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Alta Eficiencia Diferenciación de células madre pluripotentes humanas a cardiomiocitos y Caracterización por citometría de flujo

Published: September 23, 2014 doi: 10.3791/52010
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 3, 2, 4,5, 1,6
1Department of Biochemistry, Medical College of Wisconsin, 2Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 3Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, Hong Kong University, 5Division of Cardiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Cardiovascular Research Center, Biotechnology and Bioengineering Center, Medical College of Wisconsin
* These authors contributed equally

Summary

El artículo describe la metodología detallada para diferenciar eficazmente células madre pluripotentes humanas en cardiomiocitos mediante la modulación de la vía Wnt selectivamente, seguido por citometría de flujo análisis de marcadores de referencia para evaluar la homogeneidad e identidad de la población.

Abstract

Hay una necesidad urgente de desarrollar enfoques para reparar el corazón dañado, el descubrimiento de nuevas drogas terapéuticas que no tienen efectos tóxicos sobre el corazón, y la mejora de las estrategias para modelar con precisión la enfermedad cardíaca. El potencial de la explotación de la tecnología humana inducida de células madre pluripotentes (hiPSC) para generar músculo cardiaco "en un plato" para estas aplicaciones sigue generando gran entusiasmo. En los últimos años, la capacidad de generar de manera eficiente las células cardiomiogénico partir de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) ha mejorado en gran medida, nos ofrece nuevas oportunidades para modelar etapas muy tempranas del desarrollo del corazón humano y no tengan acceso. En contraste con muchos métodos anteriores, el protocolo de diferenciación de cardiomiocitos describe aquí no requiere la agregación de células o la adición de activina A o BMP4 y robusta genera cultivos de células que son altamente positivos para la troponina cardíaca I y T (TNNI3, TNNT2), iroquois- proteína clase homeodominioIRX-4 (Irx4), reguladora de la miosina de cadena ligera 2, isoforma muscular ventricular / cardiaca (MLC2v) y miosina reguladora cadena ligera 2, isoforma auricular (MLC2a) por día 10 a través de todas las células madre embrionarias humanas (CMEH) y líneas hiPSC probado para fecha. Las células pueden ser pasados ​​y mantenidos por más de 90 días de cultivo. La estrategia es técnicamente simple de implementar y rentable. Caracterización de los cardiomiocitos derivados de células pluripotentes a menudo incluye el análisis de marcadores de referencia, tanto a nivel de ARNm y proteína. Para el análisis de proteínas, citometría de flujo es una poderosa herramienta analítica para evaluar la calidad de las células en cultivo y la determinación de la homogeneidad subpoblación. Sin embargo, la variación técnica en la preparación de muestras puede afectar significativamente la calidad de citometría de flujo de datos. Por lo tanto, la estandarización de los protocolos de tinción debería facilitar las comparaciones entre diversas estrategias de diferenciación. En consecuencia, optimizado los protocolos de tinción para el análisis de Irx4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, y TNNT2 por citometría de flujo se describen.

Introduction

La generación de cardiomiocitos de hPSCs, incluyendo células madre y hiPSC, puede funcionar como un modelo in vitro de los procesos de desarrollo cardíacas humanas muy tempranas, proporcionando información sobre las etapas de otra manera no accesibles para los estudios mecanicistas. Este sistema modelo ofrece oportunidades únicas para estudiar los mecanismos moleculares que controlan el compromiso de linaje cardiaco y la especificación del destino celular. En los últimos años, la capacidad de generar eficazmente células cardiomiogénico de hPSCs ha mejorado en gran medida 1-15. Sin embargo, entre los protocolos hay una variación línea celular con respecto a la eficiencia en la generación de células cardiomiogénico y temporización en la que las células expresan marcadores específicos para cada cámara (por ejemplo, ventrículo y aurículas). Idealmente, para futuras aplicaciones de este sistema de modelo, se desean más poblaciones homogéneas de células funcionalmente definidos. En contraste con los métodos anteriores, el protocolo de diferenciación de cardiomiocitos describe aquí no requiere ceagregación ll o la adición de proteínas activina A o morfogenética ósea 4 (BMP4) y robustamente genera culturas altamente positivo para TNNI3 TNNT2, Irx4, MLC2v y MLC2a por día 10 células en todas las líneas de células madre y hiPSC probados hasta la fecha. La estrategia es técnicamente fácil de implementar, especialmente en comparación con cultivos tridimensionales, la cultura de masas, o estrategias basadas cuerpo embrioide 4-9, y se definió recientemente en un estudio que describe una molécula pequeña con toxicidad selectiva a hPSCs (Boheler et al. ) 65. Las características de este protocolo incluyen la diferenciación de hPSCs en cultivo en monocapa utilizando una sola capa de una matriz calificado hESC (Matrigel), medios completamente definidos que utilizan pequeñas moléculas que modulan la señalización Wnt (similar, pero distinta de 1,2,7,13), y flujo optimizado citometría de métodos de tinción para la evaluación de la eficiencia de la diferenciación y la identidad de la célula. En resumen, las ventajas de este protocolo en comparación con los informes anteriores incluyen su costo-efectividad, reproducibilidad y su alta eficiencia para la generación de cardiomiocitos entre múltiples líneas de HPSC, incluyendo células madre y hiPSC líneas.

