Introduction
Synaptisk transmisjon er mediert av exocytose av nevrotransmitter-synaptiske vesikler inneholdende, og disse vesikler må gjennomgå lokal endocytic resirkulering innen nerveterminalen til å opprettholde neuronal kommunikasjon på lang sikt. Gitt den essensielle rolle synaptisk transmisjon i hjernen, forståelsen av den molekylære maskineri som utgjør den synaptiske vesikkel syklusen er et vesentlig grunnlag for en bedre forståelse i mobil kommunikasjon som helhet. Blant cellemodellsystemer, har adrenal chromaffin celle gitt noen av de mest definitive innsikt i den molekylære maskiner underliggende synaptisk vesikkel resirkulering. Exocytose, det siste trinnet i nevrotransmitter-frigjøring, er blitt uhyre studert og undersøkt ved bruk av den adrenale kromaffinceller celle 1,2. Faktisk har de fleste av de molekylære spillere som organisere formasjonen, målretting, dokking, og sammensmelting av sekretoriske granuler blitt identifisert på grunn av anvendelsen av diverse teknikker i kromaffinceller en. Videre, ved å tilveiebringe en mulighet for å tillate enkel vesikkel-oppløsning av proteinet maskiner involvert i exocytose, forblir chromaffin en kraftig cellemodell for å ta opp de spørsmål vesikkelfusjon 3.
Cell-festet kapasitans målingene ble først brukt i å løse enkelt vesikkelfusjon under eksocytose tre. Exocytose av vesikler så små som ~ 60 nm i diameter har vist seg å bli detektert av cellemembran adgang målinger med patch clamp teknikk i cellen festet konfigurasjonen 4-7. Opptak er definert som et mål på hvor lett en krets eller enhet vil tillate en strøm til å flyte; det er den inverse av impedans. Således admittans målinger gi en forståelse av membranen kapasitans. Dette oppnås ved inkorporering av vesikulær membran inn i plasmamembranen; dette innlemmelse avslører endringer i overflatenOmråde 8. Hver fusing vesikkel fører til en trinnvis økning i membran kapasitans 9,10. I tillegg gir denne adgang måling membrankonduktans og fusion pore konduktans under en exocytotic hendelse tre. Som denne teknikken har gitt et unikt verktøy til å identifisere enkelt-vesikkel kinetikk under eksocytose, har vår lab nylig søkt dette konseptet til å oppdage endocytose av enkelt vesikler 11,12.
Vår spesiell interesse er clathrin endocytose (CME), som har vært betraktet som en grunnleggende rengjøring komponent i mange celler 13 og som hoved vei for synaptisk vesikkel endocytose i nerveterminaler 14,15. CME er kjent for å være biologisk viktig, men dens kinetikk fortsatt ikke godt forstått på grunn av tekniske begrensninger i overvåking entall endocytiske hendelser. Gitt likheter i exocytic mekanismer mellom kromaffinceller og neuroner 1, er det plausible at fisjons mekanismer i kromaffinceller kan sannsynligvis gjelde for synaptisk vesikkel endocytose i nerveceller. Cellen-festet kapasitans målinger har vært benyttet til å overvåke enkelt endocytiske hendelser og analysere fisjonskinetikk, som de fleste metoder er i stand til å løse. I våre celle-tilknyttet opptak, er en sinusbølge på 20 kHz lagt oppå holdepotensial, og utgangsstrømmen separeres i membran konduktans i en kanal og membran kapasitans i den annen kanal fra en to-fase lock-in-forsterker 16- 18. Fra de forandringer i membranen konduktans og kapasitans, kan man beregne kinetikken av fisjons porer, noe som sannsynligvis korresponderer med den rørformede membran hals som forbinder internalisert vesikkel til plasmamembranen før vesikkel pinch-off. Kollektivt, denne teknikken gir oss muligheten til å undersøke de regulatoriske mekanismer for vesikkel fisjon under CME.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Hele prosedyren ble gjennomført i samsvar med retningslinjene fra National Institutes of Health, som er godkjent av Animal Care og bruk komité ved University of Illinois i Chicago.
1. Solutions og kultur Media Forberedelser
- Hold alle løsningene ved -20 ° C i inntil seks måneder. Hold kultur media ved 4 ° C i opptil tre måneder.
