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एक Bioassay रूप गोजातीय Mesenteric धमनी और शिरा की धारा अलग और उपयोग करना छोटी आंत में Vasoactivity के लिए टेस्ट

Published: October 7, 2014 doi: 10.3791/52020
Automatic Translation
1, 1
1Forage-Animal Production Research Unit, USDA-Agricultural Research Service

Summary

छोटी आंत अक्सर रक्त प्रवाह को प्रभावित करने और नकारात्मक पोषक तत्व अवशोषण को प्रभावित कर सकता है कि विषाक्त पदार्थों के संपर्क में है. , यौगिकों या ब्याज के विषाक्त पदार्थों को एक multimyograph और mesenteric धमनी का प्रयोग और नस आइसोलेट्स vasoactivity के लिए जांच की जा सकती है.

Abstract

स्तनधारी जठरांत्र सिस्टम लगातार करने और उस प्रणाली से रक्त के प्रवाह पर असर पड़ सकता है कि यौगिकों (वांछनीय और अवांछनीय) के संपर्क में हैं. छोटी आंत में रक्त के प्रवाह में परिवर्तन अंग के अवशोषण कार्यों पर प्रभाव में परिणाम कर सकते हैं. Fermentative और पाचन प्रक्रिया के माध्यम से feedstuffs से मुक्त विषाक्त पदार्थों में विशेष रुचि उत्पादक क्षमता में सुधार किया जा सकता है, जहां एक क्षेत्र के रूप में जुगाली करने में विकसित किया गया है. इस लेख के साथ जुड़े वीडियो गोजातीय mesenteric धमनी के अलग वर्गों में vasoactivity के लिए और एक multimyograph का उपयोग नस स्क्रीन यौगिकों को विकसित इन विट्रो bioassay वर्णन करता है. रक्त वाहिकाओं घुड़सवार और myograph में equilibrated कर रहे हैं एक बार, bioassay ही इस्तेमाल किया जा सकता है: सिकुड़ा प्रतिक्रिया या ब्याज के यौगिकों की vasoactivity मूल्यांकन करने के लिए एक स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में; औषधीय विशिष्ट एगोनिस्ट साथ रिसेप्टर्स को लक्षित करके रिसेप्टर प्रकार की उपस्थिति निर्धारितएस; एक या एक से अधिक विरोधी की उपस्थिति के साथ एक रिसेप्टर की भूमिका का निर्धारण; या विरोधी के साथ ब्याज की यौगिकों के संभावित बातचीत का निर्धारण. इस सब के माध्यम से, डेटा वास्तविक समय एकत्र कर रहे हैं, एक भी जानवर से एकत्र ऊतक अलग प्रयोगात्मक उपचार की एक बड़ी संख्या (इन विट्रो लाभ) के संपर्क में है, और एक सटीक प्रदान करने के लिए केशिका बिस्तर के दोनों ओर vasculature का प्रतिनिधित्व किया जा सकता है छोटी आंत का समर्थन अभिवाही और अपवाही रक्त की आपूर्ति में हो रहा हो सकता है की तस्वीर.

Introduction

एक ऊतक बिस्तर पर खून के प्रवाह में बदलाव अंग समारोह पर एक बड़ा प्रभाव हो सकता है. छोटी आंत के एक प्राथमिक कार्य पोषक तत्व अवशोषण है. पोषक तत्व अवशोषण और रक्त प्रवाह बढ़ता सतह 1 साथ digesta चाल के रूप में पोषक तत्वों के अवशोषण में सहायता करने के लिए पेट के अवशोषण की सतह को धमनियों से रक्त प्रवाह की आवश्यकता है. रक्त प्रवाह में कमी के कारण transepithelial ढाल 2 में कमी करने के लिए पोषक तत्व अवशोषण में कमी का कारण बन सकता है. पोषक तत्वों के अलावा, छोटी आंत भी अन्त्रपेशी में स्थानीय रक्त प्रवाह पर असर डालती है कि माध्यमिक चयापचयों, दवाओं, या विषाक्त पदार्थों को उजागर किया जा सकता है. जुगाली करनेवाला जानवर के मामले में, यौगिकों एक feedstuff से मुक्त हो सकता है (उदाहरण के लिए, अमीनो एसिड, या ऐसे अरगट alkaloids के रूप में विषाक्त पदार्थों के रूप में पोषक तत्वों) अग्रांत्र के fermentative प्रक्रियाओं के माध्यम से. इन यौगिकों ruminal किण्वन के माइक्रोबियल चयापचय जीवित रहते हैं, वे अब अवशोषण के लिए उपलब्ध हैंया बातचीत में वे जानवर के जठरांत्र संबंधी मार्ग के माध्यम से यात्रा के रूप में.

Vivo में रक्त के प्रवाह को मापने के लिए उपलब्ध विभिन्न तरीकों के एक नंबर रहे हैं (उदाहरण के लिए, डॉपलर अल्ट्रासाउंड, रक्त flowmeters, radiolabeled microspheres, और सूचक-कमजोर पड़ने तकनीक निबाह) विभिन्न प्रयोगात्मक परिदृश्यों या उपचार के मूल्यांकन की अनुमति है. Mulvany और हेल्पर्न 3 तार का उपयोग कर एक तकनीक का वर्णन एक लेख एक myograph में नाड़ी अंगूठी तैयारी घुड़सवार प्रकाशित जब तक हालांकि, संवहनी चिकनी मांसपेशी के यांत्रिक या औषधीय गुणों के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए, विधियों बड़े जहाजों के लिए सीमित रहे. इस तकनीक के विकास के बाद से, संशोधनों ट्यूबलर संरचना के मूल्यांकन के लिए विभिन्न अनुप्रयोगों के विभिन्न प्रकार की अनुमति है कि संबद्ध myograph प्रणाली के लिए किया जाना जारी है. इस प्रणाली को भी जहां छिड़काव बड़े जहाजों 4 बढ़ते के लिए निश्चित की छड़ का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया गया हैतकनीक वांछित नहीं हैं.

पोत और जानवर प्रकार से अलग जानवर की प्रजाति, डेटा से एक ही बर्तन में विभिन्न संरचनात्मक मूल और भेद से जहाजों में असमानताओं को बताया की वजह से आसानी से अलग जहाजों या अलग जानवर प्रकार 5 में यही पोत भर में extrapolated नहीं किया जा सकता. नतीजतन, अलग bioassays विकसित की है और इन पहलुओं को बदल रहे हैं कभी भी मान्य होना चाहिए. हाल ही में कई bioassays saphenous नस और सही ruminal धमनी और शिरा 6,7 पशुओं में इस्तेमाल के लिए इन तकनीकों के साथ पार्श्व विकसित किया गया है.

इस bioassay अरगट alkaloids छोटी आंत समर्थन वाहिका संरचना पर है कि विशेष रूप से प्रभाव की जांच करने के लिए विकसित किया गया था. यह खिलाया alkaloids की 50-60% abomasal सामग्री में दिखाई देते हैं कि सूचना मिली थी, लेकिन केवल 5% मल 8 में बरामद कर रहे हैं. Strickland एट अल. 9, अरगट alkaloids की एक समीक्षा में उपलब्ध है कि डेटा sugg कहास्था छोटी आंत ergopeptine अवशोषण के लिए सबसे महत्वपूर्ण स्थल हो सकता है. एकर्ट एट अल. अरगट alkaloids की 10 की समीक्षा की बायोफर्मासिटिकल पहलुओं और वे उपकला बाधा पार एक बार, अरगट alkaloids अवजत्रुकी नस को या mesenteric नस के माध्यम से और पोर्टल रक्त में लसीका प्रणाली द्वारा या तो ले जाया जाता है कि कहा गया है. रोड्स एट अल. 11 एक उच्च endophyte संक्रमित (उच्च अरगट उपक्षार) आहार लेने steers में एक ग्रहणी में रक्त के प्रवाह में कमी और पेट की सूचना दी. सही ruminal धमनी और शिरा bioassay का उपयोग करना, Foote एट अल. 12 अरगट alkaloids ruminal vasculature में vasoactive हैं कि प्रदर्शन किया. Foote एट अल. 13 बाद में विवो में प्रदर्शन किया है कि एक कम रूमेण उपकला रक्त प्रवाह में अरगट alkaloids परिणामों को ruminal जोखिम. रूमेण के अवशोषण की सतह के लिए रक्त के प्रवाह में यह कमी समन्वित पोषक तत्व (अस्थिर फैटी एसिड) प्रवाह में कमी के कारण होता है. Qu देखते हुएअग्रांत्र से छोटी आंत पर गुजर अरगट alkaloids की antity; यह छोटी आंतों वाहिका संरचना और पोषक तत्व अवशोषण पर एक समान प्रभाव घटित होता धारणा थी कि. इस गोजातीय समीपस्थ ileal mesenteric धमनी और शिरा bioassay का विकास जरूरी.

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Protocol

कोई जीवित पशुओं का इस्तेमाल किया गया है क्योंकि इस अध्ययन में प्रयोग किया जाता प्रक्रियाओं केंटकी पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय से अनुमोदन की जरूरत नहीं थी. इस के साथ साथ प्रयोग किया जाता है किसी भी नमूने के संग्रह के लिए पहले, सभी जानवरों में एक बंदी बोल्ट के साथ दंग रह गए और exsanguinated गया. इस केंटकी विश्वविद्यालय में एक संघ का निरीक्षण वधशाला सुविधा में आयोजित किया गया. USDA खाद्य सुरक्षा एवं निरीक्षण सेवा के एक अधिकारी के प्रतिनिधि के शव का जीना पशु और हैंडलिंग के साथ निपटा है कि सभी गतिविधियों मनाया.

इंस्ट्रुमेंटेशन 1. तैयारी

  1. एक प्रयोग के शुरू करने के ऊतकों के नमूनों के संग्रह के बीच समय की राशि है, की स्थापना उपकरण को कम करने और (अतिरिक्त कर्मियों उपलब्ध हैं, तो इन कार्यों को एक साथ हो सकता है) प्रयोगात्मक ऊतक एकत्रित करने से पहले बफ़र्स तैयार करने के लिए.
    नोट: यह ऊतक प्रयोगों का संचालन करने के लिए व्यवहार्य रहता है कि समय की सबसे बड़ी राशि प्रदान करता है, लेकिन कुछ नहीं केवलइसलिए यह आमतौर पर के रूप में संभव के रूप में जल्दी शुरू करने के लिए वांछनीय है, प्रयोगों को लंबे समय के लिए चला सकते हैं (या एक दिन में कई प्रयोगों को पूरा करने की इच्छा नहीं है).
  2. पावर अप जुड़े कंप्यूटर, डेटा अधिग्रहण उपकरण, (बफर के लिए (ओं)) पानी स्नान और myograph इकाई (एस). Myograph इकाई (एस) पर अंशांकन उपकरण प्लेस और तापमान पूर्व निर्धारित करने के लिए गर्म करने के लिए इकाइयों और अंशांकन उपकरण (37.5 डिग्री सेल्सियस पूर्व निर्धारित) myograph गर्मी पर बारी और अनुमति देते हैं.
    1. कंप्यूटर पर पूर्व में बने चार्ट सॉफ्टवेयर सेटिंग्स फ़ाइल को खोलें और एक रन शुरू (लेकिन डेटा प्राप्त नहीं).
  3. 10 मिनट के लिए उपकरण गरम.
    1. डेटा प्राप्त करने शुरू करो.
    2. सभी चैनलों शून्य.
    3. जाँच करें, और एक प्रमाणित वजन द्वारा आपूर्ति 2-G बल को उस चैनल से जुड़े संबंधित बल transducer से आपूर्ति बिजली संकेत मानकीकृत करने के लिए प्रत्येक चैनल (multimyograph प्रति चैनल 4) पर (यदि आवश्यक हो) अंशांकन आचरण.
    4. अंशांकन और एक इकाइयों रूपांतरण पूरा करने के बाद, ग्राम के रूप में बाद के सभी डेटा स्टोर. प्रत्येक अलग प्रयोगशाला की इच्छाओं पर आधारित तदनुसार बदल; उपकरण और सॉफ्टवेयर ऐसे milliNewtons और वोल्ट के रूप में अन्य इकाइयों के उपयोग की अनुमति.
  4. गैस लाइनों रुकावटों का स्पष्ट हैं कि सुनिश्चित करें और (ओं) इकाइयों myograph के लिए गैस की आपूर्ति (95% 2 हे / 5% सीओ 2) पर बारी. लगातार पूरी प्रक्रिया के दौरान (myograph कक्षों में) सभी बफ़र्स गैस.
  5. 70% इथेनॉल के साथ सभी myograph कक्षों भरें और 10 मिनट के लिए लेना, इथेनॉल हटाने, और एक दूसरे 10 मिनट सोख लिए दोहराएँ.
    1. इथेनॉल हटाने के बाद, कक्षों में बफर के तीसरे अलावा छोड़ने को तैयार बफर (बफर तैयार करने के लिए धारा 2 देखें) के साथ तीन rinses द्वारा पीछा विआयनीकृत पानी के साथ तीन बार कुल्ला.
      नोट: बफर और ऊतक तैयार कर रहे हैं जब तक इस बिंदु पर उपकरण इस राज्य में निष्क्रिय रह सकता है और स्टाफ experimen के साथ आगे बढ़ने के लिए तैयार हैटी.

बफ़र की 2. तैयारी

  1. 11.1 मिमी डी ग्लूकोज की अंतिम सांद्रता को प्राप्त करने के लिए परिवहन और ऊतकों के नमूनों की प्रोसेसिंग में इस्तेमाल के लिए एक 1 एल क्रेब्स-Henseleit बफर समाधान तैयार; 1.2 मिमी 4 MgSO; 1.2 मिमी के.एच. 2 पीओ 4; 4.7 मिमी KCl; 118.1 मिमी NaCl; 3.4 मिमी 2 CaCl; 24.9 मिमी 3 NaHCO.
    1. एक हलचल प्लेट पर विआयनीकृत पानी की लगभग 900 मिलीलीटर में क्रेब्स लवण की 9.6 ग्राम मिलाएं.
    2. वांछित बफर के एल प्रति 2.1 ग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट द्वारा पीछा 0.373 ग्राम कैल्शियम क्लोराइड निर्जलीकरण में मिलाएं.
    3. 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ 20 मिनट के लिए गैस बफर समाधान.
    4. एल और 1 के लिए मात्रा समायोजित, बक के बाद, 7.05 पीएच को समायोजित (अंतिम लक्ष्य 7.4 पीएच होना चाहिए बफर का निस्पंदन पीएच बढ़ जाती है)
    5. फिल्टर का उपयोग के लिए तैयार है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एक स्वच्छ autoclaved 1 एल मीडिया बोतल और दुकान बफर में बफर बाँझ.
  2. अलग क्रेब्स एच तैयारक्रेब्स-Henseleit सिकुड़ना प्रयोगों से संबंधित अतिरिक्त यौगिकों के साथ बफर परिवहन के लिए कदम 2.1 में वर्णित के रूप में myograph प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए enseleit बफर समाधान.
    नोट: आम तौर पर 2 एल इस आलेख में वर्णित प्रयोगों के लिए पर्याप्त होगा, लेकिन यह मात्रा बढ़ या प्रयोग की लंबाई के आधार पर कम होने की जरूरत हो सकती है, myograph कक्षों, और (उपचार परिवर्धन के सापेक्ष) संख्या बफर प्रतिस्थापन की संख्या.
    1. बक कदम (कदम 2.1.3) से पहले, 9.1 मिलीग्राम जोड़ने बफर desipramine एचसीएल की (बफर के एल प्रति तैयार किया जा रहा है).
    2. प्रोप्रानोलोल-एचसीएल के एक 1.0 माइक्रोन समाधान तैयार है और क्रेब्स-Henseleit बफर समाधान करने के लिए इस समाधान के (तैयार किया जा रहा बफर के एल प्रति) 1 मिलीलीटर जोड़ें. उपयोग की दिन पर इस बफर बनाओ और myograph ऑपरेटिंग तापमान (myograph में एक 37.5 डिग्री सेल्सियस तापमान कि पैदावार एक तापमान) में रहते हैं.
      नोट: desipramine biogenic amine अवरोध तंत्र को बाधित करने के लिए जोड़ा हैऔर अधिक तेजी से घटित करने के लिए रक्त वाहिकाओं स्नान बफर से प्रयोगात्मक परिवर्धन के समाशोधन अनुमति देते हैं. प्रोप्रानोलोल के अलावा रिसेप्टर्स एड्रीनर्जिक β को उपचार यौगिकों के बंधन गैर विशिष्ट रोकता है.

3 संग्रह और vasculature की तैयारी

  1. जितनी जल्दी हो सके, शव से जठरांत्र संबंधी मार्ग को हटा दें. पशु अब किसी भी अनैच्छिक पलटा दर्शाती एक बार, सिर को हटाने और छिपाने के लिए और फिर खड़ी शव बढ़ा. शव से जठरांत्र आंत (गुदा के घुटकी) को हटाने को मंजूरी दे दी वधशाला कर्मियों (<20 मिनट समय से तेजस्वी के) द्वारा पूरा किया जाना चाहिए.
    नोट:, आम तौर पर आंत्र पथ मानक संचालन प्रक्रियाओं या सुविधा कर्मियों द्वारा पीछा संघ अनिवार्य प्रक्रियाओं और से एकत्र किया जा रहा है जहां स्थिति / सुविधा द्वारा सीमित है कितनी जल्दी.
    1. सबसे सुविधाओं में जठरांत्र संबंधी मार्ग की जोड़तोड़ का संचालनखाद्य आपूर्ति में प्रवेश के लिए किस्मत में है कि शव के प्रसंस्करण से एक अलग स्थान पर. जठरांत्र संबंधी मार्ग ले लिया है और जांच के लिए बाहर फैल सकता है, जहां पास के एक सुविधाजनक स्थान का प्रयोग करें.
  2. जठरांत्र पथ बाहर फैला हुआ है एक बार, छोटी आंत, अंधान्त्र को छोटी आंत से जोड़ने ileocecal गुना, और ileocecal गुना (चित्रा 1 ए) के लिए समीपस्थ विस्तार ileal निकला हुआ किनारा पहचान.
    1. एक छुरी या चाकू का प्रयोग बहुत हल्के से ileal निकला हुआ किनारा के केंद्र में मेसेंतेरिक झिल्ली में एक चीरा बनाने. दो तर्जनी का प्रयोग, दो टूक mesenteric vasculature (चित्रा 1 बी) को उजागर वसा और संयोजी ऊतक दूर काटना.
  3. आंतों अन्त्रपेशी में इस निकला हुआ किनारा या उभार से, कई शाखाओं काटना (~ लंबाई में 2 सेमी) लघ्वान्त्र (चित्रा 1C) के इस हिस्से का समर्थन करने वाले उजागर mesenteric धमनी और शिरा बंडलों की.
    1. यू तो, ऊतक समझ सीधे समझ या नुकसान और नकारात्मक ऊतक प्रदर्शन 14 लागू कर सकते हैं खींच के किसी भी प्रकार के रूप में उन्हें हटाने के दौरान सब पर रक्त वाहिकाओं पर पुल नहीं करने के लिए देखभाल करने के लिए संदंश गाते हैं. रक्त वाहिका को हटाने का सबसे अच्छा हटा दिया जाना खंड के प्रत्येक के अंत में काटने और उसके बाद अब पृथक खंड के लिए बगल में या समानांतर काटने से किया जाता है. आसानी के लिए, जहाजों संदंश की एक जोड़ी के साथ काबू करने के लिए कुछ ऊतक प्रदान करने के साथ साथ आसपास के ऊतकों में से कुछ को हटा दें.
    2. संदंश की एक जोड़ी के साथ, बर्फ ठंड क्रेब्स-Henseleit बफर युक्त ट्यूब में ऊतक का नमूना डूब और प्रसंस्करण प्रयोगशाला में हो सकता है, जब तक बर्फ पर दुकान.
  4. एक काटने की सतह पर या एक पेट्री डिश में ऊतक का नमूना प्लेस और आंशिक रूप से बर्फ ठंड क्रेब्स-Henseleit में डूब.
    1. गुंजाइश # 5 जौहरी संदंश, Noyes परितारिका कैंची का प्रयोग, और दीपक शीशा या विदारक, ध्यान से आसपास के वसा और connecti दूर काटना (5.0X बढ़ाई 2.5 पर्याप्त है)ऊतकों है और धमनी और शिरा अलग. खंड के एक छोर पर पोत खोलने की पहचान करना और ध्यान से संदंश के साथ पोत के आसपास के प्रावरणी समझ.
    2. कैंची के साथ एक कट उठाया प्रावरणी नीचे कैंची की नोक फिसलने से पोत के समानांतर बनाओ. प्रारंभिक चीरा के बाद, वसा और संयोजी ऊतक आगे कैंची से दोनों ओर कम करके पोत से अलग किया जा सकता है. जहाजों बेंच पर खर्च की गई राशि को कम करते हुए जहाजों यथासंभव साफ कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें.
    3. (नमूने इकट्ठा करने के बाद अप करने के लिए 24 घंटे के लिए भंडारित किया और अभी भी मान्य सिकुड़ना डेटा उत्पादन रह सकता है) 4 डिग्री सेल्सियस पर ताजा क्रेब्स-Henseleit बफर और दुकान की ट्यूबों के लिए रक्त वाहिकाओं लौटें.
    4. एक रेजर ब्लेड का प्रयोग, टुकड़ा पोत 2 मिमी वर्गों की वांछित संख्या में myograph में प्रयोग की जाने वाली (यह सुसंगत पार वर्गों प्राप्त करने के लिए एक ऊतक slicer उपयोग करने के लिए उपयोगी है).
    5. एक विदारक शंघाई सहयोग संगठन के तहत प्रत्येक खंड की जांचपीई (12.5X बढ़ाई) प्रत्येक अनुभाग अनजाने विच्छेदन और सफाई के दौरान किया कोई असामान्यताएं, शाखाओं, वाल्व, या सतही नुकसान है कि यह सुनिश्चित करने के लिए. किसी भी विषमता, शाखा, वाल्व, या सतही क्षति है कि अगर वहाँ पोत खंड बदलें.
  5. Myograph कक्षों (आमतौर पर <30 मिनट) में बढ़ते के लिए तैयार है जब तक सी बर्फ पर या 4 डिग्री पर (क्रेब्स-Henseleit बफर में डूबे हुए) स्टोर स्वीकार्य कटा पोत वर्गों.
  6. धीरे लुमेन के माध्यम से समर्थन करता डालने से myograph पर पोत माउंट और एक 2 से 3 जी पढ़ने ऊपर जहाजों खिंचाव नहीं करने के लिए सावधान किया जा रहा है (myograph पर micropositioner का उपयोग) तनाव में वृद्धि.
  7. सभी कक्षों कवर कर रहे हैं एक बार, सभी कक्षों से बफर निर्वात और बफर के 5.0 मिलीलीटर के साथ फिर से भरना और संतुलन अवधि और प्रयोग शुरू करने के लिए एक 15 मिनट टाइमर शुरू.

4 प्रयोग

  1. एक स्थिर जोड़कर प्राप्त करने के लिए 1.5 घंटे के लिए सभी पोत वर्गों संतुलित करना1.0 ग्राम का ting तनाव.
    1. क्रेब्स-Henseleit ऊष्मायन बफर हर 15 मिनट बदलें.
    2. संतुलन के दौरान लगातार 2 जी के लिए रक्त वाहिका वर्गों पर तनाव को समायोजित करने और फिर लगभग 0.80 ग्राम से नीचे आराम करने के लिए अनुमति देते हैं. जहाजों (वे आरोह बंद पर्ची सकता है) बहुत अधिक आराम करने के लिए अनुमति देने के लिए नहीं की कोशिश करें. पोत समायोजन की आवश्यकता के बिना 1 ग्राम तनाव रखती है जहां एक स्थिर आधारभूत तनाव, को प्राप्त करने का प्रयास करें.
  2. संतुलन के दौरान, KCl का एक जलीय 1.32 एम समाधान के लिए एक संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार करते हैं.
  3. एक संतोषजनक संतुलन के पूरा होने के बाद, पोत स्नान 5.5 मिलीलीटर समाधान में एक 0.12 एम समाधान में परिणाम के लिए 1.32 एम KCl समाधान के 500 μl जोड़ें.
    1. इस के अलावा से अधिक से अधिक प्रतिक्रिया ऊतक व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है और एक एक के लिए (उपचार डेटा मानक के अनुसार जैसे एकाग्रता प्रतिक्रियाओं का इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में मैन्युअल तनाव को समायोजित नहीं है, 1.32 एम KCl के अलावा के बादgonist).
    2. तनाव 1.0 ग्राम के आधारभूत मूल्य के लिए वापस आ गया है जब तक 15 मिनट के अंतराल में बफर बदलें.
  4. आधारभूत पहुँच जाता है एक बार, बफर बदलने के लिए और एक साथ एक 1 मिनट टाइमर शुरू करते हैं. शुरुआत टाइम्स का एक चक्कर से बचने के लिए एक साथ सभी कक्षों के लिए यह करो.
    1. जोड़े जाने के लिए मानक भंवर और 1 मिनट की उलटी गिनती के दौरान कक्ष 1 के लिए एक टिप्पणी तैयार करते हैं.
    2. (यह कुल मात्रा का 0.5% नीचे उपचार रहता है) प्रयोग तय कर के रूप में प्रत्येक कक्ष के लिए 25 μl aliquots में मानकों जोड़ें.
    3. पिछले मानक जोड़ दिया गया है, जब एक 9 मिनट टाइमर शुरू.
    4. 9 मिनट मानक ऊष्मायन के अंत में, कक्षों से उपचार युक्त बफर हटाने और ताजा बफर के 5.0 मिलीलीटर जोड़ने, और 2.5 मिनट टाइमर शुरू.
    5. दोहराएँ कदम 4.4.4.
    6. दूसरा 2.5 मिनट कुल्ला के अंत में, कक्षों निर्वात और ताजा बफर जोड़ने, और secon के प्रारंभ उलटी गिनती करने के लिए एक 1 मिनट टाइमर शुरूडी मानक अलावा.
  5. दिन के मानक परिवर्धन के सभी के लिए इस चक्र जारी है.
  6. अंतिम मानक अलावा और बाद 9 मिनट ऊष्मायन के दौरान 500 μl के रन संदर्भ खुराक अलावा के लिए एक अंत के लिए 1.32 एम KCl संदर्भ यौगिक तैयार करते हैं.
  7. अंतिम उपचार के बाद इसके अलावा 1 मिनट के अंतराल के बाद, KCl जोड़ सकते हैं और एक 9 मिनट टाइमर शुरू.
    नोट: KCl इसके प्रयोग के समापन पर ऊतक व्यवहार्यता की पुष्टि के लिए है और नगण्य जवाब में यह परिणाम है कि एक उपचार का प्रबंध अगर मददगार है.
  8. अंतिम 9 मिनट संदर्भ यौगिक ऊष्मायन के समापन पर, वैक्यूम या कक्षों की सब से बफर हटा दें. ताजा बफर न जोड़ें. प्रयोग समाप्त.
  9. , चार्ट फ़ाइल सहेजें रक्त वाहिका वर्गों को हटाने और ठीक से निपटाने, और साफ प्रोटोकॉल का पालन (निर्माता द्वारा उपलब्ध कराई गई और प्रयोगशाला विशिष्ट किया जा सकता है) myograph उपकरण के लिए.

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Representative Results

शामिल परिणाम उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया रक्त वाहिकाओं एक 3 सप्ताह के अंतराल के भीतर 6 हॉल्स्टीन steers (425 ± 8 किलो) से एकत्र किए गए थे. KCl और एकाग्रता में वृद्धि उपचार परिवर्धन के लिए एक ठेठ mesenteric नस सिकुड़ा प्रतिक्रिया का एक उदाहरण प्रतिक्रिया की भयावहता (दाता जानवर के आकार के साथ सहसंबद्ध) पोत के आकार के साथ कुछ अलग होंगे. चित्रा 2 में प्रस्तुत किया है, लेकिन यह भी कर सकते हैं अनुचित हैंडलिंग द्वारा (नकारात्मक) प्रभावित हो संग्रह और सफाई के दौरान जहाजों की (खींच). इसलिए, यह KCl के लिए जहाजों जोखिम में एक महत्वपूर्ण सिकुड़ा प्रतिक्रिया निरीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक नगण्य प्रतिक्रिया इस बात पर मनाया जाता है, यह है कि पोत के साथ प्रक्रिया में किसी भी आगे बढ़ने के लिए उचित नहीं है. चित्रा 2 में 9 मिनट ऊष्मायन अवधि में देखा, बढ़ती सांद्रता के साथ संगत जवाब में वृद्धिशील बढ़ जाती है वहाँ हैं. इस खास के लिए वांछनीय यद्यपिular प्रयोगात्मक डिजाइन, यह हमेशा नहीं हो सकता है या अन्य उपचार के साथ के बाद मांगी जा. एकत्र डेटा की प्रोसेसिंग में इस्तेमाल नहीं किया हालांकि पोत से किसी को जवाब नहीं है अगर यह (प्रयोगात्मक अवधि के समापन पर ऊतक की व्यवहार्यता की पुष्टि करता है और अधिक महत्वपूर्ण हो जाता है के रूप में प्रयोग के समापन पर KCl अलावा, बहुत महत्वपूर्ण है, उपचार परिवर्धन के).

चित्रा 2 में प्रस्तुत आंकड़ों तनाव के ग्राम में दर्ज हैं. यह किसी भी पशु करने वाली पशु और पोत करने वाली पोत भिन्नता को कम करने के लिए इन आंकड़ों को सामान्य करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रकार, व्यवहार्यता का एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है, इसके अलावा में अधिकतम KCl प्रतिक्रिया उपचार परिवर्धन के सभी मानक के अनुसार किया जाता है. इस KCl अधिकतम के प्रतिशत के रूप में सिकुड़ा प्रतिक्रिया डेटा उत्पन्न करता है. यह 5 hydroxytryptamine की बढ़ती एकाग्रता के लिए कैसे mesenteric धमनी और शिरा प्रतिक्रिया घटता है (सेरोटोनिन, चित्रा 3) और norepinephrine (

5 hydroxytryptamine (चित्रा 3) और norepinephrine (चित्रा 4) दोनों को mesenteric नस प्रतिक्रिया के रूप में नकारात्मक मूल्यों बाहर शुरू कर दिया. यह प्रारंभिक KCl इसके लिए पहले दर्ज की आधारभूत तनाव से प्रत्येक 9 मिनट ऊष्मायन अवधि के दौरान दर्ज की अधिकतम तनाव से निजात पाने का एक परिणाम है. इस आधारभूत सुधार तनाव में किसी भी मामूली अंतर विश्लेषण में शामिल है और प्रस्तुत आंकड़ों तनाव में केवल एक परिवर्तन को प्रतिबिंबित करने की अनुमति नहीं कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करता है. आराम और बाद में इलाज के अलावा पहले पूर्व KCl आधारभूत स्तर से नीचे गिर रक्त वाहिका से नकारात्मक मूल्य का परिणाम है. इस उपचार या एगोनिस्ट की प्रारंभिक सांद्रता एक सिकुड़ा प्रतिक्रिया पैदा करने के लिए बहुत कम हैं, जहां शिरापरक नमूनों में विशेष रूप से आम है. यह मेरे लिए मामला नहीं था पोत उपचार परिवर्धन के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए शुरू किया जब तक आधारभूत ऊपर तनाव का आयोजन किया जिसमें biogenic amine, या तो senteric धमनी प्रतिक्रिया. यह अंतर या तो केशिका बिस्तर के किनारे और क्यों वे दोनों इस bioassay के हिस्से के रूप में माना जाता था पर जहाजों में मतभेद मिसाल है.

इस bioassay छोटी आंत में पोषक तत्वों के साथ ही छोटी आंत से दूर अवशोषित पोषक तत्वों को ले जाने रक्त वाहिकाओं की आपूर्ति रक्त वाहिकाओं पर यौगिकों की vasoactivity का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. आंकड़े 3 और 4 में डेटा यह पूरा किया जा सकता है कि कैसे सरल उदाहरण हैं. 5 hydroxytryptamine (चित्रा 3) के मामले में, धमनी या शिरा सिकुड़ा प्रतिक्रिया में कोई अंतर नहीं था. इसके विपरीत, norepinephrine की सांद्रता बढ़ाने के लिए mesenteric नस से सिकुड़ा प्रतिक्रिया mesenteric धमनी की तुलना में अधिक था.

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चित्रा 1:. मेसेंतेरिक रक्त वाहिकाओं के स्रोत के रूप में इस्तेमाल गोजातीय आंत्र पथ का एक उदाहरण लाल तारांकन संदर्भ का एक बिंदु के रूप में सभी तीन फलकों में ileocecal गुना के दृश्य भाग इंगित करता है. (ए) vasculature की सैंपलिंग हुई जहां ileal निकला हुआ किनारा का संकेत लाल अंडाकार साथ पूरे पथ. मेसेंतेरिक संवहनी बिस्तर (बी) एक्सपोजर. (सी) परितारिका कैंची mesenteric नस (दृश्य) और धमनी (दिखाई नहीं) संग्रह के लिए सिर्फ पूर्व की एक उजागर शाखा की ओर इशारा कर रहे हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2: norepinephrine की बढ़ती सांद्रता के एक mesenteric नस की एकाग्रता प्रतिक्रिया का उदाहरण (1 × 10 -7 1× 10 -4 एम). ट्रेस की शुरुआत और अंत में बड़ी घटनाओं 0.12 एम KCl परिवर्धन के लिए प्रतिक्रिया कर रहे हैं. लाल आयत प्रत्येक उपचार अलावा के लिए 9 मिनट ऊष्मायन अवधि इसी के साथ डेटा संग्रह क्षेत्र का प्रतीक है. इस का पालन करें कि 3 पतला spikes बफर प्रतिस्थापन द्वारा उत्पन्न कलाकृतियों हैं और विश्लेषण में शामिल नहीं हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3: mesenteric धमनी (एमए) और नस की सिकुड़ा प्रतिक्रियाओं मीन (एमवी, n = 6 steers) 5 hydroxytryptamine (सेरोटोनिन) की बढ़ती सांद्रता के एक sigmoidal के लिए डेटा फिट करने के लिए गैर रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण का उपयोग उत्पन्न किया गया दिखाया लाइन्स. एकाग्रता Response निम्न समीकरण का उपयोग किया जो वक्र: Y = नीचे + [(ऊपर - नीचे) / (1 ​​+ 10 (logEC 50 - एक्स))], ऊपर और नीचे के पठारों में 120 मिमी KCl अधिकतम सिकुड़ा प्रतिक्रिया का प्रतिशत कर रहे हैं, जहां और चुनाव आयोग 50 KCl अधिकतम प्रतिक्रिया का 50% उत्पादन उपक्षार की दाढ़ एकाग्रता है.

चित्रा 4
चित्रा 4: mesenteric धमनी (एमए) और नस की सिकुड़ा प्रतिक्रियाओं मीन (एमवी, n = 6 steers) norepinephrine की सांद्रता बढ़ाने के लिए उपयोग किया है जो एक sigmoidal एकाग्रता प्रतिक्रिया वक्र के लिए डेटा फिट करने के लिए गैर रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण का उपयोग उत्पन्न किया गया दिखाया लाइन्स. निम्नलिखित समीकरण: Y = नीचे + [(ऊपर - नीचे) / (1 ​​+ 10 (logEC 50 - एक्स))], ऊपर और नीचे 120 मिमी KCl अधिकतम सी का प्रतिशत हैं जहांपठारों पर प्रतिक्रिया ontractile, और चुनाव आयोग 50 KCl अधिकतम प्रतिक्रिया का 50% उत्पादन उपक्षार की दाढ़ एकाग्रता है.

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Discussion

इस bioassay के विकास में प्रारंभिक चुनौती mesenteric vasculature के लिए एक repeatable संग्रह साइट की स्थापना की थी. लघ्वान्त्र और फलस्वरूप अन्त्रपेशी के माध्यम से सूखेपन से प्रगति के दौरान छोटी आंत परिवर्तन के कार्यों में से कुछ एक समान पैटर्न में भिन्नता के रूप में नमूना साइट स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण है. mesenteric धमनी और शिरा के ileal शाखाओं सबसे आसानी से पहचान शारीरिक स्थलों के माध्यम से थे. अंधान्त्र लगाने और अन्त्रपेशी के बाईं ओर अपने टर्मिनस तक ileocecal गुना का अनुसरण करके इस कपाल mesenteric धमनी 15 की समाप्ति के निकट है. अब अन्त्रपेशी के क्षेत्र और ileocecal गुना का विस्तार (गोजातीय पशु के लिए अद्वितीय) बहुत repeatable कई जानवरों भर में 16 बनाया नमूने (निकला हुआ किनारा कहा जाता है). बनाया जा सकता है कि बड़े नुकसान से एक bioassay के इस चरण में है. मैकेनिकल खींच बाद पोत पी पर एक बड़ी नकारात्मक प्रभाव पड़ता हैerformance 14 और शोधकर्ता जरूरत से ज्यादा हटाने और बाद में सफाई के दौरान चालाकी या फैला रहे हैं कि जहाजों संदर्भ यौगिक प्रयोग किया जा रहा करने के लिए जवाब नहीं होगा नोटिस जाएगा. इस दुर्भाग्य से वास्तव में एक कार्यात्मक स्तर और विश्वसनीय डेटा की पीढ़ी के लिए आगे नहीं माना जाना चाहिए KCl का जवाब नहीं है कि जहाजों पर संवहनी तैयारी की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए एक ही रास्ता है.

इस के साथ साथ प्रस्तुत अंतिम विधि के लिए नेतृत्व किया है कि दो अन्य विधि मान्यता कदम () नहीं दिखाया संदर्भ यौगिकों और 24 घंटा भंडारण निम्न रक्त वाहिकाओं की व्यवहार्यता का परीक्षण के रूप में अन्य रसायनों का उपयोग कर रहे थे. Norepinephrine और सेरोटोनिन संदर्भ यौगिकों के रूप में मूल्यांकन, लेकिन उन्हें सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा करने के लिए mesenteric धमनी और शिरा से प्रतिक्रियाओं पोत प्रकार भर में और जानवरों में भी चर रहे थे. इसके विपरीत, 120 मिमी KCl के अलावा दोनों धमनी और शिरा तैयारी भर में एक बहुत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रतिक्रिया में हुई. एकlso, धमनी और शिरा प्रतिक्रियाओं संग्रह के दिन मूल्यांकन किया और 24 घंटे बाद संग्रह संघर्ष शुरू और धमनी या शिरा या तो द्वारा एगोनिस्ट प्रतिक्रिया में कोई मतभेद थे. वहाँ लागू किया जा सकता है कि उपचार (या विभिन्न उपचार संयोजनों) की एक बड़ी संख्या में अक्सर होते हैं, लेकिन शोधकर्ताओं myograph और समय पर अंतरिक्ष द्वारा सीमित हैं, क्योंकि यह bioassay का एक महत्वपूर्ण पहलू था. संग्रह से 24 घंटा बाहर व्यवहार्यता की अवधि का विस्तार करके, अतिरिक्त प्रयोग के लिए समय काफी वृद्धि हुई है.

शोधकर्ता इस bioassay के लिए लागू उपचार संरचना का लचीलापन को समझने के लिए यह महत्वपूर्ण है. एक शोधकर्ता Klotz एट अल के मामले में वह या वह लंबे समय से जीवविज्ञान प्रासंगिकता के कुछ नियंत्रित करने के क्रम में या एक इलाज के रूप में करने के लिए रक्त वाहिकाओं को उजागर करने में दिलचस्पी है कि ऊष्मायन बफर करने के लिए किसी भी यौगिक (जोड़ सकते हैं. 17, इस के साथ किया गया था पार्श्व saphenous नसों लगातार KE से अवगत करायाब्याज की एक सेरोटोनिन रिसेप्टर नाराजगी जो tanserin,). मेसेंतेरिक रक्त वाहिकाओं एक सिकुड़ा प्रतिक्रिया प्रयोग का आयोजन करने से पहले ब्याज की एक परिसर के साथ pretreated किया जा सकता है. bioassay, प्रस्तुत रूप में, एगोनिस्ट के रूप में अरगट alkaloids पर और नाड़ी की प्रतिक्रिया 18 प्रभावित अरगट alkaloids से पहले आहार जोखिम है कि क्या देख एक संचयी एकाग्रता प्रतिक्रिया प्रयोग आचरण करने के लिए डिजाइन किया गया था. प्रतिनिधि परिणाम इस विधि एक औसत दर्जे का संवहनी प्रतिक्रिया का उत्पादन कर सकते हैं और केवल चार सांद्रता इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि प्रदर्शित करता है. Egert एट अल. 18 के मामले में, एक प्रतिक्रिया वक्र का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल करने के लिए 10 अलग अलग सांद्रता थे. इस पद्धति समय की एक छोटी सी खिड़की में एक भी पशु से अलग यौगिकों या रक्त वाहिकाओं पर रिसेप्टर्स की एक बड़ी संख्या का मूल्यांकन करने के लिए एक रास्ता है.

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Disclosures

व्यापार नाम, मालिकाना उत्पाद, या निर्दिष्ट उपकरण का उल्लेख यूएसडीए ने एक गारंटी या वारंटी का गठन नहीं है और उपलब्ध हो सकता है कि अन्य उत्पादों का बहिष्कार करने के लिए अनुमोदन संकेत नहीं करता है.

Acknowledgments

लेखकों के साथ साथ उपयोग प्रयोगात्मक ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए अवसर उपलब्ध कराने के लिए रयान चैपलिन और केंटकी मीट लैब और पशु और खाद्य विज्ञान विभाग के विश्वविद्यालय के डॉ ग्रेग Rentfrow स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Multi Myograph Danish Myo Technologies 610M A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice. 
Powerlab 8/sp ADIntruments ML785
LabChart 7 ADInstruments Version 7
Force Calibration Kit Danish Myo Technologies 100055 Specific to DMT myographs
Bottle-top Filter Nalgene 595-4520 0.22 μm pore size; 45 mm neck size
#5 Jewler’s Forceps Miltex 555008FT Any brand of forceps can be used
Noyes Iris Scissors Miltex 18-1510 Any brand of scissors can be used
Dissecting Scope Zeiss Stemi 2000-C Any brand of dissecting light microscope will suffice
Adjustable Tissue Matrice Braintree Scientific TM C12 This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly
Krebs-Hensleit Buffer Sigma-Aldrich K3753-10x1L It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house
Calcium chloride dehydrate Sigma-Aldrich C7902-500G
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761-500G
Desipramine-HCl Sigma-Aldrich D3900-5G
Propranolol-HCl Sigma-Aldrich P0884-1G
KCl Sigma-Aldrich P9333-500G
95% O2/5% CO2 Scott Gross UN3156

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References

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चिकित्सा अंक 92 रक्त प्रवाह गोजातीय mesenteric धमनी mesenteric नस छोटी आंत vasoactivity वाहिकासंकीर्णन
एक Bioassay रूप गोजातीय Mesenteric धमनी और शिरा की धारा अलग और उपयोग करना छोटी आंत में Vasoactivity के लिए टेस्ट
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Klotz, J. L., Barnes, A. J.… More

Klotz, J. L., Barnes, A. J. Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine. J. Vis. Exp. (92), e52020, doi:10.3791/52020 (2014).

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