La citometría de flujo es una poderosa herramienta de análisis para evaluar la calidad de las células en cultivo y determinar la homogeneidad subpoblación, y con un diseño experimental adecuado, pueden proporcionar mediciones cuantitativas. Al igual que con todas las estrategias basadas en anticuerpos, la interpretación precisa de los resultados experimentales requiere que los elementos del diseño del ensayo, incluyendo la concentración de anticuerpo y la fijación y las condiciones de permeabilización (cuando dirigidas a antígenos intracelulares) son cuidadosamente probados para cada anticuerpo como condiciones sub-óptimas afectan significativamente la eficiencia del anticuerpo vinculante, y por lo tanto, la interpretación de los resultados. Es importante destacar que, si se requiere la cuantificación, los anticuerpos monoclonales son esenciales, como los anticuerpos policlonales pueden reconocer epítopos múltiples y son propensas a la variación de lote a lote. Actualmente, una variedad de anticuerpos (polyclonal protocolos y monoclonales) y tinción se han descrito para la evaluación de la diferenciación in vitro, por lo que es difícil comparar la eficiencia de cardiomyogenesis entre protocolos 1,2,9,11. Por esa razón, los anticuerpos monoclonales se utilizan cuando esté disponible para todos los análisis de citometría de flujo. De cara al futuro, se espera que la normalización de estos protocolos de tinción, especialmente con respecto a la cuantificación, deben permitir una mejor comparación entre las estrategias de diferenciación.

La elección de los marcadores, y sus correspondientes anticuerpos, que se utiliza para evaluar la pureza de in vitro cardiomyogenesis varía entre los informes. TNNT2 se ha considerado un indicador de las células comprometidas con el destino cardiomiogénico y se utiliza habitualmente para evaluar la eficacia de los protocolos de diferenciación cardíacas. Sin embargo, TNNT2 también se expresa en el músculo esquelético durante el pollo y rata desarrollo temprano 16,17 y está presente en el músculo liso humano 18 in vitro. MLC2v y MLC2a se utilizan habitualmente como marcadores indirectos de subtipos ventriculares y auriculares, respectivamente. Sin embargo, los retos con confiar en MLC2v y MLC2a para determinar el subtipo de cardiomiocitos en el contexto de la diferenciación in vitro surgen del hecho de que estos productos génicos no se puede restringir a una cámara específica largo del desarrollo cardíaco, del tubo de corazón a través de adulto. En el roedor bucle corazón, MLC2a ARNm es predominante en la / zona de tracto de entrada auricular y MLC2v ARNm es predominante en las regiones del tracto ventricular / flujo de salida. En el corazón de bucle, co-expresión de MLC2a y MLC2v ARNm se observó en el tracto de entrada, canal atrioventricular y el tracto de salida 19,20. A los 3 días después del nacimiento, MLC2v ARNm está restringida al ventrículo y por 10 días después del nacimiento, MLC2a se limita a las aurículas en el corazón de rata neonatal 19. Por lo tanto, la interpretaciónde los datos relativos a la eficiencia y la identidad de subtipo cardiomyogenesis no sólo deben considerar la presencia y cantidad de los niveles de marcadores de referencia, pero deben tener en cuenta la etapa de desarrollo (s) a la que los puntos de tiempo de la diferenciación que se analizan corresponden. Esto es especialmente importante teniendo en cuenta que la etapa de maduración de las células cardiomiogénico generados por diferenciación in vitro de hPSCs se asemeja más estrechamente a los del desarrollo fetal / embrionario 21-25. Por lo tanto, basándose en la expresión espacial de un marcador en el corazón postnatal puede no ser apropiado para la evaluación de células derivadas de HPSC, al menos en algunos casos.

En un esfuerzo por facilitar el desarrollo de criterios más específicos para la definición de la identidad de los cardiomiocitos in vitro, TNNI3 se considera que es un marcador útil para evaluar cardiomyogenesis in vitro, ya que se limita al músculo cardiaco a lo largo de la embriogénesis en el pollo y pez cebra 15,20y está ausente en el músculo esquelético fetal humano 26. Mientras TNNI1 está presente en el corazón fetal humano, TNNI3 es la única isoforma TNNI presente en el corazón adulto normal 27,28. En cuanto a la identidad subtipo de cardiomiocitos, Irx4 29-31 es un marcador informativo de las células con un destino ventricular. En el nivel de proteína, Irx4 ha demostrado recientemente ser restringido al ventrículo del corazón del tubo lineal a través de etapas neonatales en el ratón 32. En consecuencia, se describen los protocolos de tinción optimizados para el análisis de TNNI3 y Irx4 por citometría de flujo. Para nuestro conocimiento, esta es la primera descripción de un método para la tinción basada en anticuerpos eficiente y análisis de los niveles Irx4 en cardiomiocitos humanos por citometría de flujo.