- Forbered 100 ml kulturmedier ved å blande 1 ml penn-strep løsning og 1 ml ITSX (Insulin-Transferrin-Selen-Tilskudd) til 100 ml med DMEM.
- Forbered enzymoppløsning ved å blande 250 ml DMEM, 2,5 ml 100 mM CaCl 2, og 2,5 ml av 50 mM EDTA.
- Forbered inaktive løsning ved å blande 225 ml DMEM, 25 ml FBS, 625 mg av albumin, og 625 mg trypsin inhibitor.
- Forbered en Lockes løsning av 154 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 5,0 mm HEPES, 3,6 mM NaHCO3, 5,6 mM glukose. Juster pH til 7,3 med NaOH.
- Forbered en poly-D-lysin (PDL) løsning av 50 mg / ml. Bruk en sluttkonsentrasjon på 1 mg / ml for å belegge dekkglass.
- Tilbered en ekstracellulær løsning av 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 10 mM HEPES-NaOH, og 10 mM glukose. Juster pH til 7,3 med NaOH med en osmolaritet på ~ 310 nmol / kg.
- Tilbered en pipette løsning av 50 mM NaCl, 100 mM TEACl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, og 10 mM HEPES. Juster pH til 7,3 med NaOH med en osmolaritet på ~ 290 nmol / kg.
2. binyrene Isolation
- Autoklav et par store og små disseksjon saks og to par tang. Bruk hansker under hele prosessen og plasser dissekere skuffen på en isbøtte.
- Bruk mus tatt på dag 0-3. Avlive dyr med en trykksatt CO 2 tank etterfulgt av halshogging.
- Utnytte mindre sett med saks til å kutte ned på baksiden av valpen etter ryggraden fra cervix cal til hale regionen. Sørg for å kutte overfladisk under huden og ikke punkteres inn i kroppens hulrom.
- Neste, peel huden bort fra ryggraden, slik at muskulaturen er utsatt for å ha et klart syn på ryggsøylen. Herfra gjøre en transectional kutt i cervical ryggmargen, og deretter lage to parallelle kutt langs sidene av ryggraden.
- Med en pinsett som holder hoveddelen av dyret, bruk den andre pinsett til å gripe ryggsøylen og skrelle tilbake ryggraden til nyrene er utsatt.
- I dette øyeblikket, visualisere binyrene på toppen av nyrene. Deretter forsiktig plassere de to kjertler fra hvert dyr i en konisk tube fylt med Lockes oppløsning.
MERK: Noen ganger kjertlene vil holde seg til tang. Hvis dette er tilfelle, å bruke et annet forsiktig pinsett for å hjelpe til med fjerning av de kjertler fra tang og inn i Lockes oppløsning. Kjertlene kan holdes i denne tilstand i opp til 2 timer.
- I mellomtiden, boble enzym-oppløsningen med 5% CO2 + 95% O 2 i 15 min før bruk. Kontroller at ekvilibrerte løsning svinger fra en lys rosa farge i rosa / oransje farge.
- Tilsett papain til ferskt boblet enzym-oppløsning ved en sluttkonsentrasjon på 20-25 enheter / ml. Inkuber hvert par av kjertler fra hvert dyr i 40-60 min ved 37 ° C i enzymløsningen med papain.
- Legg 75% av inaktiveringsløsning til hvert rør og inkuberes ved 37 ° C i ytterligere 10 min. Denne inkubasjon inaktiverer enzymaktiviteten av papain.
- Etter 10 min inkubering med inaktive løsning forsiktig overføre kjertlene til en nylig merkede rør og deretter vaske kjertlene 3 ganger med kulturmedier.
4. Cell Dissosiasjon og plating
- Etter vask, plasserer de to kjertler i 200 mL av kultur media og deretter forsiktig titrere kjertlene opp ogned gjennom pipettespissen med en 200 ul pipette inntil det ikke lenger finnes et stort stykke vev i løsningen.
MERK: Ved titrering, opprett glands på bunnen av røret med en nedadrettet kraft fra den 200 pl pipettespissen og engasjere vevet forsiktig og langsomt. Vær sikker på å bruke langsomme, kontinuerlige slag, aldri pipettering rask eller brå. - Legg til en ekstra 250 mL kultur media for å bringe det totale volumet av kulturmedier opptil 450 mikroliter.
