Introduction
A transmissão sináptica é mediada por exocitose de vesículas sinápticas contendo neurotransmissores e estas vesículas deve sofrer reciclagem endocítica local no terminal nervoso para manter a comunicação neuronal, a longo prazo. Dado o papel essencial da transmissão sináptica no cérebro, a compreensão do mecanismo molecular que constitui o ciclo de vesículas sinápticas é um fundamento essencial para uma melhor compreensão na comunicação celular como um todo. Entre os sistemas modelo de célula, a célula chromaffin adrenal tem proporcionado alguns dos insights mais definitivo na maquinaria molecular subjacente a reciclagem de vesículas sinápticas. Exocitose, o passo final na libertação de neurotransmissores, foi imensamente estudado e analisado por meio da utilização da célula cromafina adrenal 1,2. Na verdade, a maioria dos jogadores moleculares que orquestram a formação, a segmentação de encaixe, e fusão de grânulos de secreção foram identificados devido à aplicação do divtécnicas erse em células cromafins 1. Além disso, ao proporcionar uma oportunidade para permitir a resolução de um único vesícula da maquinaria proteína envolvida na exocitose, a célula cromafina continua a ser um poderoso modelo para resolver as questões de fusão das vesículas 3.
Medições de capacitância-attached celulares foram utilizados pela primeira vez na resolução de fusão única vesícula durante exocitose 3. Exocitose de vesículas pequenas como ~ 60 nm de diâmetro foram demonstrados para ser detectado por meio de medições de admissão da membrana celular com a técnica de patch-clamp na célula ligada configuração 4-7. A admissão é definido como uma medida da facilidade com um circuito ou dispositivo irá permitir que um fluxo de corrente; que é o inverso da impedância. Assim, as medições de admissão de fornecer uma compreensão da capacitância da membrana. Isto é conseguido através da incorporação da membrana vesicular na membrana plasmática; essa incorporação revela mudanças na superfícieárea 8. Cada vesícula fusão provoca um aumento gradual na capacitância de membrana 9,10. Para além disso, esta medição de admissão proporciona a condutância da membrana e a condutância de poros de fusão durante um evento exocitótico 3. Como essa técnica tem proporcionado uma ferramenta única de identificar cinética de um único vesícula durante exocitose, nosso laboratório foi recentemente aplicado esse conceito para detectar a endocitose de vesículas individuais 11,12.
Nosso interesse específico é mediada por clatrina endocitose (CME), que tem sido considerada como um componente fundamental na arrumação muitas células 13 e como uma via principal para sináptica endocitose de vesículas nos terminais neuronais 14,15. CME é conhecido por ser biologicamente importante, no entanto, sua cinética não ficar bem entendido devido a limitações técnicas no monitoramento de eventos endocíticas singulares. Dadas as semelhanças nos mecanismos exocíticos entre as células cromafins e neurônios 1, é plausible que os mecanismos de fissão em células cromafins, provavelmente, pode aplicar-se a vesícula sináptica endocitose em neurônios. As medidas de capacitância ligado de células foram utilizadas para monitorar eventos endocíticas individuais e analisar a cinética de fissão, que a maioria dos métodos não são capazes de resolver. Nas nossas gravações ligado de células, uma onda sinusoidal de 20 kHz é sobreposta sobre o potencial de manutenção, e a corrente de saída é separado a condutância da membrana em um canal e a capacitância da membrana no outro canal a partir de uma de duas fases amplificador lock-in 16 18. A partir das alterações na condutância da membrana e capacitância, pode calcular-se a cinética da cisão de poros, o que provavelmente corresponde ao gargalo da membrana tubular que liga a vesícula internalização da membrana do plasma antes da vesícula pinch-off. Coletivamente, essa técnica dá-nos a oportunidade de examinar os mecanismos de regulação da vesícula fissão durante CME.
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Protocol
NOTA: Todo o procedimento foi realizado de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde, aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso da Universidade de Illinois, em Chicago Animal.
1. Soluções e Meios de Cultura Preparações
- Mantenha todas as soluções a -20 ° C durante até seis meses. Mantenha o meio de cultura, a 4 ° C por até 3 meses.
- Preparar 100 ml de meio de cultura por mistura de 1 ml de solução pen-strep e 1 ml de ITSX (insulina-transferrina-selênio-suplementação) a 100 ml com DMEM.
- Preparar a solução de enzima por mistura de 250 mL de DMEM, 2,5 mL de 100 mM CaCl2, e 2,5 ml de EDTA 50 mM.