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Protocol

1. Solución y Preparación de Medios

  1. hESC Matrix Calificado Coating Stock Solution
    1. Lentamente descongelar hESC matriz cualificado (5 ml) en hielo a 4 º C durante la noche. Prescindir de alícuotas en tubos de microcentrífuga pre-refrigerados, 1,5 ml estéril y almacenar inmediatamente a -20 º C.
      NOTA: El volumen de la alícuota variará dependiendo de la cantidad y por lo general oscila desde 270 hasta 350 l. Fabricante proporciona detalles con respecto a volumen de alícuota requerida para alcanzar una concentración 1x tras la dilución en 25 ml como se describe en el paso 2.1.
  2. HPSC media Stock Soluciones
    1. Use agua ultrapura como diluyente a menos que se indique lo contrario. Esterilizar todos los componentes utilizando un filtro de 0,22 micras. Guarde lo siguiente como soluciones a granel a 4 ° C: bicarbonato de sodio (75 mg / ml); ácido cítrico (10 mM, pH = 3).
    2. Esterilizar todos los componentes que utilizan filtro de jeringa de 0,2 micras y almacenar cada uno como alícuotas a -20 ° C: Rho quinasa (ROCK) inhibidor Y-27632 (10mM en DPBS, 100 l alícuota); Ácido L-ascórbico 2-fosfato (64 mg / ml, alicuota de 500 ml); selenito de sodio (70 g / ml, 100 l alícuota); transferrina (50 mg / ml, 107 l alícuota); factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2; 200 ng / l en DPBS, 250 l alícuota); factor de crecimiento transformante beta 1 (TGFß1, 100 ng / l en ácido cítrico frío 10 mM, 10 l alícuota).
  3. Composición HPSC Solución Media E8
    1. Preparar los medios de comunicación utilizando alícuotas preparadas en el Paso 1.2: DMEM / F12 (con L-glutamina y HEPES; 500 ml), bicarbonato de sodio (3,62 ml; final: 543 mg / ml), ácido L-ascórbico 2-fosfato (500 l; finales : 64 g / ml), selenito de sodio (100 l; final: 140 ng / ml), transferrina (107 l; final: 10,7 g / ml), insulina (1 ml; final: 20 mg / ml), FGF2 (250 l; final: 100 ng / ml), TGFß1 (10 l; final: 2 ng / ml).
    2. Combinar todas las componentes, esterilizar filtro y se almacena a 4 º C durante un máximo de 2 semanas.
  4. HPSC Medios E8 con Inhibidor ROCA
    1. Añadir inhibidor ROCA 15 l a 12 ml de medio E8 preparadas como anteriormente y mezclar bien. Asegúrese de que la concentración final es de 10 M después de la adición de las células / los medios de comunicación en el paso 3.7.
  5. Soluciones madre de Wnt moduladores
    1. Guarde las siguientes alícuotas a -20 º C. CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5​-methyl-1 H -imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethy​l]amino]-3-pyridinecarbonitrile; 10 mM en DMSO, 15 l alícuotas). IWR-1 (4 (1,3,3a, 4,7,7a-hexahidro-1,3-dioxo-4,7-metano-2H-isoindol-2-il)-N-8-quinolinil benzamida; 10 mM en DMSO, 6 l alícuotas).
  6. Diferenciación de Medios
    1. Preparar los medios de diferenciación # 1 con RPMI 1640 (con L-glutamina) con 2% de suplemento de insulina menos B27.
    2. Preparar los medios de diferenciación # 2 con RPMI 1640 (con L-glutamina) con 2% B27 más suplemento de insulina y 2% de FBS.
  7. Cell Solución de Lavado fo cultivo celular
    1. Utilizar tampón fosfato salino de Dulbecco (DPBS), sin calcio o magnesio.
  8. Cell Solución de Lavado de Citometría de Flujo
    1. Utilizar tampón fosfato salino (PBS, sin calcio o magnesio) con 1% de FBS. Almacenar a 4 ° C.
  9. Solución de mantenimiento celular para citometría de flujo
    1. Utilice solución salina equilibrada de Hank (HBSS; sin calcio o magnesio) con 5% de FBS. Almacenar a 4 ° C.
  10. Soluciones de fijación para citometría de flujo
    1. Utilice tampón Cytofix como solución de fijación de anticuerpos TNNI3 y Irx4.
    2. Utilice 4% de paraformaldehído en PBS 1x (hacer fresco) como solución de fijación para anticuerpos y TNNT2 MLC2a.
    3. Utilice metanol al 70% / 30% de acetona como solución de fijación para anticuerpos MLC2v.
    4. Almacene todas las soluciones a 4 ° C.
  11. Soluciones para la permeabilización de Citometría de Flujo
    1. Utilice PhosFlow Perm Buffer III como solución de permeabilización fo anticuerpos TNNI3 y Irx4. Conservar a temperatura ambiente (25 ° C).
    2. Use 0,2% de Triton X-100 en PBS 1x como solución de permeabilización de anticuerpos TNNT2, MLC2v, y MLC2a. Almacenar a 4 ° C.
  12. Solución de bloqueo
    1. Utilice un 10% de suero de cabra en PBS 1x. Hacer fresco y almacenar a 4 ° C hasta su uso.