- Plate 60 pl av denne celle-inneholdende løsning på hver av syv 12 mm PDL-pre-belagte dekkglass, som er plassert i et 60 x 15 mm dyrkningsskål.
- Når belagt, plasseres rett inn i inkubator som er satt til 37 ° C og opprettholdt med en jevn strøm / tilførsel av 5% CO2 i 30 minutter for å sikre et miljø for celle-levedyktighet. Etter inkubering, tilsett 5 ml forvarmet kulturmedia inn i dyrkningsskål og returnere fatet tilbake i inkubatoren i 24 timer før celle-attached opptak.
MERK: Typisk kan cellene anvendes for elektrofysiologiske opptak for opptil 4 dager.
5. Cell Identifisering og Gigaohm Seal Formasjonen
- Plasser 12 mm dekkglass i ekstracellulært løsning. Siden hele binyrene blir benyttet for celle preparat, blande kromaffinceller (vanligvis svært lyse med en brunlig / beige farge og en nær perfekt sirkulær form (figur 1) i kultur med kortikale celler (mindre og svakere enn kromaffinceller).
- Trekk ut oppdaterings pipetter i fire trinn med en programmerbar P-97 avtrekker. Dypp pipettespissen inn i en smeltet voks, noe som vil bidra til å redusere kapasitans av glasset og deretter brann polsk spissen for å "blåse-bort" denne voksen fra innsiden av pipettespissen.
MERK: Når fylt med patch pipette løsning, patch pipetter typisk ha en motstand på ~ 2 mÊ. - Nærmer lappen pipette nær celle i flere microns. For å oppnå en celle-tilknyttet konfigurasjon, se etter en hvilken som helst liten celle deformasjon under tilnærmingen av plasteret pipette nærmere cellen. Påfør lett sug inntil en GΩ forseglingen er oppnådd.
6. Cell-Attached Kapasitans Recordings
- Når en GΩ tetning er åpenbart, gjør celle-opptakene er festet ved hjelp av en EPC-7 pluss patch-clamp forsterker og en to-fase analog lock-in-forsterker (se vedlagte tabell av utstyret). Påfør en sinus med amplitude på 50 mV (rms) og frekvens på 20 kHz fra lock-forsterker.
- Sett utgangsfilter av synkroniseringsforsterkeren ved 1 msek tidskonstant og 24 db. Sett fasen av synkroniseringsforsterkeren slik at forbigående forandringer kapasitans som er produsert av milde sugepulser vises bare i plasteret kapasitans (Im) spor uten fremspring i lappen konduktans (Re) spor (figur 2).
MERK: Vennligst se detaljene for kalibrering av systemet i reFerence 19. - Identifisere typiske kapasitans endringer ved "nedover" trinn (figur 3).
MERK: En solid opptak vil bli sett på som en "trapp" type likhet med mange nedadgående trinn, noe som indikerer internalizing enkelt blemmer. Den lapping prosessen fungerer som en mekanisk stimulering siden handling Strømmen kan typisk registrert fra de fleste celler. - Navngi filer som individuelle mapper, inkludert dato: dd / mm / år og hver celle-festet opptak som sin egen individuelle nummerering (xx) i den filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den celleviabilitet og kvaliteten på gigaohm tetning er kritisk for å bestemme kvaliteten av de celle-tilknyttet kapasitans opptak. Derfor er det viktig å fremskaffe en effektiv og effektiv cellekultur før elektrofysiologiske opptak, og typiske levedyktige celler er vist i figur 1. Vil Practice og tid være nyttig for å oppnå en gigaohm tetning med høy kvalitet. Hvis man kan tydelig se celle deformasjon når plasteret pipette nærmer cellen som beskrevet i protokollen Trinn 5.3, er det en større mulighet i å skaffe en forsegling av høy kvalitet. Figur 3 viser et typisk opptak av membran kapasitans med flere nedover trinnene tilknyttet enkelt vesikkel endocytose.
Figur 1. Eksempler på levedyktige mus adrenale kromaffinceller24 timer etter at cellekultur. Piler peker på tre levedyktige kromaffinceller. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Fase justering i celle-festet opptak. Med den innledende fasen innstilling, milde innsugingsdeler forårsake forbigående endringer i både kapasitans (Im) og konduktans (Re) spor, og anslagene i Re spor er kansellert ut av en 23 ° fase skifte. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. En typisk cell-festet kapasitans opptak med flere nedover trinn, knyttet til enkelt vesikkel endocytose. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cell-festet kapasitans målinger kreve flere viktige skritt for å kunne få opptak med høy kvalitet: 1) levedyktige og friske celler fremstilt fra binyrene; 2) PDL belegg av Dekkglass; 3) gigaohm segl formasjon; 4) støynivået til systemet; og 5) fasekorreksjon.
For dyr kirurgi, modifikasjoner kan man potensielt gjøre er å justere den kirurgiske tilnærming som passer best fingerferdighet og for å hindre skader under disseksjon. I tillegg er tilstrekkelig praksis på å finne og fjerne binyrene viktig som celler som vil bli benyttet for elektrofysiologiske opptak kommer utelukkende fra medulla i binyrene. For enzym-fordøyelsen, er det avgjørende å stabilisere enzymløsningen ved bobling av oppløsningen med 5% CO2 + 95% O 2. Vær sikker på at slangen er koblet til sylinderen er tilstrekkelig tett og uten lekkasjer. I tillegg må du passe på at slutten jegn løsning er riktig plassert under hele 15 min boblende tid; Dette kan oppnås med å plassere en 20 G nål ende som er avstumpet ved enden av slangen, slik som å dirigere luftstrømmen på riktig måte. Videre vil ytterligere tid for dette trinnet ikke er skadet, så lenge luftmengden ikke er så kraftig som for å renne over løsningen i røret. Cell titrering er en annen kritisk komponent som vil ta praksis. De fleste av cellene kan bli skadet hvis over-titreres; Derimot, hvis titrering ikke er nok, vil det være svært få enkle isolerte cellene dissosiert fra vev. Å effektivt titrere, utnytte en 200 mL pipette tips å pipettere opp og ned 7-8x, noe som gjør at kjertlene er forsiktig gått gjennom 200 mL pipette tips som du titrere.
For PDL belegg, kan man alltid forlenge inkubasjonstid av PDL på Dekk opptil 3 timer for å sikre tilstrekkelig belegg av dekkglass. PDL belegget er kritisk for kromaffinceller å festetil og vokse på Dekk etter celle plating. Hvis PDL belegget ikke er tilstrekkelig, vil de fleste av cellene bli løsne fra dekkglass, som vil gjøre det gigaohm tetning dannelse vanskelig.
Cell-festet opptak kan alltid endres og forbedres, som patching teknikken er en dedikert prosess. Lett og subtile suge er kritisk i å tilrettelegge gigaohm segl formasjon når lappen pipette og celle er i kontakt. For mye suge vil ødelegge patch tip-celle kontakt og i ekstreme situasjoner, kan cellene bli sugd inn i plasteret pipette. Dette vil være svært enkelt observert på oscilloskop ved å skifte inn en hel cellekonfigurasjon, eller ved en svært minimal motstand tilbake til en meget stor én; praksis er av den største betydning for å oppnå en høy kvalitet gigaohm segl formasjon.
Mens tetning av høy motstand er avgjørende for å redusere støynivået i de celle-tilknyttet opptak, de følgende to trinn er ogsåviktig å redusere støynivået for å løse enkelt endocytiske hendelser: (1) på lappen pipette-løsning, blir benyttet for å blokkere TEACl spenningsstyrte K +-kanaler; (2) pipettespissen er belagt med klebrig voks og voks på innsiden av pipettespissen kan fjernes ved varme polering.
Mens fase justeringen som beskrives i protokoll trinn 6.2 er avgjørende for å sette opp startfasen for innspillingen, kan dette trinnet ikke være ideelt. Derfor er det viktig å utføre fasekorreksjon under spalting pore-analyse for enkelthendelser. Ved en hvilende membranpotensial på -65 mV, hel-celle-opptak viser at en typisk mus chromaffin celle har en inngang kapasitans 5 pF og en inngangsmotstand på 500 mÊ, som beregner membrankonduktans av mus kromaffinceller som ~ 0,4 pS / flg. Dette innebærer at en endocytic arrangement med en kapasitans størrelse på en fF vil resultere i et netto tap av membran-konduktansen av ~ 0,4 pS. Denne verdien er ubetydelig sammenlignet medypical 50-100 pS membrankonduktans endring knyttet til endocytic fisjon-pore nedleggelse i celle-festet innspillinger. Derfor er vi sikre på at vår fase korreksjon tillater oss å justere grunnlinjen for membrankonduktans slik at før og etter fisjon-pore nedleggelse er på samme nivå; denne prosessen kan ta med <1% feil i vår dataanalyse.
Oppsummert, den protokoll som er beskrevet her demonstrerer hvordan celle-tilknyttet kapasitans opptak kan bli anvendt for å overvåke enkelt vesikkel endocytose ved hjelp av muse kromaffinceller som modellsystem. Denne teknikken gjør det mulig å analysere de regulatoriske mekanismer for vesikkel fisjon under endocytose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899 | |
| DMEM | 15066024 | Keep out of UV | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Life Technologies | ||
| Cover Glass | Carolina Biological | 633029 | 12 mm |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 100 ml |
| Insulin-Trans-Sel-X | Life Technologies | 51500056 | Only thaw on ICE! |
| Papain | Worthington | 39S11614 | |
| EPC-7 plus patch amplifier | HEKA | ||
| BNC-2090 data acquisition board | National Instruments | ||
| Igor data acquisition software | Wavemetrics | ||
| P-97 pipette puller | Sutter Instruments | ||
| Microforge | Scientific Instruments | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | B150-110-10 | Outer diameter: 1.5 mm Inner diameter: 1.10 mm Length: 10 cm |
References
- Rettig, J., Neher, E. Emerging roles of presynaptic proteins in Ca++-triggered exocytosis. Science. 298, 781-785 (2002).
- Gong, L. W., et al. Phosphatidylinositol phosphate kinase type I gamma regulates dynamics of large dense-core vesicle fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5204-5209 (2005).
- Lindau, M., Alvarez de Toledo, G.
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389, 509-512 (1997).
- Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. Capacitance flickers and pseudoflickers of small granules, measured in the cell-attached configuration. Biophys J. 75, 53-59 (1998).
- Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. The exocytotic fusion pore of small granules has a conductance similar to an ion channel. The Journal of cell biology. 129, 99-104 (1995).
- Dernick, G., Gong, L. W., Tabares, L., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. Patch amperometry: high-resolution measurements of single-vesicle fusion and release. Nat Methods. 2, 699-708 (2005).
- Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
- Gong, L. W., de Toledo, G. A., Lindau, M. Exocytotic catecholamine release is not associated with cation flux through channels in the vesicle membrane but Na+ influx through the fusion pore. Nature Cell Biology. 9, 915-922 (2007).
- Gong, L. W., Hafez, I., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. Secretory vesicles membrane area is regulated in tandem with quantal size in chromaffin cells. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 23, 7917-7921 (2003).
- Yao, L. H., et al. Actin polymerization does not provide direct mechanical forces for vesicle fission during clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 33, 15793-15798 (2013).
- Yao, L. H., et al. Synaptotagmin 1 is necessary for the Ca2+ dependence of clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 3778-3785 (2012).
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 12, 517-533 (2011).
- Murthy, V. N., De Camilli, P.
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51, 773-786 (2006).
- Rosenboom, H., Lindau, M. Exo-endocytosis and closing of the fission pore during endocytosis in single pituitary nerve terminals internally perfused with high calcium concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 5267-5271 (1994).
- MacDonald, P. E., Eliasson, L., Rorsman, P. Calcium increases endocytotic vesicle size and accelerates membrane fission in insulin-secreting INS-1 cells. Journal of Cell Science. 118, 5911-5920 (2005).
- Zhao, Y., Fang, Q., Straub, S. G., Lindau, M., Sharp, G. W. Hormonal inhibition of endocytosis: novel roles for noradrenaline and G protein G(z). J Physiol. 588, 3499-3509 (2010).
- Debus, K., Lindau, M. Resolution of patch capacitance recordings and of fusion pore conductances in small vesicles. Biophys J. 78, 2983-2997 (2000).