- Preparar a solução de inactivação pela mistura de 225 ml de DMEM, 25 mL de FBS, 625 mg de albumina, e 625 mg de inibidor de tripsina.
- Prepare uma solução de Locke de NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, HEPES 5,0 mM, NaHCO3 3,6 mM, glicose 5,6 mM. Ajustar o pH para 7,3 com NaOH.
- Prepara-se uma solução de poli-d-lisina (PDL) de 50 mg / ml. Use uma concentração final de 1 mg / ml para lamelas de revestimento.
- Prepara-se uma solução extracelular de 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 10 mM HEPES-NaOH, e 10 mM de glucose. Ajustar o pH para 7,3 com NaOH, com uma osmolaridade de ~ 310 nmol / kg.
- Prepara-se uma solução de pipeta de 50 mM de NaCl, TEACl 100 mM, KCl 5, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, e 10 mM de HEPES. Ajustar o pH para 7,3 com NaOH, com uma osmolaridade de ~ 290 nmol / kg.
2. glândula adrenal Isolamento
- Autoclave um par de tesouras de dissecação grandes e pequenos e dois pares de fórceps. Usar luvas durante todo o processo e colocar a bandeja de dissecação em um balde de gelo.
- Use camundongos tomadas no dia 0-3. Eutanásia animais com um tanque pressurizado de CO 2, seguida por decapitação.
- Utilizar o menor conjunto de tesoura para cortar a parte de trás do filhote após a coluna de cervi cal de caudal região. Certifique-se de cortar superficialmente sob a pele e não furar na cavidade do corpo.
- Em seguida, pele casca de distância da coluna vertebral para que a musculatura está exposto a ter uma visão clara da coluna vertebral. A partir daqui, fazer um corte transectional na medula espinhal cervical e, em seguida, fazer dois cortes paralelos ao longo dos lados da coluna vertebral.
- Com um par de pinças que seguram o corpo principal do animal, usar o outro par de pinças para agarrar coluna vertebral e descascar espinha até rins estão expostos.
- Neste momento, as glândulas supra-renais visualizar na parte superior dos rins. Em seguida, coloque cuidadosamente as duas glândulas de cada animal em um tubo cônico preenchido com solução de Locke.
NOTA: Às vezes, as glândulas vai ficar com a pinça. Se este for o caso, usam suavemente outro par de pinças para ajudar na remoção das glândulas de a pinça e para a solução de Locke. As glândulas podem ser mantidas nesse estado durante até 2 horas.
- No entanto, a solução de enzima de bolha com 5% de CO 2 + 95% de O 2 durante 15 minutos antes de usar. Certifique-se de que a solução equilibrada passa de uma cor-de-rosa brilhante em rosa / laranja cor.
- Adicionar a papaína para a solução de enzima recentemente borbulhar a uma concentração final de 20-25 unidades / ml. Incubar cada par de glândulas de cada animal para 40-60 min a 37 ° C na solução de enzima com papaína.
- Adicionar 75% de solução de inactivação para cada tubo e incubar a 37 ° C durante mais 10 min. Esta incubação inativa a atividade enzimática da papaína.
- Após a incubação de 10 min com a solução de inactivação, suavemente transferir as glândulas para um tubo novo rotulados e depois lavar as glândulas 3x com meio de cultura.
4. celular dissociação e Galvanização
- Após a lavagem, colocar as duas glândulas em 200 ul de meio de cultura e em seguida titula-se suavemente para cima e as glândulaspara baixo através da ponta da pipeta com uma pipeta de 200 uL até que não haja mais de um grande pedaço de tecido na solução.
NOTA: Quando a titulação, mantêm glândulas na parte inferior do tubo com uma força para baixo a partir da ponta de pipeta 200 uL e envolver o tecido suave e lentamente. Esteja certo de usar, traços contínuos lentos, nunca pipetar rápido ou abrupta. - Adicionar um meio adicional de 250 ul de cultura para levar o volume total de meio de cultura até 450 ul.
- Placa de 60 ul desta solução contendo as células em cada um dos sete lamelas 12 milímetros PDL-pré-revestidas, que são colocados em um 60 x 15 mm prato de cultura.
- Uma vez chapeado, colocar o prato na incubadora que está definida para 37 ° C e mantida com um fluxo / suprimento constante de 5% de CO 2 durante 30 minutos para assegurar um ambiente para a viabilidade celular. Após a incubação, adicionar cuidadosamente 5 ml de meio de cultura pré-aquecido no prato de cultura e devolver o prato de volta na incubadora durante 24 horas antes da célula-adidogravações d.
NOTA: Tipicamente, as células podem ser utilizadas para registos electrofisiolicos por até 4 dias.
