Summary
Hier wird ein Verfahren für die Festlegung der systemischen Infektion in der neonatalen Ratten mit Kulturen von Escherichia coli K1 beschrieben. Diese nichtinvasive Vorgehensweise erlaubt Besiedlung des Magen-Darm-Trakt, die Translokation des Erregers in den systemischen Kreislauf, und das Eindringen des zentralen Nervensystems in den Plexus choroideus.
Abstract
Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Wirtstier und bakterielle Erreger ist nur dann sinnvoll, wenn die Infektionsmodell verwendet repliziert die wesentlichen Merkmale des natürlichen Infektion. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren für die Festlegung und Bewertung der systemischen Infektion aufgrund neuropathogenic Escherichia coli K1 in der neonatalen Ratten. Colonization des Gastrointestinaltraktes eine Verbreitung des Erregers entlang der gut-Lymph-Blut-Hirn-Verlauf der Infektion und das Modell zeigt starke Altersabhängigkeit. Ein Stamm von E. coli O18: K1 mit erhöhter Virulenz für den neugeborenen Ratten produziert außergewöhnlich hohen Raten der Kolonisation, Translokation in den Blutabteil und Invasion der Hirnhäute folgenden, durch das Adergeflecht. Wie in dem menschlichen Wirt, wird das Eindringen des zentralen Nervensystems durch lokale Entzündung und einer fest Letalausgang begleitet. Das Modell ist aus bewährten Werkzeug für Studien des Mechanismusder Pathogenese, für die Bewertung der therapeutischen Interventionen und für die Beurteilung der bakteriellen Virulenz.
Introduction
Systemischen bakteriellen Infektionen sind eine große Bedrohung für das Wohlergehen und das Überleben des Neugeborenen; Frühgeborene sind besonders gefährdet. Neonatalen bakteriellen Meningitis (NBM), häufig mit bakterieller Sepsis, weiterhin eine signifikante Quelle von Mortalität und Morbidität in den ersten Lebenswochen und das Problem wird durch die ständige Weiterentwicklung der Beständigkeit gegen Frontantibakterielle Medikamente 1,2 verstärkt. Ein Fall von NBM ist ein medizinischer Notfall, der eine hohe medizinische, soziale und wirtschaftliche Belastung 3 trägt; Folglich besteht ein dringender Bedarf für neue Therapeutika und insbesondere neuartige prophylaktische Strategien, um die Last der Infektion. Einige Features von NBM sind ungewöhnlich: in der entwickelten Welt, sind Escherichia coli und Streptokokken der Gruppe B für die große Mehrzahl der Fälle und der Fähigkeit dieser Stämme zu NBM entlocken verantwortlich ist fast immer mit der Gegenwart eines Schutz Polysaccharid ca zugeordnetpsule dass der Erreger ermöglicht, Immunerkennung entziehen Prozesse 4. Ein sehr hoher Anteil (80 - 85%) der neuroinvasive E. coli exprimieren das K1-Kapsel 5,6, eine α-2,8-verknüpfte Poly-Sialinsäure-Polymer, das strukturell identisch mit Modulatoren der neuronalen Plastizität 7 Host ist.
Die Bewertung neuer Therapeutika und Prophylaxe für NBM und zugehörige Bakteriämie und Sepsis würde klar von einer robusten Tiermodell der Infektion, die die wichtigsten Merkmale der Krankheit im menschlichen Neugeborenen nachahmt, insbesondere die starke Altersabhängigkeit und dem natürlichen Weg der Infektion profitieren . Eine breite Palette von Modellen für Gram-positive und Gram-negative bakterielle Meningitis stehen 8,9 und diese haben unser Wissen über Pathogenese, Pathophysiologie und Behandlungsmöglichkeiten in dieser Infektionen erheblich erweitert. So experimentellen Infektionen bei Ratten, Mäuse, Kaninchen und Affen wurden verwendet, um Meningitis sowohl in der n studiereneonate und die Erwachsenen. Allerdings sind viele dieser Modelle verwenden direkte intracisternal oder subkutane Injektion von Bakterien für die Initiation der Infektion, eine künstliche Pathogenese durch Umgehen natürlichen Prozesse der Verbreitung von der Stelle der Kolonisation. In einigen Fällen sind diese Methoden der Inokulation führte zu signifikanten Veränderungen in der Pathologie; beispielsweise subkutaner Verabreichung von E. coli K1-Stämme hob die Altersabhängigkeit mit der natürlichen Infektion assoziiert, Herstellung Bakteriämie und Invasion des zentralen Nervensystems (ZNS) in beiden Neugeborenen und Erwachsenen 10. Prädisposition für E. coli NBM hängt entscheidend vertikale Übertragung des Erregers von der Mutter auf das Kind bei oder kurz nach der Geburt 11. Maternale E. coli K1 Bakterien besiedeln den Neugeborenen gastrointestinale (GI-Trakt) 11-13, die steril bei der Geburt ist, aber schnell erwirbt einen komplexen Mikrobiota 14. In kolonisierten Neugeborenen, E. coliK1 Bakterien haben die Fähigkeit, aus dem Darmlumen in den Blutkreislauf vor Eintritt in das CNS durch die Blut-Hirn- oder Blut-Liquor-Schranken 9,15 translozieren. Das Design der robusten Modelle der experimentellen Infektion sollte diese Details zu berücksichtigen.
Obwohl Mäuse wurden weit verbreitet für die Untersuchung von einigen Formen der bakteriellen Meningitis 8 verwendet werden, sind sie für die Untersuchung der neonatalen Infektionen geeignet, sie werden durch eine systemische Infektion überwältigt und nicht die starken Altersabhängigkeitscharakteristik des menschlichen Säuglingen 16 zeigen. Ferner α-Defensine, Schlüssel Peptide der GI-Trakt Schutz gegen systemische Invasion durch E. coli K1 17 sind stark in Paneth-Zellen und Neutrophile in Menschen und Ratten, aber nicht in Mäusen 18 ausgedrückt. Es ist ein bemerkenswertes Maß an Überschneidungen, Redundanz und Heterogenität in der Maus Defensin und verwandte cryptidin Gene nicht in anderen eine gefundenimals 19. Die neugeborenen Ratten wurde ursprünglich von Moxon 20 verwendet und Mitarbeiter, um die Pathogenese der Haemophilus influenzae Meningitis folgenden intranasale Impfung zu untersuchen, die Replikation der natürlichen Standort der Kolonisation dieser neonatalen Krankheitserreger im menschlichen, und anschließend für altersabhängige E. angepasst coli K1 Bakteriämie und Meningitis. Bortolussi et al. 21 Arbeitnehmer intraperitoneale Injektion des bakteriellen Inokulums auf eine Infektion auszulösen, aber der Schlüsselstudie von Glode und Mitarbeiter 22 verwendete orale Magen Fütterung, um die natürlichen Infektionsweg nach GI Kolonisierung parallel. Da die Magensonde kann Schleimhautoberflächen beschädigen, wurde das Verfahren verfeinert werden, um Zufuhr des Inokulums in den Neugeborenen 23 umfassen. Hier wird das Verfahren zum Gastrointestinaltrakt Kolonisierung und Verfahren zum Verfolgen der Infektion in anfälligen jungen Ratten beschrieben; zusätzlich werden therapeutische und präventive Anwendungen des Modells diskutiert.
Protocol
Alle Tierversuche in dieser Studie durchgeführt entsprach nationalen und europäischen Gesetzgebung und wurden von der Ethikkommission der UCL School of Pharmacy und dem britischen Home Office (HO) genehmigt. Alle Tier Arbeit wurde unter HO-Projekt durchgeführt Lizenzen PPL 80/2243 und PPL 70/7773.
1. Ratte Vorbereitung
- Führen Sie alle in vivo Experimente mit keimfreien Wistar neugeborenen Ratten.
- Bewahren Sie alle Ratten Würfe (12 Neugeborenen pro Volk) in Einzelkäfigen mit ihren stillende Mütter (9-11 Wochen alte Weibchen), unter optimalen Bedingungen (19-21 ° C, 45 - 55% Luftfeuchtigkeit, 15 bis 20 Luftwechsel / h und 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus).
2. Bakterienzellpräparation
- Shop E. coli K1 Bestände in 20% (v / v) Glycerin bei -80 ° C. Für jedes Experiment Platte heraus stock Bakterien auf Mueller-Hinton (MH) Agarplatten, und bei 37 ° CO / N.
- Am Tag vor Fütterung, inocuspäten 10 ml MH-Brühe mit einem einzigen E. coli K1 Kolonie und Kultur O / N bei 37 ° C, 200 Upm. Als Kontrolle für mittlere Verunreinigungen, bereiten 10 ml unbeimpften MH-Brühe und bei 37 ° C bei 200 Upm.
- Transfer 100 ul O / N Bakteriensuspension in 9,9 ml MH-Brühe (1: 100 v / v), und bei 37 ° C, 200 rpm, bis zur mittleren exponentiellen Phase erreicht ist, entsprechend einer optischen Dichte von 0,6 bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD 600) gemessen.
3. Fütterung von neugeborenen Ratten mit E. coli K1
- Halten Sie das Tier vertikal in einer Hand aus dem Genick, so dass der Mund zu öffnen. Langsam legen Sie die sterile Pipettenspitze in den Mund des Tieres und Pipette 20 ul des Inokulums (~ 37 ° C) in den Mund des Tieres über einen 30 sec Zeitraum. Bringen Sie das Tier zu seiner Mutter sofort nach der Fütterung.
- Überprüfen Sie, dass 4 - 8 x 10 6 Bakterien wurden gefüttert to jeder Welpe durch serielle Verdünnung des Inokulums in PBS und Spek auf MH-Agar-Platten.
4. Bewertung der Kolonisation durch E. coli K1
- Halten Sie das Tier mit einer Hand aus dem Genick. Befeuchten Sie ein steriles Wattestäbchen in sterilem PBS, und dann sanft Tupfer Perianalbereich. Bringen Sie das Tier zu seiner Mutter unmittelbar nach Abtupfen.
- Legen Sie die Tupferspitze in ein Röhrchen mit 300 ul sterilem PBS und Lagerung auf Eis.
- Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Bakterien durch serielle Verdünnung in PBS und Ausstreichen auf MacConkey-Agar-Platten.
- Bestimmen tragfähige E. coli K1 durch Bakteriophagen Empfindlichkeitsprüfung. Wählen Sie ein Einzelkolonie mit einer sterilen mikrobiologischen Schleife, eingetaucht in 200 ul sterilem PBS, dann unterliegen Wirbelmischung.
- Mit einem sterilen mikrobiologischen Schleife, Subkultur auf MH-Agar in einer geraden Linie. Damit die Platte für 30 Sekunden zu trocknen, und dann Pipette 10 ul bacteriophage K1E (10 9 Plaque bildenden Einheiten / ml (PFU / ml)) auf die Mitte der Linie. Die Platte O / N bei 37 ° C.
- Am nächsten Tag, untersuchen Sie die Platte für Bakteriophagen-vermittelte Lyse.
5. Bewertung der Schwere der Erkrankung
- Beurteilen Sie den Schweregrad der Erkrankung der einzelnen Tiere 4-5 mal täglich mit der Sieben-Punkte-Bewertungssystem in der Tabelle 1 dargestellt.
- Wenn ein Tier Partituren ≥3 von 7 sofort keulen das Tier so lange leiden muss. Nehmen Sie das Tier wie tot.
6. Euthanasie von neugeborenen Ratten und Blutentnahme
- Halten Sie das Tier in der einen Hand, Aussetzen der Kopf und Hals. Desinfizieren Sie den Hals des Tieres durch Abwischen mit einem Alkoholtupfer. Desinfizieren Sie eine große Schere mit 70% Ethanol, vor dem Spülen in sterilem PBS, um Spuren Ethanol zu entfernen.
- Halten Sie das Tier direkt über einer Petrischale. Enthaupten Neugeborenen mit scharfen surgical Schere, um sicherzustellen, dass das Blut tropft in der Petrischale. Kontakt mit dem Kopf, um eine Verunreinigung des Blutes mit Hautflora zu verhindern vermeiden.
- Sofort sammeln das Blut mit einem sterilen Pipette zugeben und mischen mit Heparin-Natriumsalz in einer Konzentration von 20 bis 50 Einheiten / ml in einer 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Bakterien durch serielle Verdünnung in PBS und Ausstreichen auf MacConkey-Agar-Platten. Bestimmen Sie die Anzahl lebensfähiger E. coli K1 durch Testen der Empfindlichkeit von lebensfähigen Bakterien, Bakteriophagen K1E.
7. Dissection
- Nach Enthauptung des neugeborenen Ratten, verwenden aseptischen Bedingungen verbrauch und sammeln Geweben von Interesse. Waschen Sie alle Instrumente (in Abbildung 1 dargestellt) in 70% Ethanol und sterilem PBS.
- Reinigen Sie die Dissektion Bord und benetzen die Leib vollständig mit 70% Ethanol. Positionieren Sie den Leichnam auf seinem Rücken und zu beheben, um die Dissektion Bord durch (i) Pinning die linke Hinterbein zuDie Betriebstabelle mit einer sterilen Nadel, (ii) Strecken der Leiche und Pinning die rechte Vorderbein auf dem Operationstisch, (iii) die Pinning rechten Hinterbein und das linke Vorderbein auf dem Operationstisch.
- Ziehen Sie die Haut an der linken Seite des Unterleibs mit einer Pinzette, dann entlang der linken Seite der Leiche aus dem Unterbauch bis zum Brustbein mit kleinen Dissektion Schere geschnitten.
- Verlängern Sie die Exzision über dem Brustbein, und dann auf der rechten Seite der Leiche vom Brustbein zu den Unterleib mit einer Pinzette und kleine Dissektion Schere, um sicherzustellen, dass keine der zugrunde liegenden Strukturen sind beschädigt.
- Schließlich ziehen Sie vorsichtig nach unten die Hautlappen vom Brustbein zu den Unterbauch mit Iris gekrümmten Dissektion Pinzette auf das Bauchfell aus.
- Heben vorsichtig das Bauchfell mit einer Pinzette und schneiden vertikal um die inneren Organe freizulegen, um sicherzustellen, dass keiner der Basiswerte Organe werden geschädigt.
8. SammelnGI-Trakt
- Identifizieren Sie den Magen, Dünndarm, Blinddarm, Dickdarm und mesenterialen lymphatischen Systems.
- Entfernen Sie den Magen durch leichtes Durchtrennung an beiden Seiten und anschließend in einem Bijou mit 1,6 ml steriler PBS mit einer sterilen Pinzette.
- Transekt den Doppelpunkt am Rektum. Ziehen Sie das gesamte Darmmasse von der Leiche mit Dissektion Pinzette und in einer sterilen Petrischale. Sicherzustellen, dass dies leicht getan, damit der Darmstruktur und mesenterialen Lymphknoten Strukturen nicht trennen.
9. Trennung des GI-Trakts und der mesenterialen Lymphsystem (Abbildung 2)
- Gießen Sie 30 ml steriler PBS in der Petrischale, die Gewährleistung der GI-Trakt vollständig eingetaucht ist.
- Identifizieren Sie die zentrale Masse des mesenterialen lymphatischen Systems, und eine Prise mit feinen Sezierung Pinzette. Identifizieren Sie die meisten proximalen Teil des Dünndarms, und kneifen mit feinen Sezierung Pinzette.
- Ziehen Sie langsam die Central Masse mesenterica Lymphsystem und dem distalen Dünndarm, in entgegengesetzte Richtungen, bis die beiden Gewebe sind vollständig voneinander getrennt. Führen Sie diesen Vorgang mit Sorgfalt, um sicherzustellen, dass der Dünndarm sind nicht gestreckt, da dies verhindert, dass reproduzierbare Sammlung von proximalen, mittleren und distalen Regionen. Platzieren Sie den mesenterialen Lymphsystem in 300-500 ul sterilem PBS und auf Eis.
10. Schnitte des GI-Trakts
- Schneiden den GI-Trakt in den Blinddarm, den Dünndarm aus dem Dickdarm zu trennen.
- Platzieren Sie den Doppelpunkt in 300-500 ul sterilem PBS und auf Eis.
- Sammeln repräsentative Gewebe von proximalen, mittleren und distalen Bereiche des Dünndarms. Richten Sie den Dünndarm aus dem Mittelpunkt.
- Dann, (i) Sammeln der letzten 2 cm des Gewebes vor dem Blinddarm zum distalen Dünndarm, (ii) Sammeln des Gewebes 5-7 cm über dem mittleren Punkt zum proximalen Dünndarm und(Iii) Sammeln des Gewebes von 3 - 5 cm unterhalb des Mittelpunkts zur Mitte des Dünndarms.
11. Das Sammeln der Leber
- Identifizieren der drei Keulen der Rattenleber nach dem Entfernen des Magens.
- Ziehen Lappen weg von der Bauchhöhle mit feinen Sezierung Pinzette.
- Entfernen Sie die Leber durch Schneiden keine Befestigung Bänder mit einer feinen Schere. Zeigen Leber in 300-500 ul sterilem PBS und auf Eis.
12. Das Sammeln der Milz
- Identifizieren Sie die Milz.
- Ziehen Milz vom Magen und verwenden feinen Schere, um die gastro Bänder geschnitten.
- Zeigen Milz in 300-500 ul sterilem PBS und auf Eis.
13. Das Sammeln der Nieren
- Identifizieren die Nieren, die an der Rückseite der Bauchhöhle nach der Entfernung des Magen-Darm-Trakt und anderen Organen sichtbar wird.
- Cut Harnleiter und alle Befestigungsbänder usingen feinen Sezierung Schere und Nieren zu entfernen mit feinen Pinzetten. Entfernen Nebennieren und jede Fettmaterial (falls noch angebracht) mit feinen Pinzetten und Dissektion Schere.
- Legen Sie beide Nieren in 300-500 ul sterilem PBS und auf Eis.
14. Das Sammeln der Hirn
- Nach Enthauptung, halten Sie den Kopf in einer aufrechten Position mit einer gebogenen Pinzette. Pinch Haut auf dem Kopf in Längsrichtung mit einem anderen Satz von gebogenen Pinzette und einen Einschnitt mit feinen Sezierung Schere. Schneiden verbleibende Haut nahe Hals, nochmals in Längsrichtung mit feinen Sezierung Schere.
- Ziehen Sie die Haut in einer Richtung nach außen mit feinen Pinzette auf beiden Seiten, um den Schädel zu offenbaren und zu entfernen Hautlappen mit feinen Sezierung Schere. Zeigen feinen Sezierung Schere in Rückenöffnung und einen Einschnitt entlang der Schädel in Richtung der Tribüne.
- Ziehen Sie die beiden Teile der Schädel in einer Richtung nach außen mit feinen Pinzetten. Schnitt auf Schädelsegmente zu entfernen.
15. Gewebeverarbeitung und Homogenisierung
- Für Experimente erfordern Lebensfähigkeit zählt oder DNA-Extraktion, Ort Geweben in Röhrchen mit sterilem PBS. Die Zahl der lebensfähigen Bakterien sofort feststellen, durch serielle Verdünnung in PBS und Ausstreichen auf MacConkey-Agar-Platten, oder bei -20 ° C mit 20% Glycerin für kurzfristige. Zur DNA-Extraktion, speichern Gewebe bei -20 ° C.
- Für Experimente RNA-Extraktion, Ort Geweben in geeignete Volumina RNAlater Lösung (10 ul pro 1 mg Gewebe) erfordern, dann sofort bei -20 ° C für kurzfristige oder bei -80 ° C Langzeitlagerung.
- Für Experimente Bildgebung bedürftigen Ort Gewebe in 10 ml Methacarn-Lösung (60% Methanol, 30% Chloroform und 10% Essigsäure), dann speichern Sie eint RT (20 - 25 ° C) für bis zu 3 Wochen.
- Berechnen Gewebegewicht durch Vergleich des Gewichts der Rohre vor und nach Zugabe von Geweben. Homogenisieren Gewebe mit einem Homogenisator. Einmal in 70% Ethanol und wasche zweimal den Homogenisator in sterile PBS dazwischen Homogenisierung jeder Probe.
HINWEIS: Methacarn Fixierung ist wünschenswert für die Fixierung von Darmproben, um Mucin bedingte Schleimhautverteidigungsstrukturen zu bewahren; Formalin-Fixierung kann zur systemischen Geweben verwendet werden.
Representative Results
Die E. coli K1 hier beschriebenen systemischen Infektion Modell gibt viele der Funktionen des natürlichen Infektion beim Menschen. Die Bakterien werden eingenommen, besiedeln den GI-Trakt, translozieren in den Blutraum über die mesenterialen Lymphknoten vor der Gründung organspezifische Erkrankung zugeordnet Entzündung des Gehirns 24. Wichtig ist, zeigt das Modell starke Altersabhängigkeit; wie in Figur 3 gezeigt, sind zwei Tage alten (P2) Rattenjungen sehr anfällig für invasive Krankheit, sondern über einen Zeitraum von sieben Tagen werden die Tiere zunehmend resistent gegen eine Infektion, aber nicht Wege Kolonisierung 17 GI. Nach dem Transport von dem Ort der GI Kolonisierung an den Blutabteil, die Bakterien in Blutproben durch Fluoreszenzmikroskopie (4) vor Eintritt in das ZNS vorwiegend im Plexus choroideus 25 visualisiert werden. Bei einigen Tieren gibt es umfangreiche Invasion anderer wichtiger Organe wieLunge, Milz und Niere 25.
Bakterienzahlen im Gewebe im wesentlichen zwischen den einzelnen Welpen 25, jedoch variieren, wenn die Keimbelastung ist entweder vorhanden oder nicht vorhanden ist, gibt es eine hohe Reproduzierbarkeit bei der Organ Invasion erzielt. Mit einem Wurf von 12 Welpen als Einzeltest Kohorte, Stromrechnungen mit G * Power Software ermittelt, dass dieses Stichprobengröße entspricht einer 98,6% Wahrscheinlichkeit, ein Effekt auf das Überleben mit sechs Tieren aus der Kohorte und> 99% Wahrscheinlichkeit, wenn alle zwölf berücksichtigt. Das Modell ist deshalb geeignet zur Beurteilung von neuen Substanzen, die speziell für die Behandlung von bakteriellen Infektionen bei Neugeborenen zugeschnitten und wurde in dem Verfahren verwendet worden, um das therapeutische Potential der Kapsel Depolymerase EndoE die selektiv entfernt die K1-Kapsel von der Bakterienoberfläche 24-26 zu bewerten. Es kann auch verwendet werden, um Host-Bakterien-Interaktionen zu untersuchen, dass die Auswirkungen auf die pat werdenhogenesis von E. coli neuropathogens; In diesem Zusammenhang ist es für die Untersuchung verwendet wurden E. coli A192PP Kolonisierung und Verbreitung. Es hat sich gezeigt, dass E. coli A192PP Zellen bestehen im GI-Trakt von P2, P5 und P9 Welpen in großer Zahl; zeitliche Aspekte der Besiedlung in diesen drei Gruppen sehr ähnlich waren (Figur 5) und spiegelt die Fähigkeit der Bakterien zu replizieren und zu halten Bevölkerungsdichte im Darm.
Die Virulenz des klinischen Isolat A192 wurde durch serielle Passage in neugeborenen Ratten, um wenig oder keine Redundanz der Tiernutzung sicherzustellen verbessert. E. coli besiedelt A192 P2 neonatalen Ratten mit 100% Effizienz, ausgelöst Bakteriämie bei 35% der Tiere und produzierte eine letale Wirkung in 25% 27. Die agiert derivative A192PP kolonisiert den GI-Trakt produziert Bakteriämie und verursacht Letalität in allen P2 Welpen. Somit kann das Modell verwendet, um die Virulenz zu untersuchen different K1-Stämme in Bezug auf ihre Fähigkeit, das ZNS und andere Organsysteme von der Website der Kolonisation einzudringen. In diesem Zusammenhang Pluschke und Mitarbeiter 23 verwendet einen neugeborenen Ratten Infektionsmodell, um die Kapazität 95 zu bestimmen E. coli K1-Stämme menschlichen Ursprungs zu Bakteriämie nach Darmbesiedlung zu verursachen; sie beobachtet große Unterschiede in der Effizienz der beiden Kolonisierung und invasive Fähigkeit, auf denen die klonalen Natur E. coli K1 neuropathogens.
Abbildung 1. Materialien für die Gewebesammlung: (A) Waage, (B) vorgewogen Röhrchen notwendigen Medien, (C) OP-Tisch, Lineal und Nadeln zu fassen das Tier, (D) 70% (v / v) Ethanol und PBS zu sterilisieren die Gewebesammelgeräte,
Figur 2. Trennung des GI-Trakts und der mesenterischen Lymphsystems. (A) Grip die zentrale Masse des mesenterialen Lymphsystem mit feinen Sezierung Pinzette. (B) Grip der proximale Teil des Dünndarms, und ziehen in entgegengesetzte Richtungen. (C) Das GI-Trakt und mesenterialen Lymphsystem vollständig separate. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Überleben der Neugeborenen Rattenjungen zwei Tage (P2) bis neun Tage (P9) im Alter nach oraler Verabreichung von E. coli A192PP, veranschaulicht die starke Altersabhängigkeit der systemischen Infektion. Jede Gruppe stellt 24 Neugeborenen.
Abbildung 4. Fluoreszenzaufnahmen von E. coli A192PP Zellen in einem Blutausstrich von einer P2-pup Infizierten nach oraler Verabreichung von Bakterien. Das Lipopolysaccharid O-Antigen an der Bakterienoberfläche war stmit Kaninchen-Anti-O18 polyklonalen Antikörper und Alexa546-konjugierten Ziege-Anti-Kaninchen-Zweitantikörper ained. Die K1-Kapsel wurde mit EndoE-GFP Reagenz visualisiert. Praktisch alle in Blutproben nachgewiesen Bakterien angezeigt die Schutz K1-Kapsel. Die Bilder wurden von Dr. Andrea Zelmer gefangen genommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. E. coli A192PP Darmbesiedlung nach der Verabreichung des bakteriellen Inokulums. DNA wurde aus Gesamtdarm und E. extrahierten coli K1-Kolonie-bildenden Einheiten / g (KBE / g) durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) bestimmt gezielt den Polysialyl (neuS Gen) Gewebe wie an anderer Stelle beschrieben 17
| Feature | Gesund | Ungesund |
| Farbe der Haut | Rosa | Pale / Gelb |
| Agility (Aufrichtungsreflexes) | Pup kehrt sofort auf rückwärts Platzierung | Schwierigkeit bei der Umkehr rückwärts Platzierung (> 3 s) oder nicht erreichen können |
| Sanfter Druck auf den Unterleib | Kein Ton | Sound of Agitation |
| Magen / Milchleitung | Sichtbare und weiß | Nicht sichtbar |
| Temperatur | Warm | Relativ kalt * |
| Gewicht | Gewinn von 1,5-2 g pro Tag | Keine Gewichtszunahme oder Gewichtsverlust |
| Verhalten, wenn im Käfig | Schritte in Richtung Mutter und beginnt feeding | Kann nicht zur Mutter zu bewegen und zeigt Schwierigkeiten Fütterung |
Tabelle 1. Sieben-Punkte-Bewertungssystem: Die ersten drei aufgeführten Partituren sind in der Regel die beobachteten Anzeichen. * Neugeborenen mit systemischen Infektion Erfahrung erhöhte Körpertemperatur (> 2 ° C). Aufgrund des Mangels an Agilität der Tiere, um ihre Mutter zu erreichen, um die Körpertemperatur zu halten, kann ungesunden Tieren abgetrennten aus dem Wurf geworden und fühlen sich kalt an der bloßen Hand.
Discussion
Die hier beschriebene Tiermodell baut auf früheren Arbeiten, die auf die hervorstechenden Merkmale von natürlich vorkommenden Infektionen beim Menschen reproduzieren sollen. Neugeborenen Ratten wurden zunächst eingesetzt, um das Kinder Meningitis aufgrund H. studieren influenzae Typ b als die Art erfüllt die wichtigsten Kriterien für ein robustes Modell der Infektion. Somit sollte der Eintrittspforte des betreffenden Krankheitserregers der des natürlichen menschlichen Infektion reflektieren und reproduzierbar führen zu ähnlichen Pathologie von ausreichender Dauer, um für eine therapeutische Intervention zu ermöglichen. Die Techniken verwendet werden, nicht die Anwendbarkeit des Verfahrens begrenzt und sollte nicht auf den Krankheitsverlauf 20 bei. Das Modell von H. influenzae Meningitis bei Säugling Ratten durch Moxon und Kollegen entwickelten entspricht diesen Kriterien 20; die natürliche Infektion tritt nach der Kolonisierung der Schleimhäute der oberen Atemwege und dieses wichtige Merkmal wurde in Rattenjungen durch nicht-Trauma replizierttic Instillation der Bakterien auf die Membranen der Nasengänge. Wichtig ist, dass die altersabhängige Natur der Infektion im Modell nachgebildet.
Die gleiche Gruppe waren auch die ersten, um eine nicht-invasive Modell von E. entwickeln coli K1 NBM in der neonatalen Ratten-22. Pathogen-freie Sprague-Dawley-Jungtiere wurden durch Zuführen 10. AUGUST - 10. Oktober Bakterien durch eine Magensonde oral kolonisiert; Das Inokulum wurde daher erheblich höher als die von uns eingesetzten. Besiedlung mit den drei K1-Stämmen untersucht, C94 (O7: K1: H-), EC3 (O1: K1: H-) und LH (O75: K1: H3), trat bei einem relativ hohen Anteil (48-74%) des K1-gefütterten Tieren, aber Fälle von Bakteriämie, Meningitis und Mortalität waren variabel und deutlich niedriger als Raten von Kolonisation. Die klonale Natur E. coli K1 experimentelle Infektion wurde später 23 hergestellt, und es ist nun ersichtlich, dass nur O18: K1 und, in geringerem Maße, O7: K1 sind Serotypen Lagekonsequent verursachen systemische Infektion. Aus diesem Grund wird dieser Untersuchungen der Pathogenese neuropathogenic E. K1-Stamm A192PP: coli K1 wurden auf die Verwendung der Virulenz verstärkte O18 basiert. Ein Vergleich des E. coli K1 Zuführung von neugeborenen Ratten durch eine Magensonde, wie Glode und Kollegen 22 und einer Tröpfchenzufuhrverfahren der Todesfälle mit der früheren Methode, nahezu sicher auf Schäden verwendet werden, wie durch Achtman Gruppe 23 verwendet ergab eine übermäßige Anzahl an Oberflächen von mukosalen Magensonde. Da die Sätze der Kolonisierung sind vergleichbar mit diesen zwei Verfahren ist es empfehlenswert, die weniger invasive Verfahren zum Zuführen der Bakterien mit einer Pipette mit einer sterilen Spitze zu verwenden, wie in dieser Mitteilung beschriebenen.
E. coli-Stamm A192PP in unseren Studien verwendete O18: K1. Es ist ein virulenter Derivat der klinischen Stamm E. coli A192, die ursprünglich von einem Patienten mit Septikämie 27 gewonnen wurde 26 erhalten. Der Stamm löst eine altersabhängige Krankheitsschwere, mit 100% Bakteriämie und Mortalität bei bis 2 Tage alten Tieren 28 verabreicht. Im Gegensatz dazu gibt 9 Tage alten Tieren vollständig resistent gegen Krankheiten. K1-spezifische lytische Bakteriophagen verwendet, um E. differenzieren coli K1 aus anderen E. coli-Stämme 29. In dieser Studie sollte die Anfälligkeit der lebensfähigen Bakterien Bakteriophagen K1E um (i) verwendet werden überprüfen die Reinheit des E. coli K1 Suspensionen hergestellt, die den Tieren zugeführt werden, und (ii) unterscheiden, um E. coli K1 aus anderen Coliformen, um die Lebensfähigkeit in perianalen Tupfer, Blut- und Gewebeproben zu berechnen. Wenn die Kolonie E. coli K1, werden sie anfällig für Bakteriophagen K1E Lyse sein und Bakterienwachstum wird an der Stelle des Bakteriophagen Impfung verhindert werden. Wenn die Kolonie nicht E. coli K1, wird be beständig KIE Bakteriophagen Lyse, und es sollte ein Bereich des Bakterienwachstums an der Stelle der Inokulation Bakteriophagen sein. Es sollte bedacht werden, dass Tiermodelle können alle Funktionen des natürlich vorkommenden Krankheit nicht reflektieren. Das aktuelle Modell kann modifiziert werden, um die Virulenz Merkmale anderer als E. neuropathogenic Bakterien untersuchen coli A192PP und Variationen in der Größe der Kolonisierung Inokulum untergebracht werden können. Zukünftige Anwendungen der Technik könnten die Bewertung von dringend benötigten Medikamenten, um den Zustand zu behandeln und um Details der Wirtsantwort auf Kolonisation und Gewebeinvasion aufzudecken.
Die hier beschriebene Methode ist einfach, aber effektiv. Einzel Würfe von 10-12 Welpen wurden als Test- oder Kontrollgruppen eingesetzt und dies innerhalb-Wurf Ansatz gewährleistet ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit und statistische Gültigkeit. Es ist zwingend notwendig, dass die Welpen in ihre natürliche Mütter so schnell wie möglich nach jeder procedur zurücke und Würfe sollten daher nicht enthalten Tiere unterziehen verschiedene Interventionen. Es ist wichtig, dass die Fed Inokulum erwärmt sonst die Welpen werden die angebotenen Kultur abzulehnen. Die Welpen entwickeln sich schnell eine komplexe Mikrobiota und innerhalb von zwei Tagen nach der Geburt der GI-Trakt ist mit einer breiten Palette von Bakterien aus der als der am häufigsten vorkommenden Mikroben in der Säuglings- und Erwachsenen gut etablierten Stämme besiedelt. Pups, die nicht E. zugeführt haben coli A192PP nicht E. tragen coli K1 im GI-Trakt 17 und damit Bestimmung der Raten der Besiedlung ist relativ einfach. Jedoch basierte die neuS qPCR Verfahren zum Nachweis von E. kolonisierenden coli K1 ist viel empfindlicher, dass die traditionellen Kulturverfahren und wird dringend empfohlen 17.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien G0400268 und MR / K018396 / 1 von der Medical Research Council unterstützt und durch Aktions Medizinische Forschung. Weitere Unterstützung wurde von der National Institute for Health Research University College London Hospitals Biomedizinische Forschungszentrum zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother) |  Harlan, UK |
||
| E. coli K1 A192PP | Taylor lab |
Mushtaq et al. 2004 | |
| Bacteriophage K1E | Taylor lab |
Mushtaq et al. 2004 | |
| Glycerol | Sigma, UK |
G5516 | |
| Mueller-Hinton Agar | Oxoid, UK |
CM0037 | |
| Mueller-Hinton Broth | Oxoid, UK |
CM0405 | |
| MacConkey Agar | Oxoid, UK |
CM0007 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma, UK |
P4417 | |
| Ethanol 100% | Sigma, UK |
E7023 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma, UK |
84020 | Prepare 20 - 50 units/ml |
| RNAlater Solution | Sigma, UK |
R0901 | 10 μl/mg tissue |
| Acetic Acid | Sigma, UK |
320099 | |
| Chloroform | Sigma, UK |
C2432 | |
| Methanol | Sigma, UK |
322415 | |
| Cotton-tipped swabs | Fisher Scientific, UK |
11542483 | |
| Alcotip Swabs | Scientific Laboratory Supplies, UK |
SWA1000 | |
| Petri dishes | Sigma, UK |
P5856 | |
| 30 ml Universal Tube | AlphaLaboratories, UK |
CW3890 | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | StarLab, UK |
I1405-1500 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | StarLab, UK |
I1415-1000 | |
| 0.1 μl calibrated loops | StarLab, UK |
E1412-0112 | |
| L-shaped spreaders | StarLab, UK |
E1412-1005 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific, UK |
10594175 | |
| Forceps straight with fine points | Fisher Scientific, UK |
12780036 | |
| Forceps straight with blunt tips | Fisher Scientific, UK |
12391369 | |
| Forceps watchmaker's curved with very fine points | Fisher Scientific, UK |
12740926 | |
| Scissors straight with very fine points | Fisher Scientific, UK |
12972055 | |
| Laboratory Scissors | VWR, UK |
USBE4251 | |
| 25 G Syringe Needles | Greiner Bio-One Ltd |
N2525 | |
| LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers | PerkinElmer, UK |
L60000BB | |
| Unitemp Incubator | B&T, UK | OP958 | |
| Multitron shaking incubator | INFORS HT, UK |
AJ118 | |
| Ultra-Turrax T-10 homogenizer | IKA Werke |
0003737000 |
References
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