方法在小鼠肾上腺嗜铬细胞细胞贴附电容测量

Introduction

突触传递是由含有神经递质的突触小泡的胞吐作用介导的，而这些囊泡必须经过神经末梢内本地吞再循环以维持长期的神经元沟通。由于突触传递在大脑中的重要作用，了解构成突触小泡循环是实现在整个蜂窝通信更好的理解的重要基础的分子机器。在细胞模型系统，肾上腺嗜铬细胞提供了一些最明确的洞察分子机制基础突触囊泡循环。胞吐作用，在神经递质释放的最后步骤，已经极大地研究并通过使用肾上腺嗜铬细胞^1,2的检查。事实上，大多数的分子玩家编排的形成，目标，对接和融合分泌颗粒已经确定，由于应用程序股利ERSE技术，嗜铬细胞^1。此外，通过提供一个机会以允许参与胞吐作用的蛋白质机械的单泡的分辨率，嗜铬细胞仍然是一个功能强大的模型，以解决囊泡融合³的问题。

细胞贴附电容测量首先在胞吐³中解决单囊泡融合利用。以通过细胞膜导纳测量与小区连接的配置^4-7膜片钳技术来检测囊泡一样小〜中直径为60nm已证明的胞吐作用。导纳的定义是多么容易的电路或设备将允许电流流动的措施;它是阻抗的倒数。因此，导纳测量提供的膜电容的理解。这是由小泡膜进入细胞膜的结合来实​​现;这表明掺入改变表面面积^8。每个囊泡融合导致膜电容^9,10逐步增加。此外，该导纳测量提供了膜电导和胞吐事件³中 ​​的融合孔导。由于这种技术提供了在胞吐过程中识别单囊泡动力学的独特工具，我们的实验室最近应用这个概念，检测单囊泡^11,12的内吞作用。

我们特别感兴趣是网格蛋白介导的内吞作用（CME），它已被认为是一个基本的看家成分在许多细胞¹³和作为突触小泡胞吞作用在神经端子^14,15的主通路。 CME是已知的生物学上重要的，但是，它的动力学仍不能很好地理解，由于在监测单数内吞事件的技术限制。考虑到嗜铬细胞和神经元之间的¹胞吐机制的相似性，这是PLausible在嗜铬细胞分裂机制可能会适用于突触小泡内吞作用的神经元。细胞贴附电容测量已用于监测个体的内吞事件并分析裂变动力学，其中大多数方法都未能解决。在我们的细胞附着的录音，在20kHz的正弦波叠加在保持电势，并且输出电流是从两相分离成薄膜电导的一个信道和膜电容，在其它信道锁定放大器^{16 18。}从变化的膜电导和电容，可以计算裂变孔隙，这可能对应于管状薄膜颈部的内化泡连接到前囊夹断质膜的动力学。总的来说，这项技术使我们有机会研究囊泡分裂的调控机制CME的过程中。

Protocol

注意：整个过程是根据美国国立卫生研究院的指导方针进行的，经批准由伊利诺伊大学芝加哥分校的动物护理和使用委员会。

1，解决方案和文化传媒准备

1. 保留所有的解决方案在-20°C至六个月。保持培养基在4℃下进行长达3个月。
2. 通过混合1毫升ITSX（胰岛素 - 转硒补充）的青霉素 - 链霉素溶液和1毫升到100毫升的DMEM制备100ml培养基。
3. 通过混合250毫升DMEM中，加入2.5ml的100mM的CaCl _2，和2.5毫升的50mM EDTA制备的酶溶液。
4. 通过混合225毫升DMEM，25毫升胎牛血清，625毫克的白蛋白，和625毫克的胰蛋白酶抑制剂的制备失活的解决方案。
5. 准备了154毫米的NaCl，5.6 mM的氯化钾，5.0毫米肝素钠，3.6毫米的碳酸氢钠，5.6毫米的葡萄糖洛克的解决方案。将pH调节至7.3，用NaOH。
6. 制备50毫克/毫升的聚-D-赖氨酸（PDL）溶液。用1毫克/毫升的最终浓度大衣盖玻片。
7. 制备140 mM氯化钠，5mM的氯化钾，2mM的_氯化钙 ，1mM的MgCl ₂的，10毫米的HEPES-NaOH和10mM葡萄糖的细胞外溶液。将pH调节至7.3，用NaOH为〜310纳摩尔/ kg的渗透压。
8. 准备了50毫米的NaCl，100毫米TEACl，5 mM的氯化钾，2毫米氯化钙_2，1毫米氯化镁_2，和10毫米的HEPES吸管的解决方案。调节pH值至7.3，用NaOH与〜290纳摩尔/ kg的渗透压。

2，肾上腺隔离

1. 高压釜，对大型和小型清扫剪刀和两对镊子。在整个过程中戴上手套，然后将解剖托盘上一个冰桶。
2. 在使用0-3天取小鼠。安乐死的动物用加压_{的二氧化碳}罐后斩首。
3. 利用小剪刀来剪下来的小狗的背下从宫颈癌放疗脊椎 CAL尾鳍地区。可以肯定表面的皮肤下的切割和未刺穿进入体腔。
4. 其次，剥离皮肤远离脊柱，使肌肉暴露在有脊柱的一个明确的说法。从这里出发，让在颈椎脊髓transectional切割，然后进行沿脊柱两侧的两个平行的切口。
5. 与一对保持动物的主体钳子，使用其他钳子抓住脊柱和剥离背部脊柱直到肾脏被暴露。
6. 此时，可视化对肾脏顶部的肾上腺。然后小心地从每个动物的两个腺体成锥形套管内填充洛克的解决方案。
   注：有时腺体会坚持镊子。如果是这样的话，轻轻用另一对镊子在去除从钳子和进洛克溶液的腺体中提供帮助。腺体可保持在该状态下长达2小时。

E“> 3。组织消化

1. 在此期间，气泡，用5％CO ₂ +95％O _2的酶溶液15分钟，在使用之前。确保平衡的溶液变成从一个明亮的粉红色到粉红色/橙色。
2. 木瓜蛋白酶加入到新鲜鼓泡酶溶液在20〜25单位/ ml的最终浓度。在用木瓜蛋白酶的酶溶液孵育每对接头的每个动物为40-60分钟，在37℃。
3. 加失活溶液的75％至每个管并在37℃进行另外10分钟。这个孵育灭活木瓜蛋白酶的酶活性。
4. 在温育10min，灭活液后，轻轻腺体转移到新标管，然后清洗腺体3X文化传媒。

4，细胞分离和电镀

1. 洗涤后，放置两个腺体成200μL培养基，然后轻轻地滴定腺体和上下贯通的移液管尖与200μl的移液管，直到不再有一大块组织在该溶液中。
   注意：当进行滴定，维持腺体在管与来自200μl的移液管尖端向下的力底部和接合组织轻缓地。务必使用缓慢，持续的招，绝不吹打快速或突然。
2. 增加一个额外的250微升培养基，使培养液的总体积为450微升。
3. 板60微升此含细胞溶液到每七个12毫米PDL-预涂覆的盖玻片，它被放置在一个60×15毫米培养皿中。
4. 一次镀，将盘插入，并设定为37℃，并保持5％的CO ₂流的稳定/供应30分钟，以确保细胞存活的环境中孵化。孵育后，轻轻地加入5 ml预先温热的培养基放入培养皿中，并返回盘放回培养箱中放置24小时前，细胞公文包ð录音。
   注意：通常情况下，可以使用的细胞电生理记录长达4天。

5，细胞识别和千兆欧密封形成

1. 将12毫米盖玻片进入细胞外液。由于整个肾上腺用于细胞制剂，拌入培养与皮质细胞（小和比铬细胞）的调光器的嗜铬细胞（通常是非常明亮的带褐/米色着色和近乎完美的圆形（ 图1）。
2. 拉使用可编程的P-97牵引补丁移液器四个阶段。浸枪头到融化的蜡，这将有助于降低玻璃的电容再火波兰尖端“井喷走”这起蜡枪头内。
   注意：当装满补丁吸管的解决方案，补丁移液器通常有〜2MΩ电阻。
3. 在数米接近补丁吸管靠近电池icrons。实现了小区连接的配置，补丁吸管更靠近的小区的方法中查找任何轻微的细胞变形。轻轻推吸，直到GΩ的密封来实现的。

6，细胞贴附电容录音

1. 一旦GΩ的印章则透露，通过使用EPC-7加膜片钳放大器使细胞贴附记录和两相模拟锁相放大器（见设备附表）。申请为50毫伏（有效值）的振幅和20千赫频率的锁定放大器的正弦波。
2. 在1毫秒的时间常数和24分贝设置的锁定放大器的输出滤波器。设置锁定放大器，使得由温和抽吸脉冲产生的瞬态电容变化只在贴片电容（Im）的痕迹，没有投影到补丁电导（Re）中的跟踪显示（ 图2）的相位。
   注：请参阅详细的系统重新校准ference 19。
3. 识别典型的电容变化由“向下”的步骤（ 图3）。
   注：固体录音将被视为一个“阶梯”式的相似与许多向下的步骤，这表明内在单囊泡。打补丁的过程作为一个机械刺激，因为动作电流通常可以从大多数细胞记录。
4. 名的文件作为单独的文件夹，包括日期：该文件中/日/年，每个细胞贴附记录作为自己的个人编号（XX）。

Representative Results

细胞存活率和千兆欧姆密封的质量是确定细胞贴附电容记录的质量是至关重要的。因此，为促使有效和高效的细胞培养物之前，电生理记录，和典型的活细胞被示出在图1中是至关重要的。实践和时间将是在实现千兆欧姆密封高品质很有帮助。如果人们可以清楚地看到，当在协议5.3步中描述的补丁吸管的临近细胞的细胞变形，有获得高品质的密封更好的机会。 图3显示膜电容的典型记录与相关的多个向下的步骤单囊泡内吞作用。

可行的小鼠肾上腺嗜铬细胞图1的例子细胞培养24小时后，箭头指向3可行的嗜铬细胞。 请点击这里查看该图的放大版本。

图2相位调整中的细胞贴附录音在初始阶段设定，轻柔的吸力导致在这两个电容（IM）和电导（Re）中的痕迹的瞬时变化，以及在重新跟踪突起是由23°移相抵消移动。 请点击这里查看这个数字的放大版本。

图3：典型的CELL附加电容录制多个向下的台阶，单囊泡内吞作用有关。 请点击这里查看该图的放大版本。

Discussion

细胞贴附电容测量要求，以顺利取得录音提供高品质的几个关键步骤：1）肾上腺编制可行的，健康的细胞; 2）客运专线涂层的盖玻片; 3）千兆欧密封的形成; 4）该系统的噪声电平;和5）的相位校正。

动物手术，修饰可以潜在地使是调整手术方法，以最适合的灵巧和防止剥离时发生损坏。此外，关于定位，除去肾上腺足够的做法是必要的，这将被用于电生理记录的细胞全部来自肾上腺髓质。对酶消化，这是重要的鼓泡用5％CO ₂ +95％O ₂的溶液中平衡的酶溶液。可以肯定的是，连接到所述气缸中的管子是足够紧，无泄漏。此外，要确保最终我Ñ​​解决方案，在整个15分钟的时间冒泡妥善安置;这可以通过使用放置一个20G的针头端已修成平头的管的端部，以便适当地引导空气流动来实现。此外，附加的时间为这个步骤不会伤害，只要该气流是不那么强大的溢出在管中的溶液。细胞滴定，将采取的做法的另一个关键组成部分。大多数细胞可能会被损坏，如果过度滴定;反之，如果滴定是不够的，会有非常少量的单个分离的细胞从组织中分离。为了有效地滴定，利用200微升枪头移液器上下7-8x，确保腺体通过200微升枪头轻轻地过去了，你滴定。

对于PDL涂层，人们总是可以延长在盖玻片最多3小时的PDL的温育时间，以确保盖玻片的足够的涂层。 PDL中的涂层是用于嗜铬细胞附着临界并生长在细胞接种后的盖玻片。如果PDL中的涂层是不充分的，大部分细胞将被从盖玻片，这将使得千兆欧姆密封形成难以分离。

细胞贴附记录可以随时进行修改和完善，为修补技术是一种专门的工艺。温柔含蓄吸力在促进千兆欧密封时形成的补丁吸管和细胞相接触的关键。过多吸入会破坏补丁尖 - 细胞接触并在极端情况下，该细胞可被吸入到补丁吸管。这将在示波器上可以很容易观察到，通过改变成一个整体单元结构，或由一个很小的电阻返回一个非常大的;做法是极为重要的，以获得高品质千兆欧姆密封形成。

而高密封阻力是重要的，以减少在细胞贴附记录的噪声电平，以下两个步骤也重要的是要降低的噪音水平，以解决单胞吞的事件：（1）在补丁吸管溶液，TEACl被用来阻断电压门控^钾通道; （2）吸液管尖端涂有粘性蜡和枪头内的蜡可以通过热抛光除去。

而相位调整协议步骤6.2详述的关键是要建立用于记录的初始阶段，此步骤可能并不理想。因此，在裂变孔隙分析个别事件进行相位校正是很重要的。在-65 mV的静息膜电位，全细胞记录表明，一个典型的鼠嗜铬细胞具有5 pF的输入电容和500兆欧，的输入电阻，计算小鼠嗜铬细胞的膜电导为〜0.4 PS /页。这意味着，一个内吞事件与1 fF的电容大小将导致净亏损为0.4〜PS膜电导的。相比于这个值是可忽略不计与内吞裂变孔隙封闭在细胞贴附记录ypical 50-100 PS膜电导变化有关。因此，我们有信心，我们的相位校正，使我们调整膜电导的基线，使前后裂变孔隙闭合是在同一水平;这个过程可能会带来<1％的误差为我们的数据分析。

总之，这里所描述的协议表明细胞贴附电容录音如何可以利用使用小鼠嗜铬细胞作为模型系统来监控单个囊泡的胞吞作用。这种技术允许一个分析监管机制囊泡内吞作用的裂变过程中。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899
DMEM		15066024	Keep out of UV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Life Technologies
Cover Glass	Carolina Biological	633029	12 mm
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122	100 ml
Insulin-Trans-Sel-X	Life Technologies	51500056	Only thaw on ICE!
Papain	Worthington	39S11614
EPC-7 plus patch amplifier	HEKA
BNC-2090 data acquisition board	National Instruments
Igor data acquisition software	Wavemetrics
P-97 pipette puller	Sutter Instruments
Microforge	Scientific Instruments
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	B150-110-10	Outer diameter: 1.5 mm Inner diameter: 1.10 mm Length: 10 cm