Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Sitometrisi ile Yüksek Verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin Farklılaşma ve Karakterizasyonu

Published: September 23, 2014 doi: 10.3791/52010
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 3, 2, 4,5, 1,6
1Department of Biochemistry, Medical College of Wisconsin, 2Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 3Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, Hong Kong University, 5Division of Cardiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Cardiovascular Research Center, Biotechnology and Bioengineering Center, Medical College of Wisconsin
* These authors contributed equally

Summary

Makale verimli seçici referans belirteçlerinin analizi nüfusun homojenliği ve kimliğini değerlendirmek için flow sitometri ile takip Wnt yolu, modüle göre kardiyomiyositlere insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmek için ayrıntılı yöntem anlatılmaktadır.

Abstract

, Hasarlı kalp tamir kalp üzerinde toksik etkileri yoktur yeni tedavi ilaçlar keşfetmek ve doğru kalp hastalığı modellemek için stratejiler geliştirmek için yaklaşımlar geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır. Bu uygulamalar için "bir tabak içinde" kalp kası oluşturmak amacıyla insan uyarılmış pluripotent kök hücre (hiPSC) teknolojisini istismar potansiyeli yüksek coşku oluşturmak için devam ediyor. Son yıllarda, verimli insan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) den cardiomyogenic hücreleri üretmek için yeteneği büyük ölçüde aksi erişilebilir değil, insan kardiyak gelişiminin çok erken aşamalarında modellemek için bize yeni fırsatlar sunan geliştirdi. Birçok önceki yöntemlerin tersine, kardiyomiyosit farklılaşma protokolü hücresi toplanmasını ya da A ya da aktivin BMP4 eklenmesini gerektirmeyen, burada açıklanan ve güçlü bir kardiyak troponin için yüksek seviyede pozitif olan hücre kültürleri üretir I ve T (TNNI3, TNNT2), iroquois- sınıf Homeodomain proteiniIRX-4 (Irx4), miyozin düzenleyici hafif zincir 2, ventriküler / kalp kası izoformu (MLC2v) ve miyozin düzenleyici hafif zincir 2, tüm insan embriyonik kök hücre (HESC) ve hiPSC hatları üzerinden 10 günde atriyal izoformu (MLC2a) için test tarihi. Hücreler geçirildi ve kültür içinde en fazla 90 gün muhafaza edilebilir. Strateji teknik uygulamak için basit ve maliyet-etkin. Pluripotent hücreler türetilen kardiyomiyositlerin karakterizasyonu genellikle mRNA ve protein seviyesinde, her ikisi de referans işaretlerinin analizini içermektedir. Protein analizi için, akış sitometrisi, kültürdeki hücre kalitesinin ve alt popülasyonu homojenliğinin saptanması için güçlü bir analitik araç olduğunu. Ancak, numune hazırlama teknik varyasyon anlamlı veri akış sitometri kalitesini etkileyebilir. Böylece, boyama protokolleri standardizasyon çeşitli farklılaşma stratejileri arasında karşılaştırmalar kolaylaştırmalıdır. Bu duruma göre, Irx4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 ve TNN analizi için boyama protokolleri optimizeAkış sitometri T2 açıklanmıştır.

Introduction

HESC ve hiPSC dahil hPSCs, ikinci kardiyomiyositlerde oluşmasından mekanik çalışmalar için başka şekilde erişilemez aşamalarında fikir veren çok erken insan kardiak gelişimsel süreçlerinin bir in vitro model olarak işlev görebilir. Bu model sistem kalp soy bağlılığı ve hücre kaderinin şartname kontrol moleküler yolları incelemek için eşsiz fırsatlar sunmaktadır. Son yıllarda, etkili hPSCs ikinci cardiomyogenic hücreleri üretmek için yeteneği büyük ölçüde 1-15 iyileşmiştir. Bununla birlikte, protokolleri arasında hücreler oda özgü belirteçleri (örneğin, ventrikül ve kulakçıklar) ifade eden hücreler de cardiomyogenic ve zamanlama üreten verimliliğine göre hücre çizgisi farklılıklar vardır. İdeal olarak, bu model sisteminin gelecek uygulamalar için, fonksiyonel olarak tanımlanmış hücrelerin daha homojen popülasyonları arzu edilir. Önceki yöntemlerin tersine, kardiyomiyosit farklılaşma protokolü ce gerektirmez, burada açıklananII toplanmasını ya da sağlam bir aktivin veya Kemik morfogenetik protein 4 (BMP4) ve ekleme gün TNNI3, TNNT2, Irx4, MLC2v ve MLC2a için kültürlerinden pozitif bugüne kadar test edilen bütün HESC ve hiPSC hatları üzerinden 10 hücreleri oluşturur. Bu strateji, özellikle üç boyutlu kültürler, kitle kültürü veya vücut embriyoit bazlı stratejilerin 4-9 ile karşılaştırıldığında, uygulamaya teknik olarak basittir ve son hPSCs seçici toksisite ile küçük bir molekülü tarif etmektedir bir çalışmada (Boheler ve ark tanımlandı. ) 65. Bu protokolün özellikleri, küçük molekülleri kullanarak tam olarak tanımlanmış bir ortam (fakat farklı 1,2,7,13, benzer bir şekilde,), Wnt sinyal modüle etmek üzere bir yetkili HESC matrisi (Matrigel) oluşan tek bir tabaka kullanılarak tek katmanlı kültürü içinde hPSCs farklılaşmasını içermektedir ve farklılaşma verimlilik ve hücre kimliğinin değerlendirilmesi için boyama yöntemleri sitometri optimize edilmiş akış. Önceki raporlar maliyet-etkiliğin dahil Özetle, bu protokolün avantajları karşılaştırıldıeness, tekrarlanabilirlik ve HESC ve hiPSC hatları dahil olmak üzere birden hPSC hatları arasında yer kardiyomiyositlerin üretmek için yüksek verimlilik.

Flow sitometri kültür hücrelerin kalitesini değerlendirmek ve subpopülasyonu homojenlik belirlenmesi için güçlü bir analitik araçtır, ve uygun deneysel tasarım, kantitatif ölçümler sağlayabilir. Tüm antikor bazlı stratejiler gibi, deneysel sonuçların doğru yorumlanması alt-optimal koşulları belirgin antikor verimini etkileyen gibi antikor konsantrasyonunun ve tespit ve permeabilizasyon koşulları (hücre içi antijenler hedefleme dahil) tahlil tasarım unsurları dikkatle her antikor için test gerektirir , sonuçların yorumlanması bağlanması ve bu nedenle. Niceleme gerekli ise, poliklonal antikorlar, çok epitopu tanıyan ve partiden partiye değişkenlik eğilimli gibi Önemli olarak, monoklonal antikorlar, gereklidir. Şu anda, çeşitli antikorlar, (POlyclonal ve monoklonal) ve boyama protokolleri zor protokoller arasında 1,2,9,11 cardiomyogenesis verimliliğini karşılaştırmak çok in vitro farklılaşma değerlendirilmesi için tarif edilmiştir. Tüm akış sitometresi analizleri için kullanılabilir Bu nedenle monoklonal antikorlar kullanılır. İleriye, daha iyi farklılaşma stratejileri arasında karşılaştırma izin vermelidir, özellikle kantitatif getirmedi, bu boyama protokollerin standartlaştırılması bekleniyor.

In vitro olarak cardiomyogenesis saflığını değerlendirmek için kullanılan belirteçler seçimi ve bunlara karşılık gelen antikorlar, raporlar arasında değişir. TNNT2 cardiomyogenic kaderine işlenen hücrelerin bir göstergesi olarak kabul edilmiş ve rutin olarak kalp farklılaşma protokolleri etkinliğini değerlendirmek için kullanılır. Bununla birlikte, aynı zamanda, erken TNNT2 piliç ve sıçan gelişim 16,17 sırasında iskelet kası olarak ifade edilir ve insan düz kas 18 içinde mevcut olmaktadır in vitro olarak insan cardiomyogenesis özel bir molekül değildir. MLC2v ve MLC2a rutin olarak, sırasıyla, ventriküler ve atriyal alt tiplerinin temsili gösterge olarak kullanılır. Bununla birlikte in vitro farklılaşma bağlamında kardiyomiyosit alt-tipini belirlemek ve MLC2v MLC2a güvenerek zorluklar bu gen ürünleri, yetişkin yoluyla kalp tüp, kalp gelişimi boyunca belirli bir bölmeye sınırlı olmayabilir gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Kemirgen kalp döngüye yılında MLC2a mRNA atriyal / içeakımın alanda baskın ve MLC2v mRNA ventrikül / çıkış yolu bölgelerde yaygındır. Ilmekli kalbinde, MLC2a ve MLC2v mRNA'larının birlikte ifadesi giriş yolu, atriyoventriküler kanal ve çıkış yoluna 19,20 görülmektedir. Doğumdan sonra 3 gün boyunca, MLC2v mRNA ventriküle sınırlıdır ve doğumdan sonra 10 gün, MLC2a neonatal sıçan kalbinde kulakçıklar 19 ile sınırlandırılmıştır. Bu nedenle, yorumlamacardiomyogenesis etkinlik ve alt-tipi kimlik sadece referans markeri seviyelerinin varlığını ve miktarını dikkate gerekir, ancak incelendiğinde farklılaşma edilen zaman noktalarından karşılık gelişimsel aşama (lar) dikkate almalıdır ilişkin verilerin. Bu hPSCs in vitro farklılaşma tarafından üretilen cardiomyogenic hücrelerin olgunlaşma aşaması en yakın, embriyonik / fetal gelişim 21-25 benzer olanlar göz önüne alındığında özellikle önemlidir. Bu nedenle, doğum sonrası kalp bir işaretin mekansal ifade dayanarak, en azından bazı durumlarda hPSC türetilen hücrelerin değerlendirilmesi için uygun olmayabilir.

In vitro kardiyomyosit kimliklerini tanımlamak için daha spesifik kriterler geliştirilmesini kolaylaştırmak için bir çaba, TNNI3 o civciv ve Zebra balığı 15,20 embriyogenezis boyunca kalp kasının sınırlı olarak in vitro cardiomyogenesis değerlendirmek için değerli bir belirteç olarak kabul edilirve insan fetusu iskelet kası 26 yoktur. TNNI1 insan cenin kalbi mevcut iken, TNNI3 normal yetişkin kalp 27,28 tek TNNI izoformu mevcuttur. Kardiyomyosit alt tip kimliğine ilişkin, Irx4 29-31 ventriküler kaderi ile hücrelerin bilgilendirici bir belirtecidir. Protein düzeyinde, Irx4 son fare 32, neonatal aşamalardan doğrusal kalp tüpten ventriküle sınırlı olduğu gösterilmiştir. Bu duruma göre, akış sitometrisi ile analiz TNNI3 ve Irx4 için optimize boyama protokolleri açıklanmıştır. Bildiğimiz kadarıyla, bu akış sitometrisi ile etkin bir biçimde antikor bazlı boyama ve insan kardiyomiyositlerde Irx4 seviyesini ölçmek için bir yöntem, ilk tanımlamasıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Çözüm ve Medya Hazırlık

  1. HESC Nitelikli Matrix Kaplama Stok Çözüm
    1. Yavaşça bir gece boyunca 4 ° C'de HESC buz üzerinde nitelikli matrisi (5 mi) eritin. 1.5 ml steril, önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpler içine hacimde dağıtın ve hemen -20 ° C'de saklayın.
      Not: tüm bölenin hacmi çok dayanmaktadır ve tipik haliyle 270-350 ul aralığında değişir. İmalatçı Adım 2.1 'de tarif edildiği gibi 25 ml seyrelmesi üzerine 1x konsantrasyon elde etmek için gerekli olan tüm bölenin hacmi ile ilgili bilgi sağlar.
  2. hPSC Medya Hazır Çözümler
    1. Aksi belirtilmedikçe, bir seyreltici olarak ultra saf su kullanın. 0.22 mikron filtre kullanılarak tüm bileşenleri sterilize. 4 ° C'de toplu çözeltiler gibi, aşağıdaki muhafaza edin: sodyum bikarbonat (75 mg / ml); sitrik asit (10 mM, pH = 3).
    2. 0.2 mikron şırınga filtre kullanarak tüm bileşenleri sterilize ve -20 ° C'de hacimde olarak her saklamak: Rho kinaz (ROCK) inhibitörü Y-27632 (10DPBS mM, 100 ul tümbölen); L-askorbik asit 2-fosfat (64 mg / ml 500 ul tümbölen); sodyum selenit (70 ug / ml, 100 ul tümbölen); transferin (50 mg / ml 107 ul tümbölen); fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2 200 ng / DPBS ul, 250 ul tümbölen); büyüme faktörü beta 1 transforme (soğuk 10 mM sitrik asit içinde TGFβ1, 100 ng / ml, 10 ul tümbölen).
  3. hPSC Medya E8 Çözüm Kompozisyon
    1. , L-askorbik asit 2-fosfat (500 ul; nihai; (: 500 ml L-glutamin ve HEPES), sodyum bikarbonat (543 mg / ml 3.62 ml nihai), DMEM / F12: Aşama 1.2 'de elde alikot ile ortam hazırlayın : 64 ug / ml), sodyum selenit (100 ul, nihai 140 ng / ml), transferin (107 ul; nihai: 10.7 ug / ml), insülin (1 mi; son 20 ug / ml), FGF2 (250 ul, nihai 100 ng / ml), TGFβ1 (10 ul, nihai: 2 ng / ml).
    2. Kadar 2 hafta boyunca 4 ° C'de tüm bileşenleri, filtre sterilize ve mağaza birleştirin.
  4. KAYA inhibitörü ile hPSC Ortam E8
    1. Yukarıda anlatıldığı gibi hazırlanmış E8 ortam, 12 ml, 15 ul ROCK inhibitörü ekleyin ve iyice karıştırın. Nihai konsantrasyon adım 3.7 / ortam hücreleri ilave edildikten sonra 10 uM olduğundan emin olun.
  5. Wnt Modülatörlü stok Çözümleri
    1. -20 ° C'de aşağıdaki alikotları saklayın. CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5​-methyl-1 H -imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethy​l]amino]-3-pyridinecarbonitrile; DMSO içinde 10 mM, 15 ul tümbölen). IWR-1 (4-(1,3,3a, 4,7,7a-Heksahidro-1,3-diokso-4,7-metano-2H-izoindol-2-il)-N-8-kinolinil-benzamid; DMSO içinde 10 mM 6 ul tümbölen).
  6. Farklılaşma Medya
    1. % 2 B27 eksi insülin takviyesi ile (L-glutamin ile) RPMI 1640 farklılaşma medya # 1 hazırlayın.
    2. % 2 B27 artı insülin takviyesi ve% 2 FBS ile (L-glutamin ile) RPMI 1640 ortamı ile farklılaşma 2. hazırlayın.
  7. Hücre Yıkama Çözeltisi fveya Hücre Kültürü
    1. Kalsiyum ve magnezyum içermeyen Dulbecco fosfat tamponlu salin (DPBS) içinde kullanın.
  8. Akış Sitometrinin Hücre Yıkama Çözeltisi
    1. % 1 FBS (kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS) fosfat tamponlu tuzlu su kullanın. 4 ° C'de saklayın.
  9. Akış Sitometrinin Hücre Bakım Çözüm
    1. % 5 FBS (kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS) Hank Dengeli Tuz Çözeltisi kullanın. 4 ° C'de saklayın.
  10. Akış Sitometrinin için tespit Çözümler
    1. TNNI3 ve Irx4 antikorlar için sabitleme çözeltisi olarak Cytofix tampon kullanabilir.
    2. TNNT2 ve MLC2a antikorlar için sabitleme çözeltisi olarak 1 x PBS içinde% 4 paraformaldehid (taze olun) kullanınız.
    3. MLC2v antikor için sabitleme çözeltisi olarak% 70 metanol /% 30 aseton kullanılabilir.
    4. 4 ° C'de tüm çözümleri saklayın.
  11. Akış Sitometrinin için Permeabilizasyon Çözümler
    1. Geçirgenleştirme çözeltisi f olarak Phosflow Perm Tampon KULLANILMASIveya TNNI3 ve Irx4 antikorlar yer alır. Oda sıcaklığında (25 ° C) saklayınız.
    2. TNNT2, MLC2v ve MLC2a antikorlar için özellikle geçirgenleştirme çözeltisi olarak 1 x PBS içinde% 0.2 Triton X-100 kullanarak. 4 ° C'de saklayın.
  12. Bloklama çözeltisini
    1. 1x PBS içinde% 10 keçi serumu kullanın. Taze yapmak ve kullanılıncaya kadar 4 ° C'de saklayın.

2. Plakası Kaplama

  1. Yavaşça, 30 dakika boyunca 4 ° C'de HESC kalifiye matris 1 kısım Çözülme soğutulmuş DMEM / F12, 25 ml eklenir ve hemen 6 oyuklu tabaklar önce steril doku kültürü kaputu iyice karıştırın.
  2. Steril doku kültürü başlık altında 6-çukurlu levha başına 1 ml ilave edilir (HESC kalifiye matrisin 1 kısım kat dört 6-yuvalı plakalar için yeterlidir).
  3. HESC kalifiye matris başlık altında oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ayarlamak için olanak sağlar. Aşırı HESC nitelikli matrisi aspire ve her iyi ROCK inhibitörü ile E8 medyanın 2 ml ekleyin. Kullanım plakaları hemen varsa veya desIRED, 4 ° C'de saklama hemen sonra en fazla 1 hafta kaplama ve kullanılmadan önce 30 dakika süre ile oda sıcaklığına kadar dengeye C.

3. Pasajlanması ve Tek tabakalı Kültür ayrım hPSCs Bakım

  1. 6-yuvalı plakalar içinde tek tabakalı bir kültür olarak muhafaza hPSCs ve steril doku kültürü başlık altında tüm adımları gerçekleştirmek.
  2. HPSC iyi kurulmuş hatları (> p20) kullanın ve bir sinir, epithelial- veya fibroblast-benzeri morfolojisi olan hücrelerin varlığı olmadan homojen bir morfoloji. Kuyu başına 0,75 x 10 6 tohumlandıklarında hücreleri% 75 izdiham her üç gün sağlam çoğalırlar ve ortalama, geçit üzerinde emin olun.
  3. Tek hücre düzeyinde ayrışma ile Passage hPSCs en az 5x önce maksimum farklılaşma verimliliği sağlamak için farklılaşma başlatın. Geçit hPSCs için, aspirat E8 ortam ve 1x DPBS (oda sıcaklığına kadar önceden ısıtılmış) 4 ml ile iki kez yıkama hücreleri. Hücre kopmakta 1 ml ekleyinment her bir oyuğa çözeltisi (oda sıcaklığına kadar önceden ısıtılmış) ve hücre sınırları boyunca-up başlayana kadar, 3-7 dakika için de rahatsız bırakın.
  4. Hücreleri çıkarmak ve DMEM / F12 ortam 1 ml içeren 15 ml'lik konik bir tüp içine transfer etmek için bir ampul ile pamuk takılı cam pipet kullanın (ki bu hücre ayırma çözeltisi inaktive etmek için).
  5. Hücre çözeltisi, 10 ul bir kısım çıkarın ve bir mikrosantrifüj tüpü içinde, tripan mavisi 10 ul ile karıştırılır. Hücrelerin geri kalanı, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 130 x g'de santrifüj ile toplanır sırasında hücreler (örneğin, otomatik ya da elle hemositometre) sayılır. Bu protokolü kullanarak,% 70-80 canlılığı otomatik Hemasitometre kullanarak ve toplam hücre sayımı baz tüm cep numaraları, ileriye bekliyoruz.
  6. Ortam aspire 500 ul, 0.75 x 10 6 hücre nihai bir konsantrasyona kadar DMEM / F12 hücre pelletini ve.
  7. 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, hücre süspansiyonu 500 ul her bir göze burada contaiROCK inhibitörü ile ns 2 ml E8 medya, adım 2.3 hazırladı. Tezgahı üzerinde plaka bırakarak, yavaşça arasında genel bir önden arkaya ve yandan yana bir hareket homojen bir şekilde dağılmalıdır hücre hareket eder. % 5 CO 2, 37 ° C'ye kadar inkübatör hücreleri dönün.
  8. Pasajlayarak 24 saat sonra başlayan, günlük ROCK inhibitörü olmadan 2 ml / da E8 kullanarak ortamı değiştirin. Farklılaşma başlatmak için önce% 100 izdiham ulaşmak için ekim yoğunluğunu optimize eder. 0.75 x 10 6 hücre Tohum / de dört gün farklılaşma başlar, ama gerektiğinde her hücre hattı için optimize önce.

Wnt yola¤ Seçici Modülasyon tarafından hPSCs 4. kardiyomiyosit İndüksiyon

  1. Gün 0-7 süresince günlük (2 ml / da) medya Refresh, ve 8. günde sonra her gün.
  2. Gün 0, farklılaşma medya # 1 ile E8 medya değiştirerek farklılaşma süreci başlar. Her iyi 1.2 ul CHIR (6 mcM final) ekleyin. 1. günde tekrarlayın.
  3. Günlerde 2-3, taze ayırıcı ile değiştirinbarındırdığı medya # 1.
  4. 4. günde, taze farklılaşma medya # 1 ile değiştirin. Her bir oyuğa, 1 ul IWR-1 (nihai 5 uM) eklenir. Günde 5 tekrarlayın.
  5. Günlerde 6-7, taze farklılaşma medya # 1 ile değiştirin.
  6. 8. günde, taze ortam farklılaşma # 2 ile değiştirin.
  7. Farklılaşma medya # 2 kültürünün arzu edilen süre boyunca her gün değiştirin devam edin.
  8. İstenirse, 3,3-3,6 özetlenen adımları izleyerek, ama farklılaşma medya # 2 ile medyayı ikame hücre dekolmanı çözüm kullanarak geçit kardiyomiyositler. Pasajlayarak sırasında, ~ 3-10 hücrelerin küçük kümeler halinde kardiyomiyositlerin ayırmak. Iyi kullanarak HESC nitelikli matris kaplı çukurlara ve farklılaşma medya # 2 başına ~ 6 x 10 5 hücre Tohum.

Akış Sitometrinin için Hücrelerin 5. Koleksiyonu

  1. Laboratuar tezgahının (steril değildir) 5-9 adımları kalan tüm yönlerini gerçekleştirir.
  2. Aspire büyüme ortamı ve 1x PBS ile iki kez hücreleri yıkayın.Hücre sınırları boyunca-up başlayana kadar (oda sıcaklığına kadar önceden ısıtılmış), her bir hücre ayırma çözeltisi 1 ml de ilave edin ve 3-7 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Hücreleri çıkarmak ve buz üzerinde bir 15 ml konik tüp içine aktarmak için ampul ile bir pamuk takılı borosilikat cam atılabilir 9 "pipet kullanın.
  3. Protokol kalanı boyunca buz üzerinde hücreleri korumak ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrüfüj yapar.
  4. Santrifüj ve aspirasyon çözeltisi hücreler toplanır. Hücre kümeleri sağlamak için tekrar tekrar toz haline getirilir ve 10 ml'lik bir pipet kullanılarak serolojik 10 ml hücre yıkama çözeltisi içinde süspanse hücreler tek hücreler içine dağıtılır. Hücreler santrifüjleme ile toplanmış geri kalan ise adım 3.5 olarak hücre sayımı.
  5. Hücre yıkama çözeltisi özen göstererek yeniden süspanse hücreler tamamen hücre pelet ve kısım yuvarlak dipli tüp başına 1 x 10 6 hücre parçalamak için. Santrifüj ve aspirasyon çözeltisi hücreler toplanır.

6. Tespit veHücre içi antijen boyanması için Hücrelerin geçirgenliği

  1. Hücre pelletine 100 ul sabitleme çözeltisi ekleyin. Çözeltisi damla damla sürekli Yumuşak bir girdaplamadan ile ve daha sonra 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir ekleyin.
  2. 3 ml hücre yıkama solüsyonu ekleyin. Santrifüj ve aspirasyon çözeltisi hücreler toplanır.
  3. Hücre pelletine 100 ul permeabilizasyon solüsyonu ekleyin. Çözeltisi damla damla, daha sonra 30 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir sürekli Yumuşak bir girdaplamadan ile ekleyin. Tablo 1 'de her bir antikor için belirtildiği gibi tespit ve geçirgenliği arttıran koşullar kullanın.
  4. 3 ml hücre yıkama solüsyonu ekleyin. Santrifüj ve aspirasyon çözeltisi hücreler toplanır. Geçirgenleştirmeden sonra iki yıkama arasında bir toplam için tekrarlayın.
Birincil antikoru (klon) İmmunogen / Epitop Tanınan Kontrol Istotype 100 ul içinde 1 x 10 6 hücre başına birincil antikor miktarı Sabitleme Çözüm Geçirgenliği arttıran çözeltiyi İkincil antikor 100 ul ikincil antikor miktarı / 1 x 10 6 hücre
Pozitif yüzde ölçümleri için Antijen kantitasyonu için
TNNI3 (284 (19C7) ISASRKLQL (insan) Fare IgG2b 1,0 mikrogram 3.0 ug BD Cytofix BD Phosflow perma III Keçi anti-fare IgG2b-Alexa488 600 ng
TNNT2 (1C11) Tam boy saflaştırılmış doğal insan troponin T proteini. Fare IgG1 1,0 mikrogram 2.0 ug % 4 PFA% 1 PBS % 1 PBS içinde% 0.2 Triton X-100 Keçi anti-fare IgG1 - Alexa 488 600 ng
MLC2v (330G5) FDPEGKG Fare IgG2a 2.0 ug 3.0 ug % 70 metanol /% 30 aseton % 1 PBS içinde% 0.2 Triton X-100 Keçi anti-fare IgG2a - Alexa 647 600 ng
MLC2a (4E7) E. üretilmiş, insana ait MYL7 tam uzunlukta insan yeniden birleştirici proteinin coli Fare IgG1 0.5 ug 3.0 ug % 1 PBS içinde% 4 PFA % 1 PBS içinde% 0.2 Triton X-100 Keçi anti-fare IgG1 - Alexa 488 600 ng
Irx4 LQEHRKNP
YPTKGEKI
MLAIITKM
TLTQVST 		Tavşan IgG 0.5 ug 0.5 ug BD Cytofix BD Phosflow perma III Keçi anti-raIgG PE BBIT 600 ng

Her birincil ve ikincil antikor için optimize konsantrasyonları ve fiksasyon ve permeabilizasyon koşulları akışı için kullanılan (monoklonal varsa) Table 1. Antikor konsantrasyonlar. Listelenen birincil antikor olan, klon sitometri analizleri. Antikor stok konsantrasyonları aynı klonun sağlayıcıları arasında değişebilir olarak, son sabit bir tahlil hacmi içinde 1 x 10 6 hücre başına her antikor konsantrasyonu, seyreltme yerine sağlanmıştır. İmmünojen, antikorun üretilmesi için kullanılan, ya da imalatçı tarafından temin edildiği gibi epitop, antikor tarafından tanınan, listede ancak deneysel burada doğrulanmadı.

7. Antikor Boyama

  1. Her deney için, bir sabitleme / permeabilizasyon durumuna göre kontrol ve boyanmamış kullanılan her bir primer antikor için uygun izotip kontrolü içerir. (Negatif kontroller gibi non-kardiyomyosit hücre türlerini içerirörneğin, pluripotent kök hücreleri ya da fibroblastları). Primer antikor tekabül eden aynı konsantrasyonda izotip kontrolleri kullanarak (Tablo 1 e bakınız).
  2. Hücreleri parçalamak için P200 pipet kullanarak çözümü engelleme 100 ul süspanse hücreler. Hafif sallama ile 25 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir örnekleri.
  3. Engelleme çözümü çıkarmadan,. Birincil antikor veya Tablo 1'de kurallarımıza göre izotop kontrolü eklemek hafif hafif sallanarak buz üzerinde 45 dakika inkübe edin.
  4. 3 ml hücre yıkama solüsyonu ekleyin. Santrifüj ve aspirasyon çözeltisi hücreler toplanır. Primer Antikor etiketleme işleminden sonra, iki yıkama toplam tekrarlayın.
  5. Bir florofor ile konjüge edilmiş birincil antikor kullanıldığında, 8.1 'e geçin. Bir konjüge edilmemiş birincil antikor (örneğin, burada tarif edilen tüm belirteçleri için olduğu gibi) kullanıldığında, aşağıdaki gibi bir florofor konjuge edilmiş ikincil antikor ile etiketlenmesi.
  6. DISA bir P200 pipet kullanarak çözümü engelleme 100 ul süspanse hücrelerggregate hücreleri.
  7. . Tablo 1'de ilkelerine uygun olarak, ikincil antikor ekleyin hafif sallama ile buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
  8. 3 ml hücre yıkama solüsyonu ekleyin. Santrifüj ve aspirasyon çözeltisi hücreler toplanır. İkincil antikor etiketleme sonra iki yıkama arasında bir toplam için tekrarlayın.

Akış Sitometrinin için Hücrelerin 8. hazırlanması

  1. Hücreleri parçalamak için P1000 pipet kullanarak 400 ul hücre bakım çözeltisi içinde süspanse hücreler.
  2. 50 ul hücre bakım çözeltisi ile ön-ıslatma ile bir yuvarlak tabanlı tüp üzerindeki bir hücre süzgecinden kapağı hazırlayın. Buz üzerinde tüp ayarlayın. Sitometresi akışını tıkamasını hücre agrega önlemek için hücre süzgecinden kapağı kullanın.
  3. Süzgeç kapağı hücre ve hücre süspansiyon yerçekimi boşalmasını sağlamak için hücre çözümü aktarın. Hücreler tüp içine toplandı ve mümkün olduğunca hızlı bir şekilde tekrar buz üzerinde bekletilir, böylece gerekli tezgah üstüne hafifçe tüpün alt dokunun. 250 ul hücre bakım böylece ile durulayın süzgeçdökülmesinden hücrelerinin maksimal iyileşme sağlamak için.
  4. Hücreleri buz üzerinde muhafaza etmek ve akış sitometrisi ile analiz edilene kadar ışıktan koruyunuz.

9. Sitometrisi Analizi

Ayrıntılı kazanım ayarlarını araçların arasında değişmektedir. Optimal veri toplama dikkate temel parametreler aşağıda açıklanmıştır.

  1. Optimal akışı istikrar için, meme boyutu, hücrenin çapı analiz edilen 5-6x aşmasını sağlamak.
    NOT: Bu aletler arasında değişir ama analizörleri ve hücre sıralama için uygun meme boyutunu seçerek hem önemli bir husustur olabilir. Gün 10 kardiyomiyositlerin ortalama çapı (8-14 mikron arasında değişen) 11 mikron olduğu; Bu şekilde, bir analiz standart bir 150 um numune enjeksiyon borusu iyi çalışır.
  2. Hemen önce veri analizi için, kısa bir süre için her bir tüp vorteks hücre agregatlarının dağıtılması.
  3. Ileri Optimize ve her hücre tipi için yan dağılım gerilim ayarları dayalıilgilenilen popülasyonları ölçektedir ve (Şekil 2A) merkez şekilde Deneyde kullanılan her bir sabitleme / permeabilizasyon durumu için boyanmadan kontrolü.
    1. Anlamlı kaymalar sitometresiyle akış veya numune hazırlama ile olası sorunlara işaret edebilir gibi, tek bir deney boyunca bu ayarları korumak ve aynı cihaz üzerinde deney yapmak deneyden tutarlı olması.
  4. Her fluorofor için izotip kontrolü analiz etmek ve tepe sol ve sağ kenarları görüntüleyen bir fluoresans histogramının elde etmek için gerekli en düşük yoğunluğunu belirlemek için uygun bir lazer gerilimini ayarlamak. Antikor lekeli örnekleri gelen verileri satın alırken her bir izotop kontrol için lazer ayarları koruyun.
    NOT: Sinyal sık sık kayması aynı cihazda zamanla oluşur. Bu uygun bir izotip kontrolü ile ilgili olarak, her bir deneyin başlangıcında lazer ayarları için çok önemlidir.
  5. En az toplayın10.000 olaylar. 50.000 olaylar tercih edilir.
  6. İstatistiksel analizler için, kapı canlı hücre popülasyonu enkaz (Şekil 2A) dışlamak için. Şekil 2B'de, C'de gösterildiği gibi, ikinci bir izotip kontrolü ≤2% katkı sağlar işaretleyici yerleşimine göre kapı nüfus içinde yüzde pozitif hücrelerin belirlenmesi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

0. günde, hücreler, kompakt morfolojisi ve hücre döküntüleri en az% 100 birleşik bulunmaktadır. Günlerde 1-2, anlamlı hücre ölümünü (% 40-50) gözlemlemek için ortak, ancak ekli hücreleri kompakt morfoloji (Şekil 1A) muhafaza edecektir. Bu süre boyunca, medya portakal ve bulanıktır. Pembe ortam aşırı hücre ölümünü göstermektedir ve bu durumda, tripan mavisi ile teyit Hücre ölümü ve% 70 aşarsa bırakmaktadır. Hücreler gün 3-4 esnasında kurtarmak ve yoğunluk artacak. 5-6 gün boyunca, en az sayıda hücre ölümü meydana gelir ve yoğun yamalar görünebilir başlayabilir. Gün 7-8 olarak, bir birleşik tek tabakalı yoğun yamalar ile serpiştirilmiş kompakt morfolojisi ile elde edilir. Hücreler kendiliğinden günde 8 ile sözleşme başlar ve ilk kasılmaları sık sık yoğun yamalar görünür olacaktır. 10. günde, daha güçlü bir daralma görülmektedir ve sonraki gün kültür boyunca yayılmaya devam eder. Α-aktinin ve TNNT2 göstermek sarkomer yapısı İmmünositokimya boyama(Şekil 1A). Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile ölçüldüğü gibi, mezoderm ve cardiomyogenic bağlılık görüntü geçici profilleri referans markerleri mRNA seviyeleri kardiyak belirteçler Homeobox proteini NKX-2.5 (Nkx2.5 ekspresyonu ile sağlam, (Şekil 1B), beklendiği gibi ), TNNI3, MLC2a, MLC2v ve miyozin-6 (MYH6). Düz kas (miyozin ağır zincir 11, MYH11) ve iskelet kası tespit edilemez seviyelere çok düşük (myogenin, MYOG) işaretleri mutattır. Sentezleme TNNI1 ve TNNI2 sağlam gün 7-8 sırasında tespit edilmektedir izoformları troponin, yetişkin 20,27,28 iskelet kası sınırlı önce hem de kalp ve iskelet kası gözlenir erken gelişimi ile tutarlıdır.

Diğer raporlar ile tutarlı olarak, bu in vitro farklılaşma stratejisi erken kardiyak progenitörlerinin özelliklerine kardiyomiyositlerde (yuvarlak morfoloji, MLC2a eş ekspresyonunu MLC2v) 19 üretir 30,32 kararlı görünmektedir. Flow sitometri, ışık dağılım profilleri hücre tipleri arasında değişecektir ve sabitleme / permeabilizasyon koşulları (Şekil 2A) arasında önemli farklılıklar gösterir. Analizi izotop kontrol ve antikor (Şekil 2B) arasında açık bir ayrım ile tek zirveleri ile izotop kontrolleri ortaya çıkarır sitometri bu çeşitli hücre hazırlama koşulları altında, akış. Pluripotent hücreler veya diğer non-kardiyomyosit hücreler burada kullanılan belirteçler için negatiftir.

Bu farklılaşma ve boyama protokolü kullanılarak, elde edilen hücre popülasyonu,% 99 TNNI3,% 96 Irx4 +,% 91 MLC2v +, tipik olarak% 96 + MLC2a farklılaşma 10. günde, akış sitometrisi ile ölçülmüştür. % 99 TNNT2 + hücreleri (Şekil 2C, 2D) ile gözlemlenebilir, ancak yukarıda tarif edildiği gibi, tek değildir TNNT2hücreler, 10 günde% 99 özgün kardiyomiyositler TNNI3 proteinine dayanır olduğu geliştirilmesi ve böylece iddia sırasında kardiyomi. Bu, qRT-PCR tarafından denetlendiği kadarıyla gün 10 ötesinde kültür devamı olan, yapısal proteinlerin protein düzeyleri, ifade zirve göreli olarak azalacak protein stabilitesi ve 3.2 ve 3.5 gün devinimlerinin tutarlı göreceli gen ekspresyonu seviyelerinin yüksek kalır, ancak not edilmektedir sırasıyla TNNI ve TNNT 33 için. Bu gözlemin bir örneği TNNT2 (ortalama 11 (Şekil 1B) tepe mRNA ekspresyonu için gösterilmiştir, 20 + gün ile sağlam protein düzeyleri (Şekil 2E).

Şekil 1
Şekil 1. hPSCs ve temsilci verileri kardiyomiyosit farklılaşma genel şematik. (A) kardiyomyosit differentiatio şematik n protokol soy ve / veya hücre kaderi taahhüt gelen sahne ile açıklamalı. Farklılaştırma prosesi önemli aşamalarında hücreleri Örnek Faz kontrast görüntüleri. Ölçek çubuğu 10 mm =. Uzak sağ = α-aktinin (yeşil) immünsitokimya görüntü sırasında TNNT2 (kırmızı) ve çekirdekler (mavi). (B) Mah-PCR analizi (prob seti için, malzemeler tablo bakınız) 18 referans mezodermin ve kardiyak gelişim işaretleri ile kaplanmış farklılaşma ilk 17 gün. Tüm veriler, her bir hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil üç kopya, analiz üç biyolojik tekrarın ortalamasıdır ve aktin (ACTB) normalleştirilir. Ct değerleri (yani Ct <35) saptanabilir nerede her zaman noktaları için mesaj düzeyleri farklılaşma ilk günden göredir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

hep ">:" keep-together.within-page = fo "t Şekil 2
Flow sitometri ve elektrofizyoloji tarafından kardiyomiyositlerin Şekil 2. Karakterizasyonu. (A) çeşitli sabitleme ve permeabilizasyon koşullarda günde 10 hiPSC türetilmiş kardiyomiyositler Işık dağılım profilleri. 50.000 olaylar toplanmış ve istatistiksel analizler için kullanılan kapılı nüfus (yani hariç enkaz) kırmızı gösterilir. (B) Histograms üç farklı tespit / permeabilizasyon koşulları kullanılarak farklılaşma 10. gününde Irx4 arasında yöntemler arasında verimliliği boyanarak farklılıkları gösteren. Konumlar Her koşul ile ilgili hiPSCs Irx4 lekelenmesi bakımından farklılıklar gösterir. DİFERANSİYEL 10. gününde TNNI3, TNNT2, MLC2v, MLC2a Bu veriler metanol / nedeniyle hiPSCs düşük, fakat tespit edilebilir, boyamadan Irx4 için önlenmektedir neden göstermektedir. (C) Histogramlar 0.5 ug% 99 TNNT2 + hücreler ölçümü için gerekli olan minimum miktar olduğu, fakat 2 ug doyma noktası olduğunu gösteren antikor titrasyon deneyleri TNNT2 arasında ation Tablo 1'de ayrıntılı olarak maksimum yüzde pozitif hücreleri için optimize edilmiş boyama koşulları kullanılarak hazırlanabilir. (D) Histogramlar, kantitasyonu için gereklidir. Yalnızca tek bir izotip kontrol gösterilmiştir, ancak titrasyon denemeleri, bir izotip kontrolü, kendi tekabül eden titrasyonu için her antikorunun kıyasını göre hesaplanır. TNNT2 protein (D) miktarının belirlenmesi kardiyomiyositlerindeki farklılaşma 0-24 günlerinde, ortalama floresan yoğunluğu farkının toplamı olarak temsil Her bir zaman noktasında yama kelepçe tekniğiyle tam hücre akımı kelepçe konfigürasyonu kullanılarak diferansiyasyon 46. günde tek bir kendiliğinden daralan ventriküler benzeri kardiyomiyosit kaydedildi. (F) Aksiyon potansiyeli, antikor ve bir izotip kontrolü ile.es / ftp_upload / 52010 / 52010fig2highres.jpg "target =" _blank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Accutase cell detachment solution Stem Cell Technologies 7920
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) Sigma Aldrich D2650
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 53817
Citric acid Sigma Aldrich C2404-100G
Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor R&D Systems 1254
L-Ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma Aldrich A8960-5G
Sodium selenite Sigma Aldrich S5261-10G
Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) Invitria 777TRF029
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) R&D Systems 4144-TC-01M
Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) Peprotech 100-21
DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES Life Technologies 11330-032
Insulin Sigma Aldrich I9278-5ML
CHIR-99021 HCl Sellekchem S2924
IWR-1 Sigma Aldrich I0161
RPMI 1640 with L-Glutamine Life Technologies 11875-093
B-27 Supplement Minus Insulin Life Technologies A1895601
B-27 Supplement (with Insulin) Life Technologies 17504-044
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
Flow Cytometry Reagents
Phosphate buffered saline (10x) Quality Biological Inc. 119-069-151
Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ Life Technologies 14175-095
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Phosflow perm buffer III BD Biosciences 558050
16% Paraformaldehyde Thermo Scientific 28906
Methanol Sigma Aldrich 179957-4L
Acetone Mallenckrodt Chemicals  2440-16
Triton X-100 Amresco M236-10ML
Goat serum Life Technologies 16210-064
Trypan blue solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
Materials
5 ml Round bottom polystyrene tube (without cap) Corning 352008 For preparation of cells for flow cytometry
5 ml Round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) Corning 352235 For preparation of cells for flow cytometry
2 ml rubber bulbs Fischer Scientific 03-448-24
9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets BioExpress P-2904-2
0.65 ml Microcentrifuge tubes, graduated, green GeneMate C-3259-G
1.5 ml Microcentrifuge tubes, graduated, red GeneMate C-3260-R
TC20 automated cell counter BioRad 145-0102
Counting slides for TC20 BioRad 145-0011
6-well Flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
20 ml Syringes BD Plastipak 300613 For filter sterilization of aliquots
Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone VWR 28145-501 For filter sterilization of aliquots
250 ml Filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding Corning 431096 For filter sterilization of bulk media 
500 ml filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding Corning 431097 For filter sterilization of bulk media
Antibodies and Isotype Controls
Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) Abcam ab19615 Primary antibody
Anti-TNNT2 (clone: 1C11) Thermo Scientific MA1-16687 Primary antibody
Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) Synaptic Systems 310111 Primary antibody
Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) Abcam AB131661 Primary antibody
Anti-IRX4   Bioss BS-9464R Primary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1  Life Technologies A21121 Secondary antibody
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a Life Technologies A21241 Secondary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b Life Technologies A21141 Secondary antibody
Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG R&D Systems F0110 Secondary antibody
Mouse IgG1 BD Biosciences 557273 Isotype Control
Mouse IgG2a eBiosciences 16-4724-81 Isotype Control
Rabbit IgG-PE R&D Systems IC105P Isotype Control
TaqMan Probesets for qRT-PCR
ACTB Life Technologies Hs01060665
Brachyury T Life Technologies Hs00610080
CASQ2 Life Technologies Hs00154286
IRX4 Life Technologies Hs01100809
ISL1 Life Technologies Hs00158126
MESP1 Life Technologies Hs01001283
MYH11 (SMMHC) Life Technologies Hs00224610
MYH6 Life Technologies Hs01101425
MYL2 (MLC2v) Life Technologies Hs00166405
MYL7 (MLC2a) Life Technologies Hs01085598
MYOG Life Technologies Hs01072232
NKX2.5 Life Technologies Hs00231763
NPPA Life Technologies Hs01081097
POU5F1 Life Technologies Hs04260367
SOX17 Life Technologies HS00751752
TNNI1 Life Technologies Hs00913333
TNNI2 Life Technologies Hs00268536
TNNI3 Life Technologies HS00165957
TNNT2 Life Technologies Hs00165960

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E1848-E1857 (2012).
  2. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8, 162-175 (2013).
  3. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  4. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
  5. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
  6. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8, 228-240 (2011).
  7. Willems, E., et al. Small-molecule inhibitors of the Wnt pathway potently promote cardiomyocytes from human embryonic stem cell-derived mesoderm. Circ Res. 109, 360-364 (2011).
  8. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
  9. Elliott, D. A., et al. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods. 8, 1037-1040 (2011).
  10. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  11. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Res. 21, 579-587 (2011).
  12. Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, e23657 (2011).
  13. Hudson, J., Titmarsh, D., Hidalgo, A., Wolvetang, E., Cooper-White, J. Primitive Cardiac Cells from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells Dev. 21, 1513-1523 (2011).
  14. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111, 1125-1136 (2012).
  15. Ban, K., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons that target cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128, 1897-1909 (2013).
  16. Toyota, N., Shimada, Y. Differentiation of troponin in cardiac and skeletal muscles in chicken embryos as studied by immunofluorescence microscopy. J Cell Biol. 91, 497-504 (1981).
  17. Saggin, L., Gorza, L., Ausoni, S., Schiaffino, S. Cardiac troponin T in developing, regenerating and denervated rat skeletal muscle. Development. 110, 547-554 (1990).
  18. Kajioka, S., et al. Endogenous cardiac troponin T modulates Ca(2+)-mediated smooth muscle contraction. Sci Rep. 2, 979 (2012).
  19. Franco, D., et al. Myosin light chain 2a and 2v identifies the embryonic outflow tract myocardium in the developing rodent heart. Anat Rec. 254, 135-146 (1999).
  20. Franco, D., Lamers, W. H., Moorman, A. F. Patterns of expression in the developing myocardium: towards a morphologically integrated transcriptional model. Cardiovasc Res. 38, 25-53 (1998).
  21. Poon, E., et al. Transcriptome-guided functional analyses reveal novel biological properties and regulatory hierarchy of human embryonic stem cell-derived ventricular cardiomyocytes crucial for maturation. PLoS One. 8, e77784 (2013).
  22. Lieu, D. K., et al. Absence of transverse tubules contributes to non-uniform Ca(2+) wavefronts in mouse and human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 18, 1493-1500 (2009).
  23. Cao, F., et al. Transcriptional and functional profiling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. PLoS One. 3, e3474 (2008).
  24. Satin, J., et al. Calcium handling in human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 26, 1961-1972 (2008).
  25. Itzhaki, I., et al. Calcium handling in human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. PLoS One. 6, e18037 (2011).
  26. Bodor, G. S., Porterfield, D., Voss, E. M., Smith, S., Apple, F. S. Cardiac troponin-I is not expressed in fetal and healthy or diseased adult human skeletal muscle tissue. Clin Chem. 41, 1710-1715 (1995).
  27. Hunkeler, N. M., Kullman, J., Murphy, A. M. Troponin I isoform expression in human heart. Circ Res. 69, 1409-1414 (1991).
  28. Bhavsar, P. K., et al. Developmental expression of troponin I isoforms in fetal human heart. FEBS Lett. 292, 5-8 (1991).
  29. Christoffels, V. M., Keijser, A. G., Houweling, A. C., Clout, D. E., Moorman, A. F. Patterning the embryonic heart: identification of five mouse Iroquois homeobox genes in the developing heart. Dev Biol. 224, 263-274 (2000).
  30. Bruneau, B. G., et al. Cardiac expression of the ventricle-specific homeobox gene Irx4 is modulated by Nkx2-5 and dHand. Dev Biol. 217, 266-277 (2000).
  31. Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283, 1161-1164 (1999).
  32. Nelson, D. O., Jin, D., Downs, K., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Dev Dyn. 243, 381-392 (2013).
  33. Martin, A. F. Turnover of cardiac troponin subunits. Kinetic evidence for a precursor pool of troponin-I. J Biol Chem. 256, 964-968 (1981).
  34. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22, 1991-2002 (2013).
  35. Farrell, H. M., et al. Nomenclature of the proteins of cows" milk--sixth revision. Journal of dairy science. 87, 1641-1674 (2004).
  36. Micusan, V. V., Borduas, A. G. Biological properties of goat immunoglobulins. G. Immunology. 32, 373-381 (1977).
  37. Lyons, G. E. In situ analysis of the cardiac muscle gene program during embryogenesis. Trends Cardiovasc Med. 4, 70-77 (1994).
  38. Nakagawa, O., Nakagawa, M., Richardson, J. A., Olson, E. N., Srivastava, D. H. R. T. 1 HRT2, and HRT3: a new subclass of bHLH transcription factors marking specific cardiac, somitic, and pharyngeal arch segments. Dev Biol. 216, 72-84 (1999).
  39. Xin, M., et al. Essential roles of the bHLH transcription factor Hrt2 in repression of atrial gene expression and maintenance of postnatal cardiac function. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7975-7980 (2007).
  40. Davis, L. M., Rodefeld, M. E., Green, K., Beyer, E. C., Saffitz, J. E. Gap junction protein phenotypes of the human heart and conduction system. J Cardiovasc Electrophysiol. 6, 813-822 (1995).
  41. Minamisawa, S., et al. Atrial chamber-specific expression of sarcolipin is regulated during development and hypertrophic remodeling. J Biol Chem. 278, 9570-9575 (2003).
  42. Larsen, T. H. Atrial natriuretic factor in the heart of the human embryo. Acta Anat (Basel. 138, 132-136 (1990).
  43. Claycomb, W. C. Atrial-natriuretic-factor mRNA is developmentally regulated in heart ventricles and actively expressed in cultured ventricular cardiac muscle cells of rat and human). Biochem J. 255, 617-620 (1988).
  44. Franco, D., et al. Divergent expression of delayed rectifier K(+) channel subunits during mouse heart development. Cardiovasc Res. 52, 65-75 (2001).
  45. Hoogaars, W. M., et al. The transcriptional repressor Tbx3 delineates the developing central conduction system of the heart. Cardiovasc Res. 62, 489-499 (2004).
  46. Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol Cell Biol. 15, 3813-3822 (1995).
  47. Srivastava, D., Cserjesi, P., Olson, E. N. A subclass of bHLH proteins required for cardiac morphogenesis. Science. 270, 1995-1999 (1995).
  48. Firulli, A. B., McFadden, D. G., Lin, Q., Srivastava, D., Olson, E. N. Heart and extra-embryonic mesodermal defects in mouse embryos lacking the bHLH transcription factor Hand1. Nat Genet. 18, 266-270 (1998).
  49. Calejo, A. I., et al. Differences in the expression pattern of HCN isoforms among mammalian tissues: sources and implications. Mol Biol Rep. 41, 297-307 (2013).
  50. Stevens, S. M., Pu, W. T. HCN4 charges up the first heart field. Circ Res. 113, 350-351 (2013).
  51. Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nat Cell Biol. 15, 1098-1106 (2013).
  52. Davis, R. P., vanden Berg, C. W., Casini, S., Braam, S. R., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell models of cardiac disease and their implication for drug discovery and development. Trends Mol Med. 17, 475-484 (2011).
  53. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. , 107-2733 (2003).
  54. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  55. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 1011-1018 (2011).
  56. Samal, R., et al. OMICS-based exploration of the molecular phenotype of resident cardiac progenitor cells from adult murine heart. J Proteomics. 75, 5304-5315 (2012).
  57. Van Hoof, D., et al. Identification of cell surface proteins for antibody-based selection of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. J Proteome Res. 9, 1610-1618 (2010).
  58. Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics Clin Appl. 2, 892-903 (2008).
  59. Gundry, R. L., Burridge, P. W., Boheler, K. R. Pluripotent Stem Cell Heterogeneity and the Evolving Role of Proteomic Technologies in Stem Cell Biology. Proteomics. 11, 3947-3961 (2011).
  60. Gundry, R. L., et al. A Cell Surfaceome Map for Immunophenotyping and Sorting Pluripotent Stem Cells. Mol Cell Proteomics. , 303-316 (2012).
  61. Bryder, D., Rossi, D. J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cells: the paradigmatic tissue-specific stem cell. Am J Pathol. 169, 338-346 (2006).
  62. Kondo, M., et al. Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application. Annu Rev Immunol. 21, 759-806 (2003).
  63. Shizuru, J. A., Negrin, R. S., Weissman, I. L. Hematopoietic stem and progenitor cells: clinical and preclinical regeneration of the hematolymphoid system. Annu Rev Med. 56, 509-538 (2005).
  64. Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112, 3543-3553 (2008).
  65. Boheler, K. R., Bhattacharya, S., Chuppa, S., Riordon, D. R., Kropp, E., Burridge, P. W., Wu, J. C., Wersto, R. P., Wollscheid Rao,, Gundry, B., L, R. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals New Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Reports. , 185-203 (2014).

Tags

Hücresel Biyoloji Sayı 91 insan uyarılmış pluripotent kök hücre sitometri yönettiği farklılaşma kardiyomyosit Irx4 MLC2a TNNI3 TNNT2 MCL2v akış
Sitometrisi ile Yüksek Verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin Farklılaşma ve Karakterizasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhattacharya, S., Burridge, P. W.,… More

Bhattacharya, S., Burridge, P. W., Kropp, E. M., Chuppa, S. L., Kwok, W. M., Wu, J. C., Boheler, K. R., Gundry, R. L. High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010, doi:10.3791/52010 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter