Introduction
La transmission synaptique est médiée par exocytose des vésicules synaptiques contenant neurotransmetteurs, et ces vésicules doit subir recyclage d'endocytose locale dans la terminaison nerveuse de maintenir la communication neuronale dans le long terme. Compte tenu du rôle essentiel de la transmission synaptique dans le cerveau, la compréhension de la machinerie moléculaire qui constitue le cycle de la vésicule synaptique est un fondement essentiel pour une meilleure compréhension dans la communication cellulaire dans son ensemble. Parmi les systèmes de modèles de cellule, la cellule chromaffine surrénale a fourni une partie de la vision la plus définitive dans le mécanisme moléculaire sous-jacent recyclage des vésicules synaptiques. Exocytose, la dernière étape de la libération de neurotransmetteurs, a été extrêmement étudié et examiné par l'utilisation de la cellule surrénale chromaffin 1,2. En fait, la plupart des acteurs moléculaires qui orchestrent la formation, le ciblage, accueil, et la fusion des granules de sécrétion ont été identifiés grâce à l'application de divERSE techniques dans les cellules chromaffines 1. En outre, en offrant la possibilité de permettre la résolution unique vésicule de la machinerie protéique impliqué dans l'exocytose, la cellule chromaffin reste un modèle puissant pour répondre aux questions de la fusion des vésicules 3.
Mesures de capacité cellules ont d'abord été utilisés attaché à résoudre seul la fusion des vésicules pendant l'exocytose 3. L'exocytose de vésicules aussi petites que ~ 60 nm de diamètre ont été démontrées pour être détectée par des mesures admission de la membrane cellulaire avec la technique du patch clamp en configuration cellule attachée de 4-7. Entrée est définie comme une mesure de la facilité avec un circuit ou un dispositif permettront passage d'un courant; il est l'inverse de l'impédance. Ainsi, des mesures d'admission permettent de comprendre la capacité de la membrane. Ceci est accompli par l'incorporation de la membrane vésiculaire dans la membrane plasmique; cette incorporation révèle des changements dans la surfacezone 8. Chaque vésicule fusion provoque une augmentation progressive de la capacité de la membrane 9,10. De plus, cette mesure d'admission fournit la conductance de la membrane et la conductance des pores fusion lors d'une sortie 3 exocytose. Comme cette technique a fourni un outil unique à identifier cinétique simple vésicule pendant l'exocytose, notre laboratoire a récemment appliqué ce concept à détecter l'endocytose des vésicules de simples 11,12.
Notre intérêt particulier est la clathrine endocytose (CME), qui a été considéré comme un élément fondamental de ménage dans de nombreuses cellules 13 et en tant que principale voie d'endocytose des vésicules synaptiques dans les terminaux neuronales 14,15. CME est connu pour être biologiquement important, cependant, sa cinétique restent pas bien compris en raison de limitations techniques dans la surveillance des événements singuliers endocytose. Compte tenu des similitudes dans les mécanismes d'exocytose entre les cellules et les neurones 1 chromaffines, il est plausible que les mécanismes de fission dans les cellules chromaffines peuvent probablement s'appliquer à endocytose des vésicules synaptiques dans les neurones. Les mesures de capacité cell-attached ont été utilisés pour surveiller les événements d'endocytose individuels et analyser la cinétique de fission, dont la plupart des méthodes sont incapables de résoudre. Dans les enregistrements cell-attached, une onde sinusoïdale à 20 kHz est superposée sur le potentiel de maintien et le courant de sortie est séparé en la conductance membranaire dans un canal et la membrane capacitance dans l'autre canal à partir d'une à deux phases amplificateur à verrouillage 16 18. A partir des variations de la conductance de la membrane et de la capacité, on peut calculer la cinétique de la fission-pore, ce qui correspond vraisemblablement à la tubulure de membrane tubulaire qui relie la vésicule intériorisation de la membrane plasmique des vésicules avant pincement. Collectivement, cette technique nous donne l'occasion d'examiner les mécanismes de régulation de la vésicule fission pendant CME.
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Protocol
NOTE: L'ensemble de la procédure a été menée conformément aux lignes directrices des Instituts nationaux de la santé, tel qu'approuvé par le soin et l'utilisation des animaux Comité de l'Université de l'Illinois à Chicago.
1. Solutions et milieux de culture préparatifs
- Gardez toutes les solutions à -20 ° C pendant jusqu'à six mois. Gardez les milieux de culture à 4 ° C pendant 3 mois.
- Préparer 100 ml de milieu de culture en mélangeant 1 ml de solution de pen-strep et 1 ml de ITSX (insuline-transferrine-sélénium-supplémentation) à 100 ml avec du milieu DMEM.
- Préparer la solution enzymatique en mélangeant 250 ml de DMEM, 2,5 ml de 100 mM CaCl2, et de 2,5 ml de 50 mM d'EDTA.
- Préparer la solution d'inactivation en mélangeant 225 ml de DMEM, 25 ml de FBS, 625 mg d'albumine, et de 625 mg d'inhibiteur de la trypsine.
- Préparer la solution de NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, 5,0 mM de HEPES, 3,6 mM NaHCO3, 5,6 mM de glucose d'un Locke. Ajuster le pH à 7,3 avec NaOH.
- Préparer une solution de poly-D-lysine (PDL) de 50 mg / ml. Utiliser une concentration finale de 1 mg / ml de lamelles de revêtement.
- Préparer une solution extracellulaire du NaCl 140 mM, KCl 5 mM, CaCl2 2 mM, 1 mM de MgCl2, 10 mM de HEPES-NaOH, et 10 mM de glucose. Ajuster le pH à 7,3 avec NaOH avec une osmolarité de ~ 310 nmol / kg.
- Préparer une solution de pipette de 50 mM de NaCl, 100 mM TEACl, 5 mM de KCl, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, et 10 mM d'HEPES. Ajuster le pH à 7,3 avec NaOH avec une osmolarité de ~ 290 nmol / kg.
2. glande surrénale isolement
- Autoclave une paire de petits et grands ciseaux de dissection et deux paires de pinces. Porter des gants lors de tout le processus et placer le plateau de dissection sur un seau à glace.
- Utilisez la souris prises au jour 0-3. Euthanasier les animaux avec un réservoir de CO 2 sous pression suivie par décapitation.
- Utiliser le plus petit ensemble de ciseaux pour couper le long du dos du chiot qui suit la colonne vertébrale de cervi cal à caudale région. Veillez à couper superficiellement sous la peau et pas percer dans la cavité du corps.
- Ensuite, peler la peau loin de la colonne vertébrale ainsi que la musculature est exposé à avoir une vision claire de la colonne vertébrale. De là, faire une coupe transectional à la moelle épinière cervicale, puis faire deux coupes parallèles sur les côtés de la colonne vertébrale.
- Avec une paire de pinces qui maintiennent le corps principal de l'animal, utiliser l'autre paire de pinces pour attraper la colonne vertébrale et peler la colonne vertébrale jusqu'à reins sont exposés.
- A ce moment, les glandes surrénales visualiser sur le dessus des reins. Ensuite, placer soigneusement les deux glandes de chaque animal dans un tube conique rempli avec la solution de Locke.
REMARQUE: Parfois, les glandes s'en tiendra à la pince. Si tel est le cas, utiliser un autre doucement paire de pinces pour aider à l'élimination des glandes de la pince et dans la solution de Locke. Les glandes peuvent être maintenus dans cet état pendant jusqu'à 2 heures.
- Dans l'intervalle, la bulle de solution d'enzyme avec 5% de CO 2 + O 2 à 95% pendant 15 minutes avant utilisation. Assurez-vous que la solution équilibrée devient d'une couleur rose vif en couleur rose / orange.
- Ajouter la papaïne de la solution d'enzyme fraîchement barboter à une concentration finale de 20 à 25 unités / ml. Incuber chaque paire de glandes à partir de chaque animal pendant 40 à 60 min à 37 ° C dans la solution enzymatique avec de la papaïne.
- Ajouter 75% de solution d'inactivation de chaque tube et incuber à 37 ° C pendant encore 10 min. Cette incubation à inactiver l'activité enzymatique de la papaïne.
- Après l'incubation de 10 min avec la solution d'inactivation, les glandes transférer doucement dans un tube nouvellement marquée, puis laver les glandes 3x avec le milieu de culture.
4. cellule de dissociation et placage
- Après le lavage, placez les deux glandes dans 200 pi de milieu de culture, puis titrer doucement les glandes etvers le bas à travers la pointe de la pipette avec une pipette de 200 pi jusqu'à ce que il n'y a plus un gros morceau de tissu dans la solution.
REMARQUE: Lorsque le titrage, les glandes à maintenir le fond du tube avec une force vers le bas à partir de la pointe de pipette de 200 pi et engager doucement et lentement le tissu. Soyez certain d'utiliser lents, les coups continus, jamais pipetage rapide ou brusque. - Ajouter un support supplémentaire de 250 ul de culture pour amener le volume total de milieu de culture à 450 pi.
- Planche 60 ul de cette solution contenant des cellules sur chacun des sept lamelles 12 mm PDL-pré-enrobés, qui sont placés dans une boîte de culture de 60 x 15 mm.
- Une fois plaqué, placez le plat dans l'incubateur qui est fixé à 37 ° C et maintenue avec un débit / approvisionnement régulier de 5% de CO 2 pendant 30 minutes afin de garantir un environnement propice à la viabilité cellulaire. Après incubation, ajouter doucement 5 ml de milieu de culture pré-chauffé dans la boîte de culture et de retourner le plat de nouveau dans l'incubateur pendant 24 heures avant de la cellule-attachéenregistrements d.
NOTE: En règle générale, les cellules peuvent être utilisées pour des enregistrements électrophysiologiques pour 4 jours.
5. cellulaire Formation sceau d'identification et gigaohm
- Placer la lamelle couvre-objet de 12 mm dans la solution extracellulaire. Depuis l'ensemble des glandes surrénales sont utilisés pour la préparation de la cellule, mélanger les cellules chromaffines (généralement très lumineux avec un brun / beige coloration et une forme circulaire presque parfaite (figure 1) en culture avec des cellules corticales (petites et plus faible que les cellules chromaffines).
- Tirez les pipettes de patch en quatre étapes à l'aide programmable P-97 extracteur. Trempez la pointe de la pipette dans une cire fondue, ce qui contribuera à réduire la capacité du verre et ensuite le feu à ongles à la pointe "coup-away" cette cire à l'intérieur de la pointe de la pipette.
REMARQUE: Lorsqu'il est rempli avec une solution patch pipette, pipettes de patch ont généralement une résistance de ~ 2 MQ. - L'approche de la pipette de patch à proximité de la cellule au sein de plusieurs microns. Pour obtenir une configuration cellule attachée, comparer une légère déformation de la cellule au cours de l'approche de la pipette de patch plus proche de la cellule. Appliquer une aspiration douce jusqu'à un joint GQ est atteint.
6. enregistrements de capacitance cellulaires-joint
- Une fois un joint GQ se révèle, faire des enregistrements cell-attached grâce à l'utilisation d'un amplificateur EPC-7 plus de patch-clamp et un amplificateur analogique de verrouillage en deux phases (voir tableau ci-joint de l'équipement). Appliquer une onde sinusoïdale avec une amplitude de 50 mV (rms) et une fréquence de 20 kHz provenant de l'amplificateur lock-in.
- Régler le filtre de sortie de l'amplificateur de verrouillage à une constante de temps de 24 ms et db. Régler la phase de l'amplificateur de verrouillage de telle sorte que les changements de capacité de passage des impulsions produites par une aspiration douce apparaissent uniquement dans la trace correctif capacité (Im) sans saillie dans la pièce trace conductance (Re) (figure 2).
NOTE: S'il vous plaît voir les détails de l'étalonnage du système de reConférence 19. - Identifier les changements typiques de capacité par étapes "vers le bas" (figure 3).
NOTE: Un enregistrement solide sera considéré comme un "escalier" Type ressemblance avec de nombreuses étapes vers le bas, ce qui indique l'internalisation des vésicules simples. Le processus de correction sert une stimulation mécanique puisque le courant de l'action peut être généralement enregistré de la plupart des cellules. - Nommer les fichiers que les dossiers individuels y compris la date: jj / mm / an et chaque enregistrement cellule attachée comme sa propre numérotation individuelle (xx) dans ce fichier.
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Representative Results
La viabilité cellulaire et la qualité de l'étanchéité de gigaohm sont critiques dans la détermination de la qualité des enregistrements de capacité cell-attached. Par conséquent, il est essentiel de se procurer une culture cellulaire et efficace avant les enregistrements électrophysiologiques, et les cellules viables typiques sont illustrés dans la Figure 1. Pratique et l'heure vous seront utiles dans la réalisation d'un joint de gigaohm de haute qualité. Si l'on peut voir clairement la déformation de la cellule lorsque la pipette de patch se rapproche de la cellule, comme décrit dans le protocole étape 5.3, il ya une meilleure chance d'obtenir un joint de haute qualité. Figure 3 montre un enregistrement typique de la capacité de la membrane avec de multiples vers le bas les étapes associées à seul l'endocytose des vésicules.
Figure 1: Exemples de cellules chromaffines surrénales de souris viables24 heures après la culture cellulaire. Flèches pointent vers 3 cellules chromaffines viables. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure ajustement 2 de phase dans les enregistrements cell-attached. Avec le réglage de la phase initiale, des aspirations douces provoquer des modifications transitoires à la fois la capacité (Im) et conductance (Re) des traces, et les projections Re trace sont annulés par une phase de 23 ° passer. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 A c typiquecapacité ell-joint un enregistrement avec plusieurs étapes à la baisse, associés à simple endocytose des vésicules. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Mesure de la capacité de cellules attachée nécessitent plusieurs étapes critiques afin d'obtenir avec succès des enregistrements de haute qualité: 1) les cellules viables et sains préparés à partir des glandes surrénales; 2) PDL revêtement des lamelles couvre-objet; 3) la formation de joint de gigaohm; 4) le niveau de bruit du système; et 5) de correction de phase.
Pour la chirurgie des animaux, des modifications, on peut éventuellement faire est d'ajuster l'approche chirurgicale pour mieux dextérité de costume et de prévenir les dommages lors de la dissection. En outre, une pratique suffisante sur la localisation et l'élimination des glandes surrénales est impératif que les cellules qui seront utilisées pour les enregistrements électrophysiologiques proviennent exclusivement de la moelle de la glande surrénale. Pour la digestion enzymatique, il est important d'équilibrer la solution d'enzyme en faisant barboter la solution avec 5% de CO 2 + O 2 à 95%. S'assurer que le tube relié au cylindre est suffisamment étanche et sans fuite. De plus, assurez-vous que la fin in est correctement placé solution pendant toute la durée de barbotage 15 min; ceci peut être réalisé avec une extrémité mise à aiguille 20 G qui a été émoussé à l'extrémité du tube de façon à diriger l'écoulement d'air appropriée. En outre, plus de temps pour cette étape ne sera pas mal aussi longtemps que le flux d'air n'est pas aussi puissant que de déborder la solution dans le tube. Cellule de titrage est un autre élément essentiel qui se pratique. La majorité des cellules peut être endommagé si sur-titré; inversement, si titrage n'est pas assez, il y aura très peu de cellules isolées dissociées des tissus. Pour titrer efficacement, utiliser une pipette de 200 pi à la pipette de haut en bas 7-8x, en s'assurant que les glandes sont doucement passés par la pointe de la pipette 200 pi que vous titrez.
Pour le revêtement PDL, on peut toujours prolonger le temps d'incubation du PDL sur les lamelles jusqu'à 3 heures pour assurer suffisamment de revêtement de lamelles couvre-objet. Le revêtement PDL est essentiel pour les cellules chromaffines de joindreà grandir et sur les lamelles après plaquage de cellule. Si le revêtement PDL n'est pas suffisant, la plupart des cellules seront détacher de la lamelle, ce qui rendra la formation de joint de gigaohm difficile.
enregistrements cellulaires-joint peuvent toujours être modifiés et améliorés, comme la technique de correction est un processus dédié. Aspiration douce et subtile est essentiel pour faciliter la formation de joint de gigaohm lorsque la pipette de patch et de cellules sont en contact. Trop aspiration va détruire le contact correctif pointe-cellule et dans des situations extrêmes, les cellules peut être aspiré dans la pipette de patch. Ce sera très facile à observer sur l'oscilloscope en changeant dans une configuration cellule entière ou par une résistance minime de revenir à un très grand; la pratique est de la plus haute importance d'obtenir une formation de joint de gigaohm de haute qualité.
Bien que la résistance à haute étanchéité est critique pour réduire au minimum le niveau de bruit dans les enregistrements cell-attached, les deux étapes suivantes sont égalementimportant de réduire le niveau de bruit à résoudre les événements d'endocytose simples: (1) Dans la solution patch pipette, TEACl est utilisé pour bloquer les canaux K + voltage-dépendants; (2) la pointe de la pipette est enduite de paraffine et la cire collante à l'intérieur de l'embout de pipette peut être enlevée par polissage de la chaleur.
Alors que le réglage de la phase détaillée dans le protocole étape 6.2 est essentiel de mettre en place la phase initiale de l'enregistrement, cette étape peut ne pas être idéal. Par conséquent, il est important d'effectuer une correction de phase au cours de l'analyse fission-pore pour les événements individuels. A un potentiel de membrane au repos de -65 mV, les enregistrements de cellule entière montrent que une cellule chromaffine de la souris typique a une capacité d'entrée de 5 pF et une résistance d'entrée de 500 MQ, qui calcule la conductance de la membrane des cellules chromaffines de la souris comme ~ 0,4 pS / fF. Cela implique que l'événement endocytose avec une taille de capacité de 1 fF se traduira par une perte nette de conductance de la membrane de ~ 0,4 pS. Cette valeur est négligeable par rapport auypical 50-100 pS changement de conductance membranaire associée à l'endocytose fermeture fission-pores dans les enregistrements cell-attached. Par conséquent, nous sommes convaincus que notre correction de phase nous permet d'ajuster la ligne de base de la conductance membranaire tels que la fermeture avant et après la fission pores est au même niveau; ce processus peut apporter <erreur de 1% dans notre analyse des données.
En résumé, le protocole décrit ici montre comment les enregistrements de capacité cell-attached peuvent être utilisés pour surveiller unique endocytose des vésicules en utilisant des cellules chromaffines de souris comme système modèle. Cette technique permet d'analyser les mécanismes de régulation de la vésicule fission pendant l'endocytose.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899 | |
| DMEM | 15066024 | Keep out of UV | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Life Technologies | ||
| Cover Glass | Carolina Biological | 633029 | 12 mm |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 100 ml |
| Insulin-Trans-Sel-X | Life Technologies | 51500056 | Only thaw on ICE! |
| Papain | Worthington | 39S11614 | |
| EPC-7 plus patch amplifier | HEKA | ||
| BNC-2090 data acquisition board | National Instruments | ||
| Igor data acquisition software | Wavemetrics | ||
| P-97 pipette puller | Sutter Instruments | ||
| Microforge | Scientific Instruments | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | B150-110-10 | Outer diameter: 1.5 mm Inner diameter: 1.10 mm Length: 10 cm |
References
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