Revestimiento 2. Plate

  1. Lentamente descongelar 1 alícuota de matriz calificado hESC a 4 ° C durante 30 minutos, añadir 25 ml de frío DMEM / F12 y mezclar bien en esterilizada campana de cultivo de tejido inmediatamente antes de recubrir placas de 6 pocillos.
  2. Añadir 1 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos en esterilizada campana de cultivo de tejidos (1 alícuota de la matriz calificado células madre es suficiente para revestir cuatro placas de 6 pocillos).
  3. Permita matriz calificado hESC se asiente durante 30 minutos a temperatura ambiente bajo el capó. Aspirar el exceso de matriz calificado hESC y añadir 2 ml de medio E8 con inhibidor ROCA a cada pocillo. Use platos inmediatamente, o si desired, almacenar a 4 ° C inmediatamente después de la siembra hasta por 1 semana y equilibrar a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de su uso.

3. Propagación y Mantenimiento de indiferenciados hPSCs en monocapa cultura

  1. Mantener hPSCs en cultivo monocapa en placas de 6 pocillos y realizar todos los pasos bajo una campana de cultivo de tejidos estéril.
  2. Utilice líneas HPSC que están bien establecidas (> p20) y exhiben una morfología homogénea sin la presencia de células con un neural, morfología epithelial- o similar a fibroblastos. Asegúrese de células proliferan robusta, y, en promedio, el paso cada tres días a 75% de confluencia cuando se sembraron a 0,75 x 10 6 por pocillo.
  3. HPSCs pasaje con la disociación a nivel de células individuales por lo menos 5 veces antes del inicio de la diferenciación para asegurar la máxima eficiencia de la diferenciación. Para hPSCs de paso, los medios de comunicación aspirado E8 y se lavan las células dos veces con 4 ml de 1x DPBS (precalentada a temperatura ambiente). Añadir 1 ml de la desconexión celularsolución ción (pre-calentado a temperatura ambiente) a cada pocillo y salir del pozo en reposo durante 3-7 minutos, hasta que los bordes de células comienzan a round-up.
  4. Usar una pipeta de vidrio de algodón conectado con el bulbo para desalojar las células y transferir a un tubo cónico de 15 ml que contiene 1 ml de medio DMEM / F12 (para inactivar la solución de desprendimiento de las células).
  5. Retire 10 l alícuota de solución de células y mezclar con 10 l de azul de tripano en un tubo de microcentrífuga. Recuento de células (por ejemplo, automatizado o manual de hemocitómetro), mientras que el resto de las células se recogen por centrifugación a 130 xg durante 5 min a temperatura ambiente. El uso de este protocolo, esperar 70-80% de viabilidad utilizando un hemocitómetro automatizado y en el futuro, la base de todos los números de teléfonos en el total de células.
  6. Aspirar los medios de comunicación y resuspender el botón celular en DMEM / F12 a una concentración final de 0,75 x 10 6 células por 500 l.
  7. Añadir 500 l de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de 6 pocillos donde cada contai asíns 2 medios ml E8 con inhibidor de ROCK, preparada en el paso 2.3. Dejando placa sobre la encimera, mover suavemente en una de delante hacia atrás y el movimiento de lado a lado para dispersar uniformemente a través de las células del pozo. Células retorno a la incubadora en el 5% de CO 2, 37 º C.
  8. A partir de las 24 horas después de los pases, sustitución de los medios todos los días usando 2 ml / pocillo E8 sin inhibidor ROCA. Optimizar densidad de siembra para lograr el 100% de confluencia antes del inicio de la diferenciación. Seed 0.75 x 10 6 células / pocillo cuatro días antes del inicio de la diferenciación, sino optimizar para cada línea celular según sea necesario.

4. cardiomiocitos Inducción de hPSCs por Selective modulación de la vía Wnt

  1. Actualizar medios de comunicación (2 ml / pocillo) al día durante 0-7 días, y cada dos días después del día 8.
  2. En el día 0, comenzar el proceso de diferenciación mediante la sustitución de los medios de comunicación E8 con medio de diferenciación # 1. Añadir 1,2 l CHIR (6 M final) a cada pocillo. Repita en el día 1.
  3. En los días 2-3, reemplace con dife frescamedios ciación # 1.
  4. El día 4, sustituir con la diferenciación fresca para los medios # 1. Añadir 1 l IWR-1 (5 mM final) a cada pocillo. Repita en el día 5.
  5. En los días 6-7, sustituir con la diferenciación fresca para los medios # 1.
  6. El día 8, reemplace con la diferenciación fresca para los medios # 2.
  7. Continuar para reemplazar con medio de diferenciación # 2 cada dos días durante el tiempo deseado de la cultura.
  8. Si se desea, los cardiomiocitos de paso utilizando la solución de desprendimiento celular siguiendo los pasos descritos en 3.3-3.6, pero sustituyendo los medios de comunicación con los medios de diferenciación # 2. Durante los pases, disociar los cardiomiocitos en pequeños racimos de células ~ 3-10. Semilla en ~ 6 x 10 5 células por pocillo utilizando células madre pocillos recubiertos de matriz cualificado y diferenciación para los medios # 2.