5. celular Formação Identificação e gigaohm selo
- Coloque a lamela de 12 milímetros em solução extracelular. Como toda a glândulas supra-renais são utilizados para a preparação celular, misturar as células cromafins (normalmente muito brilhantes com um marrom / coloração bege e uma forma circular quase perfeita (Figura 1) em cultura com células corticais (menores e mais escuro do que as células cromafins).
- Puxe as pipetas de patch em quatro etapas usando um programável P-97 extrator. Mergulhe a ponta da pipeta em uma cera derretida, o que ajudará a reduzir a capacidade do vidro e, em seguida, disparar polonês ponta para "blow-away" esta cera de dentro da ponta da pipeta.
NOTA: Quando preenchido com solução de patch pipeta pipetas de patch normalmente têm uma resistência de ~ 2 mohms. - Aproxime-se da pipeta remendo perto da célula dentro de vários microns. Para obter uma configuração ligado à célula, para qualquer célula pequena deformação durante a aproximação da pipeta patch de mais perto da célula. Aplicar sucção suave até um selo GÊ seja alcançado.
6. Recordings capacitância Anexado-Cell
- Uma vez que um vedante GÊ é revelado, fazer gravações ligado de células, através da utilização de um amplificador EPC-7 mais de patch-clamp e um amplificador lock-in analógico de duas fases (ver tabela anexa do equipamento). Aplique uma onda senoidal com amplitude de 50 mV (rms) e freqüência de 20 kHz a partir do amplificador lock-in.
- Defina o filtro do amplificador lock-in de saída a 1 constante de tempo ms e 24 db. Defina a fase do amplificador lock-in de modo que as mudanças de capacitância transitórios produzidos por pulsos de sucção suave só aparecem no rastreamento de patch capacitância (Im) sem projeção para o traço remendo condutância (Re) (Figura 2).
NOTA: Por favor, veja os detalhes para a calibração do sistema de reference 19. - Identificar mudanças típicas de capacitância por etapas "para baixo" (Figura 3).
NOTA: A gravação sólida será visto como uma "escada" tipo de semelhança com muitos passos para baixo, o que indica a internalização vesículas individuais. O processo de correção serve como um estímulo mecânico desde atual ação pode ser normalmente registrada da maioria das células. - Nomear arquivos como pastas individuais, incluindo data: dd / mm / ano e cada gravação ligado à célula como a sua própria numeração indivíduo (xx) dentro desse arquivo.
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Representative Results
A viabilidade celular e a qualidade da vedação gigaohm são críticos na determinação da qualidade das gravações capacitância ligado de células. Portanto, é essencial para obter uma cultura de células eficazes e eficientes antes de registos electrofisiolicos, e células viáveis típicas são ilustradas na Figura 1. Prática e tempo será útil na obtenção de uma vedação gigaohm com alta qualidade. Se se pode ver claramente a deformação da célula quando a pipeta patch for aproximando da célula tal como descrito no protocolo Passo 5.3, há uma melhor possibilidade de obtenção de uma vedação de alta qualidade. Figura 3 demonstra uma gravação típico de capacitância de membrana com passos múltiplos para baixo associadas com endocitose vesícula única.
Figura 1. Exemplos de células cromafins supra-renais viável rato24 horas após a cultura de células. Setas apontam para três células cromafins viáveis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 Fase ajuste nas gravações ligado por células. Com a definição fase inicial, aspirações suaves causar alterações transitórias em ambos capacitância (Im) e condutância (Re) traços e as projeções em Re traço sejam anuladas por uma fase de 23 ° mudar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A Figura 3 c um típicocapacitância ell-inscritos gravação com várias etapas para baixo, associado a única endocitose das vesículas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Medições de capacitância anexado-Cell exigir várias etapas críticas, a fim de obter sucesso gravações com alta qualidade: 1) células viáveis e saudáveis preparados a partir de glândulas supra-renais; 2) PDL revestimento das lamelas; 3) de formação de selo gigaohm; 4) o nível de ruído do sistema; e 5) correção de fase.
Para a cirurgia animal, modificações pode potencialmente fazer é ajustar a abordagem cirúrgica para melhor atender destreza e para evitar danos durante a dissecção. Além disso, a prática suficiente sobre como localizar e remover as glândulas supra-renais é imperativo que as células que serão utilizados para registros eletrofisiológicos provêm exclusivamente da medula da glândula adrenal. Para a digestão enzimática, é muito importante para equilibrar a solução de enzima por borbulhando a solução com 5% de CO 2 + 95% de O 2. Esteja certo de que a tubulação conectada ao cilindro é suficiente e apertado sem vazamentos. Além disso, certifique-se de que o fim isolução de n é adequadamente colocada durante todo o tempo de borbulhamento de 15 min; isto pode ser conseguido com a colocação de uma ponta de agulha 20 G que foi reduzido na extremidade da tubagem de modo a dirigir o fluxo de ar de forma adequada. Além disso, o tempo adicional para esse passo não vai doer tanto tempo como o fluxo de ar não é tão poderoso quanto a transbordar a solução no tubo. Titulação celular é outro componente crítico que terá prática. A maioria das células pode ser danificado se o excesso de titulado; inversamente, se a titulação não é suficiente, haverá muito poucas células individuais isolados dissociadas de tecidos. Para titular efetivamente, utilizar uma ponteira l 200 a pipeta cima e para baixo 7-8x, certificando-se as glândulas são gentilmente passou pela ponteira 200 mL como titular.
Para o revestimento PDL, sempre se pode estender o tempo de incubação do PDL sobre as lamelas de até 3 horas para garantir a cobertura suficiente de lamelas. O revestimento PDL é crítica para células cromafins de anexare para crescer nas lamelas após plaqueamento de células. Se o revestimento PDL não é suficiente, a maior parte das células se separar da lamela, o que fará com que a formação de selo gigaohm difícil.
Gravações anexado-Cell pode sempre ser modificado e melhorado, como a técnica de correção é um processo dedicado. Sucção suave e sutil é fundamental para facilitar a formação de selo gigaohm quando a pipeta patch e celular estão em contato. Demasiada sucção vai destruir o contacto célula ponta remendo e em situações extremas, as células podem ser sugados para dentro da pipeta patch. Isto irá ser muito facilmente observada no osciloscópio mudando para uma configuração de célula inteira ou de uma resistência mínima de retornar para um muito grande; prática é de extrema importância para se obter uma formação de selo gigaohm alta qualidade.
Embora a resistência de alta vedação é crítica para minimizar o nível de ruído nas gravações ligado de células, os dois passos seguintes são tambémimportante para reduzir o nível de ruído para resolver os eventos individuais endocíticas: (1) Na solução de remendo pipeta, TEACl é utilizado para bloquear os canais de K + dependentes da voltagem; (2) a ponta da pipeta é revestida com cera pegajoso e a cera no interior da ponta de pipeta pode ser removido por calor polimento.
Embora o ajuste da fase protocolo detalhado no passo 6.2 é crítica para definir a fase inicial para a gravação, este passo pode não ser ideal. Portanto, é importante a realização de correção de fase durante a análise de fissão de poros para eventos individuais. A um potencial de membrana em repouso de -65 mV, as gravações de célula completa mostram que uma célula cromafina ratinho típico tem uma capacitância de entrada de 5 pF e uma resistência de entrada de 500 mohms, que calcula a condutância da membrana de células cromafins rato como ~ 0,4 pS / fF. Isto implica que um evento endocítica com um tamanho de capacitância de 1 fF irá resultar em uma perda líquida de condutância da membrana de ~ 0,4 pS. Este valor é insignificante em comparação com aTípica 50-100 pS mudança condutância da membrana associada a endocitose fechamento fissão de poros nas gravações ligado por células. Portanto, estamos confiantes de que a nossa correção de fase nos permite ajustar a linha de base de condutância da membrana tal que o encerramento de pré e pós-fissão dos poros é, ao mesmo nível; este processo pode trazer <1% de erro em nossa análise de dados.
Em resumo, o protocolo aqui descrito demonstra como gravações de capacitância ligado de células pode ser utilizado para monitorar a endocitose única vesícula usando células cromafins de ratinho como sistema modelo. Esta técnica permite analisar os mecanismos de regulação de vesículas durante a endocitose de fissão.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899 | |
| DMEM | 15066024 | Keep out of UV | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Life Technologies | ||
| Cover Glass | Carolina Biological | 633029 | 12 mm |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 100 ml |
| Insulin-Trans-Sel-X | Life Technologies | 51500056 | Only thaw on ICE! |
| Papain | Worthington | 39S11614 | |
| EPC-7 plus patch amplifier | HEKA | ||
| BNC-2090 data acquisition board | National Instruments | ||
| Igor data acquisition software | Wavemetrics | ||
| P-97 pipette puller | Sutter Instruments | ||
| Microforge | Scientific Instruments | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | B150-110-10 | Outer diameter: 1.5 mm Inner diameter: 1.10 mm Length: 10 cm |
References
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