130 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. باستخدام هذا البروتوكول، ونتوقع بقاء 70-80٪ باستخدام عدادة الكريات الآلي والذهاب إلى الأمام، قاعدة كل خلية في أرقام إجمالي عدد الخلايا.
  6. وسائل الاعلام نضح و resuspend بيليه خلية في DMEM / F12 إلى تركيز النهائي من 0.75 × 10 6 خلايا في 500 ميكرولتر.
  7. إضافة 500 ميكرولتر من خلية إلى تعليق كل بئر من لوحة 6 جيدا حيث كل CONTAI جيدانانوثانية 2 مل سائل الإعلام E8 مع ROCK المانع، أعدت في الخطوة 2.3. ترك لوحة على سطح العمل، نقل بلطف في الخلايا الأمامية إلى الوراء والحركة جنبا إلى جنب لتفريق بشكل موحد في جميع أنحاء البئر. العودة الخلايا الحاضنة في CO 2، 37 درجة مئوية 5٪.
  8. بدءا من 24 ساعة بعد الركض، استبدال وسائل الإعلام يوميا باستخدام 2 مل / جيد E8 دون ROCK المانع. تحسين كثافة البذر لتحقيق 100٪ التقاء مسبق لبدء التمايز. البذور 0.75 × 10 6 خلايا / جيد أربعة أيام قبل بدء التمايز، ولكن تحسين لكل خط الخلية حسب الحاجة.

4. Cardiomyocyte تحريض hPSCs بواسطة انتقائية التحوير من WNT المسار

  1. تحديث وسائل الإعلام (2 مل / جيد) يوميا خلال أيام 0-7، وكل يوم بعد يوم 8.
  2. في اليوم 0، تبدأ عملية التمايز عن طريق استبدال E8 سائل الإعلام مع وسائل الإعلام التمايز # 1. إضافة 1.2 ميكرولتر CHIR (6 ميكرومتر النهائي) إلى كل بئر. تكرار في اليوم 1.
  3. في أيام 2-3، مع استبدال مختلفا جديدةوسائل الإعلام tiation # 1.
  4. في يوم 4، مع استبدال التمايز الطازجة وسائل الإعلام # 1. إضافة 1 ميكرولتر IWR-1 (5 ميكرومتر النهائي) إلى كل بئر. تكرار في يوم 5.
  5. في أيام 6-7، مع استبدال التمايز الطازجة وسائل الإعلام # 1.
  6. في يوم 8، مع استبدال التمايز الطازجة وسائل الإعلام # 2.
  7. تواصل مع وسائل الإعلام ليحل محل التفاضل رقم 2 كل يوم عن الوقت المطلوب من الثقافة.
  8. إذا رغبت، العضلية مرور باستخدام الحل مفرزة الخلية التالية الخطوات الموضحة في 3،3-3،6، لكن استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام التمايز # 2. أثناء الركض، فصل العضلية في مجموعات صغيرة من ~ 3-10 الخلايا. البذور في ~ 6 × 10 5 خلايا لكل بئر باستخدام مصفوفة HESC المؤهلة الآبار المغلفة وسائل الإعلام التمايز 2 #.

5. مجموعة من الخلايا للالتدفق الخلوي

  1. أداء جميع الجوانب المتبقية من الخطوات 5-9 على مقاعد البدلاء المختبر (أي ليس عقيمة).
  2. وسائط النمو نضح وغسل خلايا مرتين مع 1X PBS.إضافة 1 مل من محلول مفرزة الخلية (تسخينه مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة) إلى كل بئر وترك دون عائق لمدة 3-7 دقيقة، حتى تبدأ حدود الخلية لجولة المتابعة. استخدام البورسليكات الزجاج توصيل القطن القابل للتصرف 9 "ماصة مع لمبة لإزاحة الخلايا ونقل إلى 15 مل أنبوب مخروطي على الجليد.
  3. طوال ما تبقى من البروتوكول، والحفاظ على الخلايا على الجليد وتنفيذ centrifugations في 200 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية.
  4. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي وحل نضح. وفرقت الخلايا resuspend في 10 مل من محلول غسل الخلايا باستخدام 10 مل ماصة المصلية مع سحن المتكرر لضمان كتل الخلية إلى خلايا مفردة. عدد الخلايا كما في الخطوة 3.5 في حين تبقى من خلايا يتم تجميعها بواسطة الطرد المركزي.
  5. Resuspend الخلايا في خلية حل مع الحرص على غسل بتفصيل تماما بيليه الخلايا وقسامة 1 × 10 6 خلايا في أنبوب جولة القاع. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي وحل نضح.

6. تثبيت وPermeabilization من الخلايا بين الخلايا للمستضد تلطيخ

  1. إضافة 100 ميكرولتر حل لتثبيت بيليه الخلية. إضافة محلول قطرة من الحكمة مع vortexing لطيف المستمر ثم قم بتعيين على الجليد لمدة 15 دقيقة.
  2. إضافة 3 مل من محلول غسل الخلية. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي وحل نضح.
  3. إضافة 100 ميكرولتر حل permeabilization لبيليه الخلية. إضافة محلول قطرة من الحكمة مع vortexing لطيف المستمر ثم تعيين على الجليد لمدة 30 دقيقة. تثبيت واستخدام permeabilization الظروف على النحو المبين لكل الأجسام المضادة في الجدول 1.
  4. إضافة 3 مل من محلول غسل الخلية. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي وحل نضح. تكرار لما مجموعه اثنين يغسل بعد permeabilization.
الأجسام المضادة الأولية (استنساخ) مستمنع / حاتمة المعترف بها تحكم Istotype كمية الأجسام المضادة الأولية لكل 1 × 10 6 خلايا في 100 ميكرولتر تثبيت الحل Permeabilization الحل الأجسام المضادة الثانوية كمية من الأجسام المضادة الثانوية / 1 × 10 6 خلايا في 100 ميكرولتر
لقياسات إيجابية في المئة ل Antigen الكميات
TNNI3 (284 (19C7) ISASRKLQL (الإنسان) الماوس و IgG2b 1.0 ميكروغرام 3.0 ميكروغرام BD Cytofix BD Phosflow بيرم الثالث الماعز المضادة للماوس و IgG2b-Alexa488 600 نانوغرام
TNNT2 (1C11) كامل طول النقي تروبونين البشري الأصلي T البروتين. الفأر IgG1 1.0 ميكروغرام 2.0 ميكروغرام 4٪ PFA1٪ في برنامج تلفزيوني 0.2٪ تريتون X-100 1٪ في برنامج تلفزيوني الماعز المضادة للماوس IgG1 - اليكسا 488 600 نانوغرام
MLC2v (330G5) FDPEGKG الماوس IgG2a 2.0 ميكروغرام 3.0 ميكروغرام 70٪ الميثانول / 30٪ الأسيتون 0.2٪ تريتون X-100 1٪ في برنامج تلفزيوني الماعز مكافحة الفأر IgG2a - اليكسا 647 600 نانوغرام
MLC2a (4E7) كامل طول البروتين البشري المؤتلف من MYL7 البشرية المنتجة في E. القولونية الفأر IgG1 0.5 ميكروغرام 3.0 ميكروغرام 4٪ PFA 1٪ في برنامج تلفزيوني 0.2٪ تريتون X-100 1٪ في برنامج تلفزيوني الماعز المضادة للماوس IgG1 - اليكسا 488 600 نانوغرام
IRX4 LQEHRKNP
YPTKGEKI
MLAIITKM
TLTQVST 		أرنب مفتش 0.5 ميكروغرام 0.5 ميكروغرام BD Cytofix BD Phosflow بيرم الثالث الماعز المضادة للراbbit مفتش-PE 600 نانوغرام

الجدول 1. تركيزات الأجسام المضادة. مدرج في القائمة هي الأجسام المضادة الأولية، استنساخ (إذا حيدة النسيلة)، وتركيزات الأمثل وتثبيت والظروف permeabilization لكل الأجسام المضادة الأولية والثانوية المستخدمة لتحليل تدفق الخلوي. كما تركيزات الأسهم الأجسام المضادة يمكن أن تختلف بين الباعة من نفس استنساخ،، وتقدم تركيزات النهائي من كل الأجسام المضادة لكل 1 × 10 6 خلايا في حجم فحص ثابت، بدلا من التخفيفات. ومستمنع استخدامها لتوليد الأجسام المضادة، أو حاتمة معترف بها من قبل الأجسام المضادة، على النحو المنصوص عليه من قبل الشركة المصنعة، يتم سرد ولكن لم يتم التحقق تجريبيا هنا.

7. تلوين الأجسام المضادة

  1. لكل تجربة، وتشمل السيطرة غير ملوثين واحد لكل تثبيت / permeabilization حالة وisotype السيطرة المناسبة لكل الأجسام المضادة الأولية المستخدمة. تشمل أنواع الخلايا غير cardiomyocyte والضوابط السلبية (على سبيل المثال، الخلايا الجذعية المحفزة أو الخلايا الليفية). استخدام عناصر التحكم في نمط إسوي نفس التركيز والمقابلة الأجسام المضادة الأولية (انظر الجدول 1).
  2. خلايا resuspend في 100 ميكرولتر عرقلة الحل باستخدام ماصة P200 لتفصيل الخلايا. مجموعة عينات على الجليد لمدة 25 دقيقة مع هزاز لطيف.
  3. دون إزالة عرقلة الحل، إضافة الأجسام المضادة الأولية أو isotype السيطرة في المبادئ التوجيهية في الجدول 1. احتضان 45 دقيقة على الجليد مع هزاز لطيف.
  4. إضافة 3 مل من محلول غسل الخلية. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي وحل نضح. تكرار لما مجموعه اثنين يغسل بعد وضع العلامات الأجسام المضادة الأولية.
  5. إذا تم استخدام الأجسام المضادة الأولية-fluorophore مترافق، والمضي قدما إلى 8.1. عندما يتم استخدام الأجسام المضادة الأولية اللامقترن (مثل لجميع علامات الموصوفة هنا)، نفذ وضع العلامات مع الأجسام المضادة الثانوية التي مترافق إلى fluorophore على النحو التالي.
  6. خلايا resuspend في 100 ميكرولتر عرقلة الحل باستخدام ماصة P200 لديساخلايا ggregate.
  7. إضافة الأجسام المضادة الثانوية في المبادئ التوجيهية في الجدول 1. احتضان 30 دقيقة على الجليد مع هزاز لطيف.
  8. إضافة 3 مل من محلول غسل الخلية. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي وحل نضح. تكرار لما مجموعه اثنين يغسل بعد وضع العلامات الضد الثانوية.

8. إعداد الخلايا للالتدفق الخلوي

  1. خلايا resuspend في 400 ميكرولتر حل صيانة الخلايا باستخدام ماصة P1000 لتفصيل الخلايا.
  2. إعداد غطاء مصفاة الخلية في أنبوب أسفل المستديرة قبل التبول مع 50 ميكرولتر حل صيانة الخلية. وضع أنبوب على الجليد. تستخدم غطاء مصفاة الخلية لمنع المجاميع خلية من انسداد تدفق عداد الكريات.
  3. نقل الحل خلية إلى الخلية غطاء مصفاة والسماح تعليق خلية لاستنزاف بفعل الجاذبية. الاستفادة من أنبوب أسفل بلطف على أعلى مقاعد البدلاء حسب الضرورة بحيث يتم جمع الخلايا في الأنبوب ووضع مرة أخرى على الجليد في أسرع وقت ممكن. مصفاة شطف مع 250 ميكرولتر صيانة الخلية بحيثlution لضمان الانتعاش القصوى من الخلايا.
  4. الحفاظ على الخلايا على الجليد وبعيدا عن الضوء حتى تحليل التدفق الخلوي.

9. تحليل التدفق الخلوي

سوف تختلف إعدادات اكتساب مفصلة بين الصكوك. يتم وصف الثوابت الأساسية للنظر في جمع البيانات الأمثل أدناه.

  1. لأمثل تيار الاستقرار، وضمان أن حجم فوهة يتجاوز 5-6x قطر الخلية التي يجري تحليلها.
    ملاحظة: هذا قد تختلف بين الصكوك ولكن اعتبار مهم سواء بالنسبة للتحليل واختيار الحجم المناسب لفوهة الفرز الخلية. متوسط ​​قطر يوم 10 العضلية هو 11 ميكرون (تتراوح 8-14 ميكرون). وبالتالي، معيار 150 ميكرون حقن عينة أنبوب على محلل يعمل بشكل جيد.
  2. مباشرة قبل تحليل البيانات، دوامة كل أنبوب لفترة وجيزة لتفريق المجاميع الخلية.
  3. تحسين إعدادات إلى الأمام والجانب مبعثر الجهد لكل نوع من الخلايا تعتمد علىالسيطرة غير ملوثين لكل حالة تثبيت / permeabilization المستخدمة في التجربة مثل أن السكان هم من الفائدة على نطاق وتتركز (الشكل 2A).
    1. الحفاظ على هذه الإعدادات في جميع أنحاء تجربة واحدة وتكون متسقة من تجربة إلى تجربة على نفس الصك، وتحولات كبيرة قد يشير إلى مشاكل محتملة مع تدفق عداد الكريات أو إعداد العينات.
  4. لكل fluorophore، وتحليل isotype السيطرة وضبط الجهد الليزر المناسب لتحديد الحد الأدنى للكثافة المطلوبة للحصول على الرسم البياني مضان التي تعرض حواف كل من اليسار واليمين الذروة. الحفاظ على إعدادات ليزر لكل isotype السيطرة عند الحصول على البيانات على عينات ملطخة الأجسام المضادة المقابلة.
    ملاحظة: إشارة الانجراف غالبا ما يحدث مع مرور الوقت على نفس الصك. فمن الأهمية بمكان لضبط إعدادات الليزر في بداية كل تجربة على أساس isotype السيطرة المناسبة.
  5. جمع ما لا يقل عن10،000 الأحداث. ويفضل 50،000 الأحداث.
  6. عن التحليلات الإحصائية، بوابة السكان الخلايا الحية لاستبعاد الحطام (الشكل 2A). تحديد خلايا إيجابية في المئة بين السكان بوابات تقوم على وضع علامة الذي يسمح مساهمة ≤2٪ من isotype السيطرة، كما هو مبين في الشكل 2B، C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في اليوم 0، والخلايا هي 100٪ متموجة مع التشكل المدمجة والحد الأدنى من الحطام الخلية. في أيام 1-2، ومن الشائع أن نلاحظ موت الخلايا كبير (40-50٪)، ولكن سوف تحتفظ مورفولوجيا الخلايا المرفقة المضغوط (الشكل 1A). خلال هذا الوقت، وسائل الاعلام هو البرتقال وعكر. وسائل الإعلام وردي يشير موت الخلايا المفرط، وفي هذه الحالة، تأكيد مع الأزرق التريبان والتوقف إذا تجاوز موت الخلايا 70٪. خلايا سيتعافى خلال أيام 3-4 وسيزيد كثافة. خلال أيام 5-6، يحدث الحد الأدنى من موت الخلايا وبقع كثيفة قد تبدأ في الظهور. قبل أيام 7-8، ويتحقق أحادي الطبقة متموجة مع التشكل المدمجة تتخللها بقع كثيفة. تبدأ خلايا التعاقد بشكل عفوي بعد يوم 8 وسوف تقلصات الأولى غالبا ما تكون مرئية في البقع الكثيفة. بعد يوم 10، لوحظ تقلص أكثر قوة وستواصل منتشرة في جميع أنحاء الثقافة في أيام لاحقة. تلطيخ مناعية لα-actinin وTNNT2 هيكل المعرض قسيم عضلي(الشكل 1A). مقاسا الكمي في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR-QRT)، ومستويات مرنا من علامات مرجعية من الأديم المتوسط ​​وعرض التزام cardiomyogenic ملامح الزمنية كما هو متوقع (الشكل 1B)، مع التعبير القوي من القلب البروتين علامات Homeobox Nkx 2.5 (NKX2.5 )، TNNI3، MLC2a، MLC2v، وميوسين-6 (MYH6). منخفض جدا إلى مستويات غير قابلة للكشف من العضلات الملساء (الميوسين السلسلة الثقيلة 11، MYH11) والعضلات والهيكل العظمي (myogenin، MYOG) علامات هي روتينية. وتمشيا مع التنمية في وقت مبكر حيث لوحظ التعبير في كل من عضلة القلب والهيكل العظمي قبل أن تقتصر على الهيكل العظمي والعضلات في البالغين 20،27،28، تروبونين الإسوية يتم الكشف TNNI1 وTNNI2 بقوة خلال أيام 7-8.

بما يتفق مع تقارير أخرى، وهذا في المختبر استراتيجية التمايز يولد العضلية مع خصائص الأسلاف القلب في وقت مبكر (مورفولوجيا مستدير، وشارك في التعبير عن MLC2a، MLC2v) 19 30،32. في التدفق الخلوي، فإن ملامح مبعثر الخفيفة تختلف بين أنواع الخلايا وتغيير كبير بين تثبيت / شروط permeabilization (الشكل 2A). في ظل هذه الظروف إعداد الخلايا المختلفة، تحليل التدفق الخلوي يكشف الضوابط نمط إسوي مع قمم واحدة مع تمييز واضح بين isotype السيطرة والأضداد (الشكل 2B). الخلايا المحفزة أو خلايا غير cardiomyocyte الأخرى سلبية للعلامات المستخدمة هنا.

استخدام هذا التمايز وتلطيخ البروتوكول، السكان خلية الناتج هو عادة 99٪ TNNI3، 96٪ IRX4 +، 91٪ MLC2v +، و 96٪ MLC2a + بعد يوم 10 من التمايز وقياس التدفق الخلوي. ويلاحظ 99٪ TNNT2 + الخلايا (أرقام 2C، 2D)، ولكن كما هو موضح أعلاه، TNNT2 ليست وحيدةلالعضلية أثناء التطور، وبالتالي التأكيد على أن الخلايا العضلية 99٪ أصيلة من يوم 10 ويستند على البروتين TNNI3. تجدر الإشارة إلى أنه مع استمرار زراعة وراء يوم 10، ومستويات البروتين من البروتينات الهيكلية ستبقى مرتفعة على الرغم من أن مستويات التعبير الجيني النسبي سيقلل نسبة إلى ذروة التعبير كما رصدتها QRT-PCR، بما يتفق مع استقرار البروتين ومعدلات دوران 3.2 و 3.5 أيام، على التوالي، لTNNI وTNNT 33. ويرد مثال على هذه الملاحظة لTNNT2 (ذروة التعبير مرنا في يوم 11 (الشكل 1B)، ومستويات البروتين قوية في يوم 20+ (الشكل 2E).

الشكل 1
الرقم 1. التخطيطي الإجمالي للتمايز cardiomyocyte من hPSCs وبيانات تمثيلية. (A) رسم تخطيطي للcardiomyocyte التمايز ن بروتوكول المشروح مع مرحلة المقابلة من النسب و / أو التزام مصير الخلية. الصور النقيض من المرحلة تمثيلية من الخلايا في مراحل الرئيسية لعملية التمايز. شريط النطاق = 10 ميكرومتر. اليمين المتطرف = صورة مناعية من α-actinin (الخضراء) مضافين مع TNNT2 (أحمر) ونوى (الازرق). (B) تحليل QRT-PCR (لمجموعة التحقيق، انظر الجدول المواد) 18 الأديم المتوسط ​​المرجعية وعلامات القلب خلال تطوير ال 17 يوما الأولى من التمايز. جميع البيانات بمعدل ثلاثة مكررات البيولوجية كل تحليلها في ثلاث نسخ، حيث تمثل أشرطة الخطأ الخطأ المعياري للمتوسط، ويتم تطبيع مع الأكتين (ACTB). رسالة لجميع مستويات نقاط زمنية قريبة إلى اليوم الأول من التمايز حيث القيم ط يتم كشفها (أي ط م <35). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ر "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" دائما "> الشكل 2
الشكل 2. توصيف العضلية التدفق الخلوي والكهربية. (A) لمحات مبعثر ضوء النهار 10 العضلية hiPSC المستمدة من تحت مختلف الظروف permeabilization تثبيت و. تم جمع 50،000 الأحداث ويظهر السكان (أي باستثناء الحطام) بوابات المستخدمة في التحليلات الإحصائية باللون الأحمر. (B) المدرج الإحصائي من IRX4 في يوم 10 من التمايز باستخدام ثلاثة شروط تثبيت / permeabilization مختلفة، توضح الاختلافات في تلطيخ الكفاءة بين الأساليب. تظهر إدراجات الاختلافات في تلطيخ IRX4 على hiPSCs باستخدام كل شرط. وتوضح هذه البيانات لماذا يتم تجنب الميثانول / الأسيتون لIRX4 بسبب انخفاض، ولكن يمكن كشفها، وتلطيخ على hiPSCs. (C) المدرج الإحصائي من TNNI3، TNNT2، MLC2v، MLC2a في يوم 10 من differenti أوجه استخدام الظروف تلطيخ الأمثل للخلايا إيجابية في المئة كحد أقصى بالتفصيل في الجدول 1. (D) المدرج الإحصائي من TNNT2 من التجارب الأجسام المضادة المعايرة، موضحا أن 0.5 ميكروغرام هو الحد الأدنى المطلوب لقياس 99٪ TNNT2 + الخلايا، ولكن أن 2 ميكروغرام هو نقطة التشبع الكميات المطلوبة ل. فقط يظهر على isotype السيطرة احدة، ولكن تحسب على أساس التجارب المعايرة مقارنة كل الأجسام المضادة لالمعايرة المقابلة لها من isotype السيطرة. (E) الكميات من البروتين TNNT2 على العضلية في أيام 0-24 من التمايز، ممثلة بالفرق كثافة مضان متوسط بين الأجسام المضادة وisotype السيطرة على كل نقطة زمنية. (F) إمكانية العمل المسجلة من التعاقد بشكل عفوي مثل البطين cardiomyocyte واحد في يوم 46 من التمايز باستخدام خلية كاملة التكوين المشبك الحالي للتقنية المشبك التصحيح.ES / ftp_upload / 52010 / 52010fig2highres.jpg "الهدف =" _ على بياض "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Accutase cell detachment solution Stem Cell Technologies 7920
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) Sigma Aldrich D2650
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 53817
Citric acid Sigma Aldrich C2404-100G
Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor R&D Systems 1254
L-Ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma Aldrich A8960-5G
Sodium selenite Sigma Aldrich S5261-10G
Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) Invitria 777TRF029
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) R&D Systems 4144-TC-01M
Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) Peprotech 100-21
DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES Life Technologies 11330-032
Insulin Sigma Aldrich I9278-5ML
CHIR-99021 HCl Sellekchem S2924
IWR-1 Sigma Aldrich I0161
RPMI 1640 with L-Glutamine Life Technologies 11875-093
B-27 Supplement Minus Insulin Life Technologies A1895601
B-27 Supplement (with Insulin) Life Technologies 17504-044
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
Flow Cytometry Reagents
Phosphate buffered saline (10x) Quality Biological Inc. 119-069-151
Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ Life Technologies 14175-095
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Phosflow perm buffer III BD Biosciences 558050
16% Paraformaldehyde Thermo Scientific 28906
Methanol Sigma Aldrich 179957-4L
Acetone Mallenckrodt Chemicals  2440-16
Triton X-100 Amresco M236-10ML
Goat serum Life Technologies 16210-064
Trypan blue solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
Materials
5 ml Round bottom polystyrene tube (without cap) Corning 352008 For preparation of cells for flow cytometry
5 ml Round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) Corning 352235 For preparation of cells for flow cytometry
2 ml rubber bulbs Fischer Scientific 03-448-24
9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets BioExpress P-2904-2
0.65 ml Microcentrifuge tubes, graduated, green GeneMate C-3259-G
1.5 ml Microcentrifuge tubes, graduated, red GeneMate C-3260-R
TC20 automated cell counter BioRad 145-0102
Counting slides for TC20 BioRad 145-0011
6-well Flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
20 ml Syringes BD Plastipak 300613 For filter sterilization of aliquots
Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone VWR 28145-501 For filter sterilization of aliquots
250 ml Filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding Corning 431096 For filter sterilization of bulk media 
500 ml filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding Corning 431097 For filter sterilization of bulk media
Antibodies and Isotype Controls
Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) Abcam ab19615 Primary antibody
Anti-TNNT2 (clone: 1C11) Thermo Scientific MA1-16687 Primary antibody
Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) Synaptic Systems 310111 Primary antibody
Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) Abcam AB131661 Primary antibody
Anti-IRX4   Bioss BS-9464R Primary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1  Life Technologies A21121 Secondary antibody
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a Life Technologies A21241 Secondary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b Life Technologies A21141 Secondary antibody
Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG R&D Systems F0110 Secondary antibody
Mouse IgG1 BD Biosciences 557273 Isotype Control
Mouse IgG2a eBiosciences 16-4724-81 Isotype Control
Rabbit IgG-PE R&D Systems IC105P Isotype Control
TaqMan Probesets for qRT-PCR
ACTB Life Technologies Hs01060665
Brachyury T Life Technologies Hs00610080
CASQ2 Life Technologies Hs00154286
IRX4 Life Technologies Hs01100809
ISL1 Life Technologies Hs00158126
MESP1 Life Technologies Hs01001283
MYH11 (SMMHC) Life Technologies Hs00224610
MYH6 Life Technologies Hs01101425
MYL2 (MLC2v) Life Technologies Hs00166405
MYL7 (MLC2a) Life Technologies Hs01085598
MYOG Life Technologies Hs01072232
NKX2.5 Life Technologies Hs00231763
NPPA Life Technologies Hs01081097
POU5F1 Life Technologies Hs04260367
SOX17 Life Technologies HS00751752
TNNI1 Life Technologies Hs00913333
TNNI2 Life Technologies Hs00268536
TNNI3 Life Technologies HS00165957
TNNT2 Life Technologies Hs00165960

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E1848-E1857 (2012).
  2. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8, 162-175 (2013).
  3. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  4. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
  5. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
  6. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8, 228-240 (2011).
  7. Willems, E., et al. Small-molecule inhibitors of the Wnt pathway potently promote cardiomyocytes from human embryonic stem cell-derived mesoderm. Circ Res. 109, 360-364 (2011).
  8. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
  9. Elliott, D. A., et al. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods. 8, 1037-1040 (2011).
  10. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  11. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Res. 21, 579-587 (2011).
  12. Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, e23657 (2011).
  13. Hudson, J., Titmarsh, D., Hidalgo, A., Wolvetang, E., Cooper-White, J. Primitive Cardiac Cells from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells Dev. 21, 1513-1523 (2011).
  14. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111, 1125-1136 (2012).
  15. Ban, K., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons that target cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128, 1897-1909 (2013).
  16. Toyota, N., Shimada, Y. Differentiation of troponin in cardiac and skeletal muscles in chicken embryos as studied by immunofluorescence microscopy. J Cell Biol. 91, 497-504 (1981).
  17. Saggin, L., Gorza, L., Ausoni, S., Schiaffino, S. Cardiac troponin T in developing, regenerating and denervated rat skeletal muscle. Development. 110, 547-554 (1990).
  18. Kajioka, S., et al. Endogenous cardiac troponin T modulates Ca(2+)-mediated smooth muscle contraction. Sci Rep. 2, 979 (2012).
  19. Franco, D., et al. Myosin light chain 2a and 2v identifies the embryonic outflow tract myocardium in the developing rodent heart. Anat Rec. 254, 135-146 (1999).
  20. Franco, D., Lamers, W. H., Moorman, A. F. Patterns of expression in the developing myocardium: towards a morphologically integrated transcriptional model. Cardiovasc Res. 38, 25-53 (1998).
  21. Poon, E., et al. Transcriptome-guided functional analyses reveal novel biological properties and regulatory hierarchy of human embryonic stem cell-derived ventricular cardiomyocytes crucial for maturation. PLoS One. 8, e77784 (2013).
  22. Lieu, D. K., et al. Absence of transverse tubules contributes to non-uniform Ca(2+) wavefronts in mouse and human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 18, 1493-1500 (2009).
  23. Cao, F., et al. Transcriptional and functional profiling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. PLoS One. 3, e3474 (2008).
  24. Satin, J., et al. Calcium handling in human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 26, 1961-1972 (2008).
  25. Itzhaki, I., et al. Calcium handling in human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. PLoS One. 6, e18037 (2011).
  26. Bodor, G. S., Porterfield, D., Voss, E. M., Smith, S., Apple, F. S. Cardiac troponin-I is not expressed in fetal and healthy or diseased adult human skeletal muscle tissue. Clin Chem. 41, 1710-1715 (1995).
  27. Hunkeler, N. M., Kullman, J., Murphy, A. M. Troponin I isoform expression in human heart. Circ Res. 69, 1409-1414 (1991).
  28. Bhavsar, P. K., et al. Developmental expression of troponin I isoforms in fetal human heart. FEBS Lett. 292, 5-8 (1991).
  29. Christoffels, V. M., Keijser, A. G., Houweling, A. C., Clout, D. E., Moorman, A. F. Patterning the embryonic heart: identification of five mouse Iroquois homeobox genes in the developing heart. Dev Biol. 224, 263-274 (2000).
  30. Bruneau, B. G., et al. Cardiac expression of the ventricle-specific homeobox gene Irx4 is modulated by Nkx2-5 and dHand. Dev Biol. 217, 266-277 (2000).
  31. Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283, 1161-1164 (1999).
  32. Nelson, D. O., Jin, D., Downs, K., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Dev Dyn. 243, 381-392 (2013).
  33. Martin, A. F. Turnover of cardiac troponin subunits. Kinetic evidence for a precursor pool of troponin-I. J Biol Chem. 256, 964-968 (1981).
  34. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22, 1991-2002 (2013).
  35. Farrell, H. M., et al. Nomenclature of the proteins of cows" milk--sixth revision. Journal of dairy science. 87, 1641-1674 (2004).
  36. Micusan, V. V., Borduas, A. G. Biological properties of goat immunoglobulins. G. Immunology. 32, 373-381 (1977).
  37. Lyons, G. E. In situ analysis of the cardiac muscle gene program during embryogenesis. Trends Cardiovasc Med. 4, 70-77 (1994).
  38. Nakagawa, O., Nakagawa, M., Richardson, J. A., Olson, E. N., Srivastava, D. H. R. T. 1 HRT2, and HRT3: a new subclass of bHLH transcription factors marking specific cardiac, somitic, and pharyngeal arch segments. Dev Biol. 216, 72-84 (1999).
  39. Xin, M., et al. Essential roles of the bHLH transcription factor Hrt2 in repression of atrial gene expression and maintenance of postnatal cardiac function. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7975-7980 (2007).
  40. Davis, L. M., Rodefeld, M. E., Green, K., Beyer, E. C., Saffitz, J. E. Gap junction protein phenotypes of the human heart and conduction system. J Cardiovasc Electrophysiol. 6, 813-822 (1995).
  41. Minamisawa, S., et al. Atrial chamber-specific expression of sarcolipin is regulated during development and hypertrophic remodeling. J Biol Chem. 278, 9570-9575 (2003).
  42. Larsen, T. H. Atrial natriuretic factor in the heart of the human embryo. Acta Anat (Basel. 138, 132-136 (1990).
  43. Claycomb, W. C. Atrial-natriuretic-factor mRNA is developmentally regulated in heart ventricles and actively expressed in cultured ventricular cardiac muscle cells of rat and human). Biochem J. 255, 617-620 (1988).
  44. Franco, D., et al. Divergent expression of delayed rectifier K(+) channel subunits during mouse heart development. Cardiovasc Res. 52, 65-75 (2001).
  45. Hoogaars, W. M., et al. The transcriptional repressor Tbx3 delineates the developing central conduction system of the heart. Cardiovasc Res. 62, 489-499 (2004).
  46. Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol Cell Biol. 15, 3813-3822 (1995).
  47. Srivastava, D., Cserjesi, P., Olson, E. N. A subclass of bHLH proteins required for cardiac morphogenesis. Science. 270, 1995-1999 (1995).
  48. Firulli, A. B., McFadden, D. G., Lin, Q., Srivastava, D., Olson, E. N. Heart and extra-embryonic mesodermal defects in mouse embryos lacking the bHLH transcription factor Hand1. Nat Genet. 18, 266-270 (1998).
  49. Calejo, A. I., et al. Differences in the expression pattern of HCN isoforms among mammalian tissues: sources and implications. Mol Biol Rep. 41, 297-307 (2013).
  50. Stevens, S. M., Pu, W. T. HCN4 charges up the first heart field. Circ Res. 113, 350-351 (2013).
  51. Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nat Cell Biol. 15, 1098-1106 (2013).
  52. Davis, R. P., vanden Berg, C. W., Casini, S., Braam, S. R., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell models of cardiac disease and their implication for drug discovery and development. Trends Mol Med. 17, 475-484 (2011).
  53. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. , 107-2733 (2003).
  54. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  55. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 1011-1018 (2011).
  56. Samal, R., et al. OMICS-based exploration of the molecular phenotype of resident cardiac progenitor cells from adult murine heart. J Proteomics. 75, 5304-5315 (2012).
  57. Van Hoof, D., et al. Identification of cell surface proteins for antibody-based selection of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. J Proteome Res. 9, 1610-1618 (2010).
  58. Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics Clin Appl. 2, 892-903 (2008).
  59. Gundry, R. L., Burridge, P. W., Boheler, K. R. Pluripotent Stem Cell Heterogeneity and the Evolving Role of Proteomic Technologies in Stem Cell Biology. Proteomics. 11, 3947-3961 (2011).
  60. Gundry, R. L., et al. A Cell Surfaceome Map for Immunophenotyping and Sorting Pluripotent Stem Cells. Mol Cell Proteomics. , 303-316 (2012).
  61. Bryder, D., Rossi, D. J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cells: the paradigmatic tissue-specific stem cell. Am J Pathol. 169, 338-346 (2006).
  62. Kondo, M., et al. Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application. Annu Rev Immunol. 21, 759-806 (2003).
  63. Shizuru, J. A., Negrin, R. S., Weissman, I. L. Hematopoietic stem and progenitor cells: clinical and preclinical regeneration of the hematolymphoid system. Annu Rev Med. 56, 509-538 (2005).
  64. Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112, 3543-3553 (2008).
  65. Boheler, K. R., Bhattacharya, S., Chuppa, S., Riordon, D. R., Kropp, E., Burridge, P. W., Wu, J. C., Wersto, R. P., Wollscheid Rao,, Gundry, B., L, R. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals New Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Reports. , 185-203 (2014).

Tags

علم الأحياء الخلوي، العدد 91، من صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة، وتدفق الخلوي، والتمايز الموجهة، cardiomyocyte، IRX4، TNNI3، TNNT2، MCL2v، MLC2a
التمايز كفاءة عالية من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان لالعضلية وتوصيف بواسطة التدفق الخلوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhattacharya, S., Burridge, P. W.,… More

Bhattacharya, S., Burridge, P. W., Kropp, E. M., Chuppa, S. L., Kwok, W. M., Wu, J. C., Boheler, K. R., Gundry, R. L. High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010, doi:10.3791/52010 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter