Summary
El intestino delgado se expone frecuentemente a las toxinas que pueden influir en el flujo sanguíneo y afectar negativamente a la absorción de nutrientes. El uso de una arteria multimyograph y mesentérica y la vena aislados, compuestos o toxinas de interés puede ser examinado para vasoactividad.
Abstract
Sistemas digestivo de los mamíferos están constantemente expuestos a compuestos (deseables e indeseables) que pueden tener un efecto sobre el flujo de sangre hacia y desde ese sistema. Los cambios en el flujo de sangre al intestino delgado puede resultar en efectos en las funciones de absorción del órgano. Especial interés en las toxinas liberadas de los piensos a través de procesos fermentativos y digestivos en rumiantes ha desarrollado como un área donde las eficiencias productivas se podrían mejorar. El vídeo asociado con este artículo se describe un bioensayo in vitro desarrollado para seleccionar compuestos para vasoactividad en aislados secciones transversales de la arteria mesentérica bovina y la vena utilizando un multimyograph. Una vez que los vasos sanguíneos se montan y se equilibraron en el myograph, el propio bioensayo se puede utilizar: como una herramienta de detección para evaluar la respuesta contráctil o vasoactividad de compuestos de interés; determinar la presencia de tipos de receptores por la orientación farmacológicamente receptores con agonista específicos; determinar el papel de un receptor con la presencia de uno o más antagonistas; o determinar las posibles interacciones de los compuestos de interés con los antagonistas. A través de todo esto, se recogen datos en tiempo real, el tejido recogido de un solo animal puede ser expuesto a un gran número de diferentes tratamientos experimentales (una ventaja in vitro), y representa la vasculatura a cada lado de la cama capilar para proporcionar una precisa imagen de lo que podría estar sucediendo en la aferente y eferente suministro de sangre apoyar el intestino delgado.
Introduction
Las alteraciones en el flujo de sangre a un lecho de tejido pueden tener un gran impacto en la función del órgano. Una función principal del intestino delgado es la absorción de nutrientes. Se requiere el flujo de sangre arterial a la superficie de absorción del intestino para absorción aumenta y el flujo sanguíneo de nutrientes para ayudar en la absorción de nutrientes como la digesta se mueve a lo largo de la superficie 1. Una disminución en el flujo sanguíneo puede causar una reducción en la absorción de nutrientes debido a una disminución en el gradiente transepitelial 2. Además de los nutrientes, el intestino delgado también puede estar expuesto a metabolitos secundarios, drogas o toxinas que ejercen un efecto sobre el flujo de sangre localizada en el mesenterio. En el caso de que el animal rumiante, los compuestos pueden ser liberados de un pienso (por ejemplo, nutrientes tales como aminoácidos, o toxinas tales como alcaloides del cornezuelo del centeno) a través de procesos fermentativos del intestino anterior. Si estos compuestos sobreviven el metabolismo microbiano de la fermentación ruminal, que ahora están disponibles para la absorcióno la interacción a medida que viajan a través del tracto gastrointestinal del animal.
Hay un número de diferentes métodos disponibles para medir el flujo sanguíneo in vivo (por ejemplo, el ultrasonido Doppler, medidores de flujo de sangre mora, microesferas radiomarcadas, y técnicas de indicador de dilución) que permiten la evaluación de diversos escenarios o tratamientos experimentales. Sin embargo, para obtener información con respecto a las propiedades mecánicas o farmacológicas de músculo liso vascular, los métodos fueron limitadas a los grandes buques hasta Mulvany y Halpern 3 publicaron un artículo que describe una técnica que utiliza alambre montado preparaciones anillo vascular en un myograph. Desde el desarrollo de esta técnica, las modificaciones se siguen realizando a los sistemas Myograph asociados que permiten una variedad de aplicaciones diferentes para la evaluación de las estructuras tubulares. El sistema también se ha adaptado para utilizar varillas fijas para el montaje de los buques más grandes 4, donde la perfusióntécnicas no son deseados.
Debido a diferencias en los vasos de diferentes orígenes anatómicos y distinciones en los mismos buques de diferentes especies de animales, datos de buque y tipo de animal no puede ser fácilmente extrapolado a través de diferentes embarcaciones o el mismo recipiente en diferentes tipos de animales 5. En consecuencia, los bioensayos separados deben ser desarrollados y validados en cualquier momento se cambian estos aspectos. Recientemente, varios bioensayos se han desarrollado con estas tecnologías para el uso en el ganado lateral vena safena derecha y la arteria y la vena ruminal 6,7.