5. Recolección de Células para citometría de flujo

  1. Lleve a cabo todos los aspectos restantes de los pasos 5-9 en la mesa de laboratorio (es decir, no estéril).
  2. Medios de cultivo Aspirar y lavar las células dos veces con PBS 1x.Añadir 1 ml de la solución de desprendimiento de las células (pre-calentado a la temperatura ambiente) a cada pocillo y dejar en reposo durante 3-7 min, hasta los límites celulares comienzan a round-up. Utilice un desechable "pipeta de vidrio de borosilicato de algodón-9 conectado con el bulbo para desalojar las células y transferir a un tubo cónico de 15 ml en hielo.
  3. A lo largo de resto de protocolo, mantener las células en hielo y realizar centrifugaciones a 200 xg durante 5 min a 4 ° C.
  4. Recoger las células por centrifugación y la solución aspirada. Resuspender las células en solución de lavado celular 10 ml usando una pipeta serológica de 10 ml con la trituración repetida para garantizar grupos de células se dispersan en células individuales. Contar las células como en el paso 3.5, mientras que el resto de las células se recogen por centrifugación.
  5. Resuspender las células en solución de lavado celular cuidando desagregar completamente sedimento celular y alícuota de 1 x 10 6 células por tubo de fondo redondo. Recoger las células por centrifugación y la solución aspirada.

6. La fijación yPermeabilización de células para la tinción intracelular de antígenos

  1. Añadir solución de fijación 100 l de sedimento celular. Añadir la solución gota a gota con agitación vorticial suave continua y a continuación, establezca en hielo durante 15 min.
  2. Añadir la solución de lavado de células 3 ml. Recoger las células por centrifugación y la solución aspirada.
  3. Añadir solución de permeabilización 100 l de sedimento celular. Añadir la solución gota a gota con agitación vorticial suave continua a continuación, establezca en hielo durante 30 min. Utilice las condiciones de fijación y permeabilización como se indica para cada anticuerpo en la Tabla 1.
  4. Añadir la solución de lavado de células 3 ml. Recoger las células por centrifugación y la solución aspirada. Repita para un total de dos lavados después de permeabilización.
Anticuerpo Primario (Clon) Inmunógeno / epítopo reconocido Control de Istotype La cantidad de anticuerpo primario por 1 x 10 6 células en 100 l Solución de fijación Solución de permeabilización Anticuerpo secundario Cantidad de anticuerpo secundario / 1 x 10 6 células en 100 l
Para medidas positivas por ciento Para el antígeno de cuantificación
TNNI3 (284 (19C7) ISASRKLQL (humana) Ratón IgG2b 1,0 g 3,0 g BD Cytofix BD PhosFlow perm III De cabra anti-ratón de IgG2b-Alexa488 600 ng
TNNT2 (1C11) Longitud completa purificada T proteína troponina humana nativa. Ratón IgG1 1,0 g 2,0 g 4% PFAen el 1% de PBS 0,2% de Triton X-100 en PBS 1% Cabra IgG1 anti-ratón - Alexa 488 600 ng
MLC2v (330G5) FDPEGKG Ratón IgG2a 2,0 g 3,0 g 70% de metanol / 30% de acetona 0,2% de Triton X-100 en PBS 1% Anti-ratón de cabra IgG2a - Alexa 647 600 ng
MLC2a (4E7) proteína recombinante humano de longitud completa de MYL7 humana producida en E. coli Ratón IgG1 0,5 g 3,0 g 4% PFA en PBS 1% 0,2% de Triton X-100 en PBS 1% Cabra IgG1 anti-ratón - Alexa 488 600 ng
Irx4 LQEHRKNP
YPTKGEKI
MLAIITKM
TLTQVST 		IgG de conejo 0,5 g 0,5 g BD Cytofix BD PhosFlow perm III Cabra anti-raBBIT IgG-PE 600 ng

Tabla 1 Concentraciones de anticuerpos. Listado son el anticuerpo primario, el clon (si monoclonales), concentraciones optimizadas y condiciones de fijación y permeabilización para cada anticuerpo primario y secundario utilizan para los análisis de citometría de flujo. Como las concentraciones de anticuerpo de valores pueden variar entre los proveedores del mismo clon, las concentraciones finales de cada anticuerpo por 1 x 10 6 células en un volumen de ensayo fija, en lugar de diluciones, se proporcionan. El inmunógeno utilizado para generar el anticuerpo, o epítopo reconocido por el anticuerpo, según lo previsto por el fabricante, está en la lista, pero no fue verificado experimentalmente aquí.

7. tinción de anticuerpos

  1. Para cada experimento, incluir un control sin teñir por fijación / permeabilización y la condición de control de isotipo apropiado para cada anticuerpo primario utilizado. Incluya tipos de células no cardiomiocitos como controles negativos (por ejemplo, las células madre pluripotentes o fibroblastos). Use controles de isotipo a la misma concentración que el anticuerpo primario correspondiente (véase la Tabla 1).
  2. Resuspender las células en 100 l de solución de bloqueo con una pipeta P200 desagregar las células. Set muestras en hielo durante 25 minutos con agitación suave.
  3. Sin retirar la solución de bloqueo, añadir el anticuerpo primario o isotipo control según las directrices de la Tabla 1. Incubar 45 min en hielo con suave balanceo.
  4. Añadir la solución de lavado de células 3 ml. Recoger las células por centrifugación y la solución aspirada. Repetir para un total de dos lavados después del marcaje del anticuerpo primario.
  5. Si se utiliza un anticuerpo primario conjugado con fluoróforo, proceder a 8.1. Cuando se utiliza un anticuerpo primario sin conjugar (como para todos los marcadores descritos aquí), realizar un etiquetado con el anticuerpo secundario que está conjugado con un fluoróforo como sigue.
  6. Resuspender las células en 100 l de solución de bloqueo utilizando una pipeta P200 a disacélulas ggregate.
  7. Añadir anticuerpo secundario según las pautas de la Tabla 1. Incubar 30 min en hielo con suave balanceo.
  8. Añadir la solución de lavado de células 3 ml. Recoger las células por centrifugación y la solución aspirada. Repetir para un total de dos lavados después del marcaje del anticuerpo secundario.

8. Preparación de las células para citometría de flujo

  1. Resuspender las células en 400 l solución de mantenimiento de las células utilizando una pipeta P1000 desagregar las células.
  2. Prepare una tapa filtro de células en un tubo de fondo redondo de pre-humectación con solución de mantenimiento de la célula 50 l. Ajuste el tubo en hielo. Utilice la tapa del filtro de células para evitar que los agregados de células se obstruya el citómetro de flujo.
  3. Transferir la solución de célula a célula tapón del filtro y permitir la suspensión de células se escurra por gravedad. Toque parte inferior de tubo suavemente en el banco de la parte superior según sea necesario para que las células se recogen en el tubo y un retroceso en hielo tan pronto como sea posible. Colador enjuague con el mantenimiento de células de 250 l por lolución para asegurar la recuperación máxima de las células.
  4. Mantener células en hielo y proteger de la luz hasta que se analizaron por citometría de flujo.

9. Flow Analysis Citometría

Configuración de adquisición detallados varían entre los instrumentos. Parámetros fundamentales a tener en cuenta para la recolección de datos óptima se describen a continuación.

  1. Para una estabilidad óptima corriente, asegúrese de que el tamaño de la boquilla supera 5-6 veces está analizando el diámetro de la célula.
    NOTA: Esto puede variar entre los instrumentos, pero es una consideración importante, tanto para los analizadores y seleccionar el tamaño de la boquilla adecuada para la clasificación de células. El diámetro medio de 10 días cardiomiocitos es 11 micras (que van 8-14 micras); Por lo tanto, un tubo de inyección de la muestra estándar 150 micras en un analizador funciona bien.
  2. Inmediatamente antes de análisis de datos, cada tubo de vórtice brevemente para dispersar los agregados de células.
  3. Optimizar adelante y ajustes de voltaje de dispersión lateral para cada tipo de células basadas ensin teñir de control para cada condición de fijación / permeabilización usado en el experimento de tal manera que las poblaciones de interés son a escala y centrado (Figura 2A).
    1. Mantener estos valores a lo largo de un solo experimento y ser consistentes de un experimento a otro en el mismo instrumento, como cambios importantes pueden indicar posibles problemas con el citómetro de flujo o la preparación de muestras.
  4. Para cada fluoróforo, analizar el control de isotipo y ajustar el voltaje de láser adecuado para determinar la intensidad mínima requerida para obtener un histograma de fluorescencia que muestra bordes izquierdo y derecho del pico. Mantener los ajustes del láser para cada isotipo de control cuando la adquisición de datos en las correspondientes muestras de anticuerpos manchado.
    NOTA: la deriva de la señal a menudo se produce con el tiempo en el mismo instrumento. Es crítico para ajustar la configuración de láser en el comienzo de cada experimento basado en el control de isotipo apropiado.
  5. Reunir un mínimo de10,000 eventos. Se prefieren 50.000 eventos.
  6. Para los análisis estadísticos, puerta la población de células vivas para excluir los desechos (Figura 2A). Determinar porcentaje de células positivas dentro de la población cerrada sobre la base de colocación de marcador que permite ≤2% contribución de control de isotipo, como se muestra en la Figura 2B, C.

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Representative Results

En el día 0, las células son 100% confluentes con morfología compacta y restos celulares mínima. En los días 1-2, es común observar una muerte celular significativa (40-50%), pero las células unidas retendrá la morfología compacta (Figura 1A). Durante este tiempo, los medios de comunicación es de color naranja y turbia. Medios Pink indica muerte celular excesiva, y en este caso, confirme con azul de tripano y suspender si la muerte celular supera el 70%. Las células se recuperarán durante los días 3-4 y densidad aumentarán. Durante los días 5-6, la muerte celular se produce una mínima y parches densos pueden comenzar a aparecer. Por día 7-8, una monocapa confluente se logra con la morfología compacta entremezclado con parches densos. Las células comienzan espontáneamente contrayendo el día 8 y las primeras contracciones suelen ser visibles en los parches densos. Durante el día 10, se observó contracción más robusto y continuará extendiéndose por todo el cultivo en días posteriores. Tinción inmunocitoquímica para α-actinina y TNNT2 estructura espectáculo sarcómero(Figura 1A). Como medida por la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR), los niveles de mRNA de los marcadores de referencia de los perfiles temporales mesodermo y mostrar compromiso cardiomiogénico como se esperaba (Figura 1B), con sólida expresión de la proteína cardiaca marcadores Homeobox Nkx-2.5 (NKX2.5 ), TNNI3 MLC2a, MLC2v, y la miosina-6 (MYH6). Muy bajo a niveles no detectables de músculo liso (miosina de cadena pesada 11, MYH11) y músculo esquelético (myogenin, MYOG) marcadores son de rutina. En consonancia con el desarrollo temprano, donde se observa la expresión tanto en el músculo cardíaco y esquelético antes de ser restringido a los músculos esqueléticos en el adulto 20,27,28, troponina isoformas TNNI1 y TNNI2 se detectan con firmeza durante los días 7-8.

De acuerdo con otros informes, esta estrategia de diferenciación in vitro en cardiomiocitos genera con características de células progenitoras cardíacas tempranas (morfología redondeada, co-expresión de MLC2a, MLC2v) 19 30,32. En la citometría de flujo, los perfiles de dispersión de luz varían entre los tipos de células y cambiar considerablemente de fijación / condiciones de permeabilización (Figura 2A). Bajo estas diversas condiciones de preparación celular, citometría de flujo análisis revela controles de isotipo con picos individuales con una clara distinción entre el control de isotipo y el anticuerpo (Figura 2B). Células pluripotentes o otras células no cardiomiocitos son negativos para los marcadores utilizados aquí.

El uso de este protocolo de diferenciación y la tinción, la población celular resultante es típicamente 99% TNNI3, 96% Irx4 +, 91% MLC2v +, y 96% por MLC2a + 10 días de diferenciación tal como se mide por citometría de flujo. Se observaron 99% TNNT2 + células (figuras 2C, 2D), pero como se describió anteriormente, TNNT2 no es únicoa los cardiomiocitos durante el desarrollo y por lo tanto la afirmación de que las células son 99% cardiomiocitos auténticos por día 10 se basa en la proteína TNNI3. Se observa que con el cultivo continuado más allá de 10 días, los niveles de proteína de las proteínas estructurales se mantendrán altos aunque los niveles de expresión génica relativa se reducirá con respecto al pico de expresión monitorizada por qRT-PCR, compatible con la estabilidad de proteínas y las tasas de rotación de 3,2 y 3,5 días, respectivamente, para TNNI y TNNT 33. Un ejemplo de esta observación se muestra para TNNT2 (la expresión del ARNm de pico en el día 11 (Figura 1B), los niveles de proteína en sólidos 20 + días (Figura 2E).

Figura 1
Figura 1 esquema general de la diferenciación de los cardiomiocitos de hPSCs y datos representativos. (A) Representación esquemática de differentiatio cardiomiocitos protocolo n anotado con correspondiente etapa de linaje y / o compromiso destino celular. Imágenes de contraste de fase representativos de células en las principales etapas del proceso de diferenciación. Barra de escala = 10 m. A la derecha = imagen inmunocitoquímica de α-actinina (verde) cubrió de TNNT2 (rojo) y núcleos (azul). (B) Análisis de QRT-PCR (para el grupo de sonda, consulte la tabla de Materiales) de 18 mesodermo referencia y marcadores cardíacos durante el desarrollo los primeros 17 días de diferenciación. Todos los datos son una media de tres réplicas biológicas cada analizaron por triplicado, en donde las barras de error representan el error estándar de la media, y se normalizan a la actina (ACTB). Niveles de mensajes para todos los puntos de tiempo son en relación con el primer día de la diferenciación, donde los valores de Ct son detectables (es decir Ct <35). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

t "fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 2
Figura 2 Caracterización de cardiomiocitos por citometría de flujo y la electrofisiología. (A) los perfiles de dispersión de luz de día 10 cardiomiocitos derivados de hiPSC en diversas condiciones de fijación y permeabilización. Se recogieron 50.000 eventos y la población cerrada (es decir, excluyendo los desechos) que se utiliza para los análisis estadísticos se muestran en rojo. (B) Histogramas de Irx4 en el día 10 de diferenciación utilizando tres condiciones de fijación / permeabilización diferentes, lo que ilustra las diferencias en la tinción de la eficiencia entre los métodos. El recuadro muestra las diferencias en la coloración de Irx4 sobre hiPSCs utilizando cada condición. Estos datos ilustran por qué se evita metanol / acetona para Irx4 debido a la baja, pero detectable, manchas en hiPSCs. (C) Histogramas de TNNI3 TNNT2, MLC2v, MLC2a en el día 10 de Differenti ación usando condiciones de tinción optimizados para porcentaje de células positivas máximos que se detallan en la Tabla 1. (D) Histogramas de TNNT2 de experimentos de titulación de anticuerpos, lo que ilustra que 0,5 g es la cantidad mínima requerida para la medición de 99% TNNT2 + células, pero que 2 g es el punto de saturación requerida para la cuantificación. Sólo se muestra un único control de isotipo, pero experimentos de titulación se calculan sobre la base de la comparación de cada anticuerpo a su correspondiente titulación de control de isotipo. (E) Cuantificación de la proteína TNNT2 en cardiomiocitos en los días 0-24 de la diferenciación, representado como la diferencia de la intensidad media de fluorescencia entre el anticuerpo y el control de isotipo para cada punto. (F) El potencial de acción grabado de una sola cardiomiocitos-ventricular como contraer espontáneamente en día 46 de la diferenciación utilizando la configuración de fijación de corriente de célula completa de la técnica de patch clamp tiempo.en / ftp_upload / 52010 / 52010fig2highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Accutase cell detachment solution Stem Cell Technologies 7920
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) Sigma Aldrich D2650
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 53817
Citric acid Sigma Aldrich C2404-100G
Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor R&D Systems 1254
L-Ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma Aldrich A8960-5G
Sodium selenite Sigma Aldrich S5261-10G
Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) Invitria 777TRF029
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) R&D Systems 4144-TC-01M
Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) Peprotech 100-21
DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES Life Technologies 11330-032
Insulin Sigma Aldrich I9278-5ML
CHIR-99021 HCl Sellekchem S2924
IWR-1 Sigma Aldrich I0161
RPMI 1640 with L-Glutamine Life Technologies 11875-093
B-27 Supplement Minus Insulin Life Technologies A1895601
B-27 Supplement (with Insulin) Life Technologies 17504-044
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
Flow Cytometry Reagents
Phosphate buffered saline (10x) Quality Biological Inc. 119-069-151
Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ Life Technologies 14175-095
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Phosflow perm buffer III BD Biosciences 558050
16% Paraformaldehyde Thermo Scientific 28906
Methanol Sigma Aldrich 179957-4L
Acetone Mallenckrodt Chemicals  2440-16
Triton X-100 Amresco M236-10ML
Goat serum Life Technologies 16210-064
Trypan blue solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
Materials
5 ml Round bottom polystyrene tube (without cap) Corning 352008 For preparation of cells for flow cytometry
5 ml Round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) Corning 352235 For preparation of cells for flow cytometry
2 ml rubber bulbs Fischer Scientific 03-448-24
9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets BioExpress P-2904-2
0.65 ml Microcentrifuge tubes, graduated, green GeneMate C-3259-G
1.5 ml Microcentrifuge tubes, graduated, red GeneMate C-3260-R
TC20 automated cell counter BioRad 145-0102
Counting slides for TC20 BioRad 145-0011
6-well Flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
20 ml Syringes BD Plastipak 300613 For filter sterilization of aliquots
Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone VWR 28145-501 For filter sterilization of aliquots
250 ml Filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding Corning 431096 For filter sterilization of bulk media 
500 ml filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding Corning 431097 For filter sterilization of bulk media
Antibodies and Isotype Controls
Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) Abcam ab19615 Primary antibody
Anti-TNNT2 (clone: 1C11) Thermo Scientific MA1-16687 Primary antibody
Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) Synaptic Systems 310111 Primary antibody
Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) Abcam AB131661 Primary antibody
Anti-IRX4   Bioss BS-9464R Primary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1  Life Technologies A21121 Secondary antibody
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a Life Technologies A21241 Secondary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b Life Technologies A21141 Secondary antibody
Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG R&D Systems F0110 Secondary antibody
Mouse IgG1 BD Biosciences 557273 Isotype Control
Mouse IgG2a eBiosciences 16-4724-81 Isotype Control
Rabbit IgG-PE R&D Systems IC105P Isotype Control
TaqMan Probesets for qRT-PCR
ACTB Life Technologies Hs01060665
Brachyury T Life Technologies Hs00610080
CASQ2 Life Technologies Hs00154286
IRX4 Life Technologies Hs01100809
ISL1 Life Technologies Hs00158126
MESP1 Life Technologies Hs01001283
MYH11 (SMMHC) Life Technologies Hs00224610
MYH6 Life Technologies Hs01101425
MYL2 (MLC2v) Life Technologies Hs00166405
MYL7 (MLC2a) Life Technologies Hs01085598
MYOG Life Technologies Hs01072232
NKX2.5 Life Technologies Hs00231763
NPPA Life Technologies Hs01081097
POU5F1 Life Technologies Hs04260367
SOX17 Life Technologies HS00751752
TNNI1 Life Technologies Hs00913333
TNNI2 Life Technologies Hs00268536
TNNI3 Life Technologies HS00165957
TNNT2 Life Technologies Hs00165960

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References

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Biología Celular Número 91 de células madre pluripotentes inducidas humanas citometría de flujo la diferenciación dirigida cardiomiocitos Irx4 TNNI3 TNNT2 MCL2v MLC2a
Alta Eficiencia Diferenciación de células madre pluripotentes humanas a cardiomiocitos y Caracterización por citometría de flujo
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