Este bioensayo se desarrolló para investigar específicamente los efectos que tienen los alcaloides del ergot en la vasculatura de soporte del intestino delgado. Se informó de que el 50-60% de alcaloides alimentados aparece en el contenido del abomaso, pero sólo el 5% se recuperó en las heces 8. Strickland et al. 9 declaró en una revisión de los alcaloides del cornezuelo de centeno, que PV datos disponiblesest que el intestino delgado puede ser el sitio más importante para la absorción Ergopeptine. Eckert et al. 10 aspectos biofarmacéuticos crítica de alcaloides del cornezuelo de centeno y afirmaron que una vez que cruzan la barrera epitelial, alcaloides del cornezuelo de centeno se transporten, bien por el sistema linfático a la vena subclavia o por medio de la vena mesentérica y en la sangre portal. Rhodes et al. 11 reportó una disminución del flujo sanguíneo hacia el duodeno y el colon en novillos que consumen una (alta de alcaloides del cornezuelo de centeno) dieta alta endofito infectadas. Usando el bioensayo de la arteria y la vena ruminal derecho, Foote et al. 12 demostraron que los alcaloides del ergot son vasoactivos en la vasculatura ruminal. Foote et al. 13 posteriormente demostraron in vivo que la exposición a los alcaloides del cornezuelo de centeno ruminal resultados en un rumen disminución del flujo sanguíneo epitelial. Esta disminución en el flujo sanguíneo a la superficie de absorción del rumen de forma concomitante causó una reducción en nutrientes (ácidos grasos volátiles) de flujo. Dada la quantity de alcaloides del cornezuelo de centeno que pasan en el intestino delgado del intestino anterior; se planteó la hipótesis de que se produzca un efecto similar en la pequeña vasculatura intestinal y la absorción de nutrientes. Esto requirió el desarrollo de la bioensayo arteria mesentérica y vena ileal proximal bovina.
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Protocol
Los procedimientos utilizados en este estudio no requieren la aprobación de la Universidad de Kentucky Cuidado de Animales y el empleo Comisión porque no se utilizaron animales vivos. Antes de la recolección de cualquier muestra utilizada en este documento, todos los animales fueron aturdidos con perno cautivo y se desangraron. Esto se llevó a cabo en una instalación de matadero inspección federal en la Universidad de Kentucky. Un representante oficial de la Seguridad e Inspección de los Alimentos del USDA observó todas las actividades que se ocupan de los animales vivos y la manipulación de la canal.
1 Preparación de Instrumentación
- Para minimizar la cantidad de tiempo entre las colecciones de muestras de tejido para el inicio de un experimento, fije el equipo y preparar tampones antes de recoger el tejido experimental (o si el personal adicionales están disponibles, estas tareas pueden ocurrir simultáneamente).
NOTA: Esto no sólo proporciona la mayor cantidad de tiempo que el tejido permanece viable para llevar a cabo experimentos, pero algunosexperimentos pueden correr durante largos períodos de tiempo (o si hay un deseo de completar múltiples experimentos en un día), por lo tanto, suele ser conveniente empezar tan pronto como sea posible. - Encienda el ordenador asociado, equipos adquisiciones de datos, baño de agua (para el tampón (s)) y myograph unidad (s). Coloque el equipo de calibración en la unidad (s) myograph y encienda el calor myograph (predefinido a 37,5 ° C) y permitir que las unidades y equipos de calibración para calentar para preestablecer las temperaturas.
- Abra un archivo de configuración de software gráfico creado anteriormente en el equipo y empezar una carrera (pero no la adquisición de datos).
- Caliente el equipo durante 10 minutos.
- Iniciar la adquisición de datos.
- Cero todos los canales.
- Compruebe, y llevar a cabo la calibración (si es necesario) en cada canal (4 canales por multimyograph) para estandarizar la señal eléctrica suministrada desde el transductor de fuerza respectiva asociada a ese canal a una fuerza de 2 g suministrada por un peso certificado.
- Una vez completados calibración y una conversión de unidades, almacenar todos los datos posteriores como gramos. Cambie en consecuencia sobre la base de los deseos de cada laboratorio independiente; el equipo y el software permiten el uso de otras unidades, tales como miliNewtons y voltios.
- Asegúrese de que las líneas de gas están libres de obstrucciones y abra el suministro de gas (95% O 2/5% CO 2) a Myograph (s) unidades. Gas continuamente todos los tampones (en las cámaras Myograph) durante todo el procedimiento.
- Rellene todas las cámaras Myograph con etanol al 70% y en remojo durante 10 minutos, retirar el etanol, y repita para un segundo 10 minutos en remojo.
- Tras eliminación del etanol, enjuáguese la boca tres veces con agua desionizada, seguido de tres lavados con tampón preparada (vea la Sección 2 para la preparación de buffer), dejando la tercera adición de tampón en las cámaras.
NOTA: En este punto, el equipo puede permanecer inactivo en este estado hasta que se preparan búfer y el tejido y el personal está listo para proceder con los experiment.
- Tras eliminación del etanol, enjuáguese la boca tres veces con agua desionizada, seguido de tres lavados con tampón preparada (vea la Sección 2 para la preparación de buffer), dejando la tercera adición de tampón en las cámaras.
2. Preparación de tampones
- Preparar una solución tampón de 1 L de Krebs-Henseleit para su uso en el transporte y procesamiento de muestras de tejido para alcanzar concentraciones finales de 11,1 mM de D-glucosa; 1.2 mM MgSO4; 1.2 mM KH 2 PO 4; KCl 4,7 mM; NaCl 118,1 mM; 3,4 mM CaCl 2; 24,9 mM NaHCO3.
- Mezclar 9,6 g de sales de Krebs en aproximadamente 900 ml de agua desionizada sobre una placa de agitación.
- Mezclar en 0,373 g de cloruro de calcio deshidratado seguido de 2,1 g de bicarbonato de sodio por litro de tampón deseado.
- Gas solución tampón durante 20 minutos con 95% de O2 / 5% de CO 2.
- Después de gasificación, ajustar el pH a 7,05 (filtración de tampón aumenta el pH; pH objetivo final debe ser 7.4) y ajustar el volumen de 1 L.
- Filtrar esterilizar tampón en una botella y almacén intermedio de medios 1 L autoclave limpio a 4 ° C hasta que esté listo para su uso.
- Preparar separada Krebs-Hsolución tampón enseleit para su uso en experimentos Myograph como se describe en el paso 2.1 para el transporte tampón de Krebs-Henseleit con compuestos adicionales que se refieren a los experimentos de la contractilidad.
NOTA: Por lo general 2 L será suficiente para los experimentos descritos en este artículo, pero puede necesitar este volumen para aumentar o disminuir según la duración del experimento, el número de cámaras Myograph y reemplazos de amortiguamiento número (en relación con las adiciones de tratamiento).- Antes de la etapa de gasificación (paso 2.1.3), añadir 9,1 mg (por L de tampón está preparado) de desipramina-HCl para amortiguar.
- Preparar una solución de propranolol-HCl 1,0 M y añadir 1 ml (por L de tampón está preparado) de esta solución a la solución de tampón de Krebs-Henseleit. Hacer este tampón el día de uso y mantener a temperaturas Myograph operativo (una temperatura que produce una temperatura de 37,5 ° C en el myograph).
NOTA: La desipramina se añade para inhibir los mecanismos selectivos de la recaptación de aminas biógenasy permitir la limpieza de adiciones experimentales de la memoria intermedia de baño de los vasos sanguíneos que se produzca más rápidamente. La adición de propranolol evita que la unión no específica de compuestos de tratamiento para β-adrenérgicos receptores.
3. Recogida y preparación de la vasculatura
- Tan pronto como sea posible, retire el tracto gastrointestinal de la canal. Una vez que el animal ya no exhibe ningún reflejo involuntario, quitar la cabeza y ocultar y levante la carcasa verticalmente. La eliminación de las vísceras gastrointestinal (esófago hasta el ano) de la canal debe ser completado por el personal de matadero autorizado (<20 min de tiempo de aturdimiento).
NOTA: ¿Qué tan pronto, es generalmente limitada por la ubicación / instalación donde ésta se obtiene el tracto intestinal desde y procedimientos operativos estándar o procedimientos por mandato federal, seguidos por los personal de la instalación.- En la mayoría de instalaciones, llevar a cabo manipulaciones del tracto gastrointestinalen un lugar separado de la transformación de la canal que está destinado a entrar en el suministro de alimentos. Utilice las inmediaciones conveniente que el tracto gastrointestinal se puede tomar y hacia fuera para su examen.
- Una vez que el tracto gastrointestinal se extendió a cabo, identificar el intestino delgado, el pliegue ileocecal que conecta el intestino delgado al intestino ciego, y la brida que se extiende ileal proximal al pliegue ileocecal (Figura 1A).
- Usando un bisturí o cuchillo, muy ligeramente hacer una incisión en la membrana mesentérica en el centro de la brida ileal. El uso de dos dedos índices, sin rodeos diseccionar la grasa y el tejido conectivo exponer la vasculatura mesentérica (Figura 1B).
- De esta brida o protuberancia en el mesenterio intestinal, diseccionar múltiples ramas (~ 2 cm de longitud) de los haces de la arteria y la vena mesentérica expuestos que apoyan esta porción del íleon (Figura 1C).
- Si ucantar unas pinzas para agarrar el tejido, tenga cuidado de no captar directa o tirar de los vasos sanguíneos en absoluto, mientras que la eliminación de ellos como cualquier tipo de estiramiento puede dañar y afectar negativamente el rendimiento de tejido 14. Eliminación de los vasos sanguíneos se realiza mejor, cortando a través de cada extremo de la sección que ser eliminado y luego cortar junto o en paralelo a la sección de ahora aislado. Para facilitar, eliminar parte del tejido circundante, junto con los vasos para proporcionar un poco de tejido para captar con un par de fórceps.
- Con un par de pinzas, sumerja muestra de tejido en un tubo que contiene hielo frío tampón de Krebs-Henseleit y almacenar en hielo hasta el procesamiento puede ocurrir en el laboratorio.
- Coloque la muestra de tejido sobre una superficie de corte o en una placa de Petri y sumerja parcialmente en hielo frío de Krebs-Henseleit.
- Utilizando # 5 joyeros fórceps, tijeras iris Noyes, y de aumento de la lámpara o la disección de alcance (2,5 a magnificación 5.0X es suficiente), diseccionar cuidadosamente lejos la connecti grasa y rodeacinco tejidos y separar la arteria y la vena. La identificación de la abertura del recipiente en un extremo de la sección y comprender cuidadosamente la fascia que rodea el recipiente con los fórceps.
- Hacer un corte con las tijeras paralela al recipiente deslizando la punta de la tijera debajo de la fascia elevada. Después de la incisión inicial, la grasa y los tejidos conectivos se pueden separar más lejos de la embarcación mediante la reducción de cada lado con las tijeras. Asegúrese de que los vasos son tan limpias como sea posible y reducir al mínimo la cantidad de tiempo que los buques pasan en el banquillo.
- Volver vasos sanguíneos para tubos de fresco tampón de Krebs-Henseleit y se almacenan a 4 ° C (muestras pueden permanecer almacenado durante un máximo de 24 horas después de la recolección y todavía producir datos válidos de la contractilidad).
- Utilizando una hoja de afeitar, buque rebanada que se utilizará en myograph en número deseado de secciones de 2 mm (que es útil usar una máquina de cortar el tejido para obtener secciones transversales consistentes).
- Examine cada sección bajo un sco de disecciónpe (ampliación 12.5X) para asegurar que cada sección tiene ninguna anormalidad, ramas, válvulas, o daños superficiales inadvertidamente hecho durante la disección y la limpieza. Reemplazar la sección de recipiente de si hay alguna anormalidad, rama, válvula, o daño superficial.
- Secciones Tienda aceptables rodajas de buques (sumergidos en tampón Krebs-Henseleit) en hielo oa 4 ° C hasta que esté listo para el montaje en cámaras Myograph (generalmente <30 min).
- Montar suavemente el recipiente en la myograph mediante la inserción de los soportes a través del lumen y aumentar la tensión (utilizando el microposicionador en el myograph) teniendo cuidado de no estirar los vasos por encima de un 2 a 3 g lectura.
- Una vez que todas las cámaras están cubiertos, aspire el búfer de todas las cámaras y vuelva a llenar con 5,0 ml de tampón y se iniciará un temporizador de 15 minutos para comenzar el período de equilibrio y el experimento.
4. Experimento
- Equilibrar todas las secciones de los vasos durante 1,5 horas para lograr una res establesting tensión de 1,0 g.
- Vuelva a colocar el tampón de incubación Krebs-Henseleit cada 15 min.
- Durante el equilibrado, constantemente ajustar la tensión en las secciones de los vasos sanguíneos hasta 2 g y se deja relajar hasta aproximadamente 0,80 g. Trate de no permitir que los vasos se relajen demasiado (que pueden salirse de las monturas). Trate de lograr una tensión de línea de base estable, donde el buque tiene 1 g de tensión sin necesidad de ajuste.
- Durante el equilibrado, preparar una solución acuosa 1,32 M de KCl para ser utilizado como una referencia.
- Tras la finalización de un equilibrio satisfactorio, añadir 500 l de la solución de KCl 1,32 M para dar lugar a una solución 0,12 M en la solución de 5,5 ml de bañar el recipiente.
- Después de la adición de la M KCl 1,32, no ajustar la tensión manualmente como la respuesta máxima de esta adición se utiliza para evaluar la viabilidad del tejido y se puede utilizar para normalizar los datos de tratamiento (por ejemplo, las respuestas a una concentración de ungonist).
- Vuelva a colocar la memoria intermedia en intervalos de 15 minutos hasta que la tensión ha vuelto al valor basal de 1,0 g.
- Una vez que se alcanza la línea de base, cambiar el tampón y comenzar simultáneamente un temporizador de 1 min. Haga esto para todas las cámaras al mismo tiempo para evitar un escalonamiento de las horas de inicio.
- Vortex el estándar que se añade y preparar un comentario para cámara 1 durante la cuenta regresiva 1 min.
- Añadir las normas en 25 ml de alícuotas a cada cámara como los dictados del experimento (esto mantiene el tratamiento por debajo del 0,5% del volumen total).
- Cuando se ha añadido la última norma, iniciar un temporizador 9 min.
- Al final de la incubación estándar de 9 min, eliminar el tampón que contiene el tratamiento de las cámaras y añadir 5,0 ml de tampón fresco, e iniciar el temporizador de 2,5 min.
- Repita el paso 4.4.4.
- Al final del segundo enjuague 2,5 minutos, aspirar las cámaras y añadir tampón nuevo, y comenzar un temporizador de 1 minuto la cuenta atrás del inicio de la segundad adición estándar.
- Continuar este ciclo para todos adiciones estándar del día.
- Durante la adición norma final y la posterior incubación 9 min preparar el compuesto de referencia M KCl 1,32 para una final de la adición de dosis de referencia de ejecución de 500 l.
- Tras el intervalo de 1 min después de la adición tratamiento final, añadir el KCl y iniciar un temporizador 9 min.
NOTA: La adición de KCl es para confirmar la viabilidad del tejido a la conclusión del experimento y es útil si la administración de un tratamiento que resulta en respuesta insignificante. - Al concluir el 9 min de incubación compuesto de referencia final, aspire o eliminar el tampón de todas las cámaras. No añadir tampón fresco. Concluir el experimento.
- Guarde el archivo gráfico, eliminar secciones de los vasos sanguíneos y disponer de forma adecuada, y seguir el protocolo de limpieza (proporcionado por el fabricante y pueden ser específicas de laboratorio) para el equipo myograph.
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Representative Results
Los vasos sanguíneos que se usa para generar los resultados incluidos se obtuvieron de 6 novillos Holstein (425 ± 8 kg) dentro de un intervalo de 3 semanas. Un ejemplo de un típico mesentérica respuesta contráctil a KCl vena y adiciones crecientes de tratamiento en la concentración se presenta en la Figura 2. La magnitud de la respuesta variará algunos con el tamaño de la embarcación (correlacionada con el tamaño del animal donante), pero puede también ser influido (negativamente) por un manejo inadecuado (estiramiento) de los vasos durante la recolección y limpieza. Por lo tanto, es importante observar una respuesta contráctil significativo de la exposición a los buques de KCl. Si se observa una respuesta insignificante en este punto, no es aconsejable proceder más allá en el procedimiento con ese buque. Como se ve en los períodos de incubación 9 min en la Figura 2, hay aumentos incrementales en la respuesta que se corresponden con concentraciones crecientes. Aunque deseable para este particdiseño experimental ular, no siempre se puede producir o ser buscada con otros tratamientos. La adición de KCl al concluir el experimento, aunque no se utiliza en el tratamiento de los datos recogidos, es muy importante ya que confirma la viabilidad del tejido a la conclusión del período experimental (se vuelve más importante si el buque no está respondiendo a cualquier de las adiciones de tratamiento).
Los datos presentados en la Figura 2 se registran en gramos de tensión. Es importante para normalizar estos datos para reducir al mínimo cualquier animal a animal y la variación de un vaso a vaso. Así, además de ser utilizado como un indicador de la viabilidad, la respuesta máxima de KCl se utiliza para normalizar todas las adiciones de tratamiento. Esto genera datos de respuesta contráctil como un porcentaje de la máxima de KCl. Así es como las curvas de la arteria y la vena mesentérica respuesta a la creciente concentración de 5-hidroxitriptamina (serotonina, figura 3) y norepinefrina ( La respuesta vena mesentérica tanto 5-hidroxitriptamina (Figura 3) y norepinefrina (Figura 4) empezó como valores negativos. Este es el resultado de la corrección de la tensión máxima registrada durante cada período de incubación 9 min por la tensión de línea de base registrada antes de la adición inicial de KCl. Esta corrección de la línea base se asegura de que cualquier ligera diferencia en la tensión no se incluyen en los análisis y permitir que los datos presentados a sólo reflejan un cambio en la tensión. Los resultados de valor negativos desde el vaso sanguíneo relajante y cayendo por debajo de los niveles basales pre-KCl antes de la adición posterior tratamiento. Esto es especialmente común en muestras venosas donde las concentraciones iniciales del tratamiento o agonista son demasiado baja para causar una respuesta contráctil. Este no fue el caso para el me respuesta de la arteria senteric a cualquiera de amina biogénica, que tenía la tensión por encima de la línea de base hasta que el buque comenzó a responder a las adiciones de tratamiento. Esta diferencia es un ejemplo de las diferencias en los vasos a cada lado del lecho capilar y por qué ambos fueron considerados como parte de este bioensayo. Este bioensayo se puede utilizar para evaluar la vasoactividad de los compuestos sobre los vasos sanguíneos que suministran nutrientes al intestino delgado, así como vasos sanguíneos que llevan nutrientes absorbidos lejos del intestino delgado. Los datos de las Figuras 3 y 4 son ejemplos sencillos de cómo esto puede realizarse. En el caso de 5-hidroxitriptamina (Figura 3), no hubo una diferencia en la respuesta contráctil arterial o venosa. Por el contrario, la respuesta contráctil por la vena mesentérica a concentraciones crecientes de norepinefrina fue mayor que el de la arteria mesentérica. gura 1 "fo: contenido-width =" "src =" 3 pulg / files / ftp_upload / 52020 / 52020fig1highres.jpg "width =" 300 "/>
Figura 1:. Un ejemplo de tracto intestinal bovina utilizado como fuente de los vasos sanguíneos mesentéricos El asterisco rojo indica la porción visible del pliegue ileocecal en todos los tres paneles como un punto de referencia. (A) Todo el aparato con el óvalo rojo que indica la brida ileal donde ocurrió el muestreo de la vasculatura. (B) La exposición del lecho vascular mesentérica. Tijeras (C) Iris están apuntando hacia una rama expuesta de la vena mesentérica (visible) y la arteria (no visible) justo antes de la recolección. 
Figura 2: Ejemplo de una respuesta de la concentración de una vena mesentérica a concentraciones crecientes de noradrenalina (1 × 10 -7-1× 10 -4 M). Los grandes eventos al principio y al final de la traza son respuestas a las adiciones M KCl 0,12. El rectángulo rojo significa la región de recogida de datos correspondiente con el período de incubación 9 min para cada adición tratamiento. Los picos de 3 esbeltas que siguen a este son artefactos generados por los reemplazos de amortiguamiento y no están incluidos en el análisis. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 
Figura 3: La media de las respuestas contráctiles de la arteria mesentérica (MA) y la vena (MV, n = 6 novillos) a concentraciones crecientes de 5-hidroxitriptamina (serotonina) líneas mostradas se generaron utilizando análisis de regresión no lineal para ajustar los datos a un sigmoidal. concentración respuesta curva que utilizó la siguiente ecuación: y = parte inferior + [(parte superior - parte inferior) / (1 + 10 (LogEc 50 - x))], donde la parte superior y la parte inferior son el porcentaje de 120 mM KCl máxima respuesta contráctil en las mesetas, y la CE 50 es la concentración molar de producir 50% de la respuesta máxima KCl alcaloide. 
Figura 4: La media de las respuestas contráctiles de la arteria mesentérica (MA) y la vena (MV, n = 6 novillos) a concentraciones crecientes de norepinefrina líneas mostradas se generaron utilizando análisis de regresión no lineal para ajustar los datos a una curva de respuesta a la concentración sigmoidal que utilizó. la siguiente ecuación: y = parte inferior + [(parte superior - parte inferior) / (1 + 10 (LogEc 50 - x))], donde la parte superior y la parte inferior son el porcentaje de 120 mM KCl máxima contractile respuesta a las mesetas, y la CE 50 es la concentración molar de producir 50% de la respuesta máxima KCl alcaloide.
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Discussion
El desafío inicial en el desarrollo de este bioensayo fue el establecimiento de un punto de recogida repetible para la vasculatura mesentérica. Consistencia sitio de la muestra es crítica, ya que algunas de las funciones del cambio del intestino delgado durante la progresión desde el yeyuno a través del íleon y en consecuencia el mesenterio varían en un patrón similar. Las ramas ileales de la arteria mesentérica y la vena son los más fácilmente identificados a través de puntos de referencia anatómicos. Al ubicar el ciego y siguiendo el pliegue ileocecal a su término en el lado izquierdo del mesenterio, esto es, cerca de la terminación de la arteria mesentérica craneal 15. El área de mesenterio largo (llamado la brida) y la extensión del pliegue ileocecal (única para el bovino) 16 muestreo realizado a través de numerosos animales muy repetibles. Uno de los escollos más grandes que se pueden hacer es en esta fase del bioensayo. Estiramiento mecánico tiene un gran impacto negativo en la posterior buque performance 14 y el investigador se dará cuenta de que los buques que están excesivamente manipulados o se extendían durante el desmontaje y posterior limpieza no responderán al compuesto de referencia que se utiliza. Esto, desafortunadamente, es la única manera de evaluar realmente la calidad de la preparación vascular a nivel funcional y los vasos que no responden a KCl no debe ser considerado aún más para la generación de datos fiables.
Otros dos pasos de validación del método (no mostrados) que condujeron a la último método presentado en este documento fueron el uso de otros productos químicos como compuestos de referencia y prueba la viabilidad de los vasos sanguíneos después de 24 h de almacenamiento. La norepinefrina y la serotonina se evaluaron como compuestos de referencia, pero las respuestas de la arteria y la vena mesentérica eran demasiado variable a través de tipo de buque y en animales para ellos para ser utilizados con éxito. Por el contrario, la adición de 120 mM KCl resultó en una respuesta muy reproducible a través de ambas preparaciones arteriales y venosas. Also, las respuestas de las arterias y las venas se evaluó el día de la recogida y reevaluado 24 h después de la recolección y no hubo diferencias en la respuesta agonista ya sea por la arteria o la vena. Este es un aspecto importante del bioensayo, ya que hay a menudo un gran número de tratamientos (o diversas combinaciones de tratamiento) que se pueden aplicar, pero los investigadores están limitados por el espacio en el myograph y el tiempo. Al extender el período de viabilidad salida 24 horas desde la recogida, el tiempo para la experimentación adicional se incrementa en gran medida.
Es importante para el investigador para comprender la flexibilidad de la estructura de tratamiento aplicado a este bioensayo. Un investigador puede añadir cualquier compuesto en el tampón de incubación que él o ella está interesado en exponer crónica de los vasos sanguíneos a fin de controlar algo de relevancia biológica o como un tratamiento (en el caso de Klotz et al. 17, esto se hizo con venas safena laterales expuestos continuamente a ketanserin, que antagoniza un receptor de la serotonina de interés). Los vasos sanguíneos mesentéricos pueden ser pretratados con un compuesto de interés antes de realizar un experimento de respuesta contráctil. El bioensayo, tal como se presenta, fue diseñado para llevar a cabo un experimento de respuesta a la concentración acumulada mirando alcaloides del cornezuelo de centeno como agonistas y si la exposición a la dieta antes de los alcaloides del cornezuelo de centeno afectado a la respuesta vascular 18. Los resultados representativos demuestran que este método puede producir una respuesta vascular medibles y sólo cuatro concentraciones fueron utilizados para lograrlo. En el caso de Egert et al. 18, había hasta 10 concentraciones diferentes que se utilizan para construir una curva de respuesta. Este método es una manera de evaluar un gran número de diferentes compuestos o receptores en los vasos sanguíneos de un solo animal en una pequeña ventana de tiempo.
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Disclosures
La mención de su nombre comercial, producto patentado, o equipo especificado no constituye una garantía o garantía por el USDA y no implica la aprobación de la exclusión de otros productos que pueden estar disponibles.
Acknowledgments
Los autores reconocen Ryan Chaplin y el Dr. Gregg Rentfrow de la Universidad de Kentucky Meats Lab y el Departamento de Ciencia Animal y de alimentos para proporcionar oportunidades para recoger tejidos experimentales utilizadas en este documento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi Myograph | Danish Myo Technologies | 610M | A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice. |
| Powerlab 8/sp | ADIntruments | ML785 | |
| LabChart 7 | ADInstruments | Version 7 | |
| Force Calibration Kit | Danish Myo Technologies | 100055 | Specific to DMT myographs |
| Bottle-top Filter | Nalgene | 595-4520 | 0.22 μm pore size; 45 mm neck size |
| #5 Jewler’s Forceps | Miltex | 555008FT | Any brand of forceps can be used |
| Noyes Iris Scissors | Miltex | 18-1510 | Any brand of scissors can be used |
| Dissecting Scope | Zeiss | Stemi 2000-C | Any brand of dissecting light microscope will suffice |
| Adjustable Tissue Matrice | Braintree Scientific | TM C12 | This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly |
| Krebs-Hensleit Buffer | Sigma-Aldrich | K3753-10x1L | It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house |
| Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich | C7902-500G | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Desipramine-HCl | Sigma-Aldrich | D3900-5G | |
| Propranolol-HCl | Sigma-Aldrich | P0884-1G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| 95% O2/5% CO2 | Scott Gross | UN3156 |
References
- Matheson, P. J., Wilson, M. A., Garrison, R. N.
- Dobson, A. Blood flow and absorption from the rumen. Quarterly journal of experimental physiology. 69, 599-606 (1984).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, 617-619 (1976).
- Nielsen-Kudsk, F., Poulsen, B., Ryom, C., Nielsen-Kudsk, J. E. A strain-gauge myograph for isometric measurements of tension in isolated small blood vessels and other muscle preparations. Journal of pharmacological. 16, 215-225 (1986).
- Mulvany, M. J., Aalkjaer, C. Structure and function of small arteries. Physiological reviews. 70, 921-961 (1990).
- Klotz, J. L., et al. Assessment of vasoconstrictive potential of D-lysergic acid using an isolated bovine lateral saphenous vein bioassay. Journal of animal science. 84, 3167-3175 (2006).
- Klotz, J. L., Bush, L. P., Strickland, J. R. A vascular contractility bioassay using bovine right ruminal artery and vein. Journal of animal science. 89, 1944-1951 (2011).
- Westendorf, M. L., et al. In vitro and in vivo ruminal and physiological responses to endophyte-infected tall fescue. Journal of dairy science. 76, 555-563 (1993).
- Strickland, J. R., et al. Board-invited review: St. Anthony"s Fire in livestock: causes, mechanisms, and potential solutions. Journal of animal science. 89, 1603-1626 (2011).
- Eckert, H., Kiechel, J. R., Rosenthaler, J., Schmidt, R., Schreier, E. Ch. 11. Ergot Alkaloids and Related Compounds. B, B. erde, HO, S. child , Springer-Verlag. (1978).
- Rhodes, M. T., Paterson, J. A., Kerley, M. S., Garner, H. E., Laughlin, M. H. Reduced blood flow to peripheral and core body tissues in sheep and cattle induced by endophyte-infected tall fescue. Journal of animal science. 69, 2033-2043 (1991).
- Foote, A. P., Harmon, D. L., Strickland, J. R., Bush, L. P., Klotz, J. L. Effect of ergot alkaloids on contractility of bovine right ruminal artery and vein. Journal of animal science. 89, 2944-2949 (2011).
- Foote, A. P., et al. Ergot alkaloids from endophyte-infected tall fescue decrease reticuloruminal epithelial blood flow and volatile fatty acid absorption from the washed reticulorumen. Journal of animal science. 91, 5366-5378 (2013).
- Hocking, K. M., et al. Detrimental effects of mechanical stretch on smooth muscle function in saphenous veins. Journal of vascular surgery. 53, 454-460 (2011).
- Smith, D. F.
- Budras, K. D., Habel, R. E. Bovine Anatomy An Illustrated Text. , first, Schlütersche GmbH and Co. KG, Verlag and Druckerei. (2003).
- Klotz, J. L., et al. Antagonism of lateral saphenous vein serotonin receptors from steers grazing endophyte-free, wild-type, or novel endophyte-infected tall fescue. Journal of animal science. 91, 4492-4500 (2013).
- Egert, A. M., Kim, D. H., Schrick, F. N., Harmon, D. L., Klotz, J. L. Dietary exposure to ergot alkaloids decreases contractility of bovine mesenteric vasculature. Journal of animal science. 92, 1768-1779 (2014).
