שריר שלד הוא חיוני לתנועה, והוא חנות החלבון העיקרית של הגופים. מדידות בריאות שרירים בתוך סי אלגנס מתוארות. שינויים פוטנציאליים למבנה שרירים ובתפקודם הוערכו באמצעות ה- GFP מקומי וצבעים קטיוני.
שריר הוא רקמה דינמית המגיבה לשינויים בתזונה, פעילות גופנית, ומצב מחלה. אובדן מסת שרירים ובתפקוד עם מחלה וגיל הוא עול משמעותי על בריאות ציבור. בשלב זה אנו מבינים קצת על הרגולציה הגנטית של בריאות שרירים עם מחלה או גיל. סי אלגנס נמטודות הוא מודל שהוקם להבנת הרגולציה הגנומי של תהליכים ביולוגיים של עניין. קיר שרירי גוף של תולעת זו להציג מידה רבה של הומולוגיה עם השרירים של מינים מטזואניים גבוהים יותר. מאז סי אלגנס הוא אורגניזם שקוף, הלוקליזציה של ה- GFP למיטוכונדריה וsarcomeres מאפשרת הדמיה של מבנים אלה in vivo. באופן דומה, האכלת בעלי חיים צבעים קטיוני, אשר מצטברים על בסיס קיומו של פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה, מאפשר ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה in vivo. שיטות אלה, כמו גם הערכה של homeosta חלבון השריראחות, בשילוב עם הערכה של תפקוד שרירים בעלי החיים שלם, בצורה של מבחני תנועה, כדי לאפשר התאמה של פגמי משנה הסלולר עם פעולות פונקציונליות של ביצועי שרירים. כך, סי אלגנס מספק פלטפורמה רבת עוצמה שבה להעריך את ההשפעה של מוטציות, מציאה גן, ו / או תרכובות כימיות במבנה שרירים ובתפקוד. לבסוף, כGFP, צבעי קטיוני, ומבחני תנועה מוערכים הלא פולשני, ניתן לבצע מחקרים פרוספקטיביים של מבנה שרירים ובתפקוד בכל רחבי כמובן חיים וזה כיום לא ניתן לחקור בקלות in vivo בכל אורגניזם אחר.
שריר הוא רקמה רב תכליתי, להערכה גם לתפקידה בתנועה, תמיכה וחילוף חומרים יציבות. הפיתוח והתחזוקה של שרירים בריאים דורשים התיאום של תהליכים תאיים רבים ורכיבים. או דרך נזק או מחלה, חוסר ויסות יכול להתרחש, וכתוצאה מכך מבנה שריר שינה ו / או בתפקוד. ירידת גיל הקשורים בתפקוד שרירים מציגה נטל משמעותי לתקציבי בריאות בעולם המערבי, שכן מסת שריר 1,2 ובמיוחד כוח וסבולת שרירים 3-5 מתואם שלילי עם תמותה. המדידה של היבטים הקשורים בתפקוד שרירים מתדרדר כגון מיטוכונדריה שינו או שיבוש sarcomere, יכולה לאפשר הבנה טובה יותר של המנגנונים שבבסיס פיתוח שרירים כללי ובריאות.
elegans aenorhabditis C (סי אלגנס) הוא BES נמטודות מיקרוסקופילא ידוע כי זה היה אורגניזם רב-תאי הראשון שיש כל הגנום שלו רצף 6, הראשון לגנים המושתקים באמצעות 7 RNAi, ומטזואניים רק כדי elegans 9 נקבע. ג השושלת כל תא 8 וneuroanatomy הוצע לראשונה כ מודל ללימוד הבקרה הגנטית של התנהגות בשנת 1974 על ידי סידני ברנר 10 ואת החשיבות של זה ואת העבודה שלאחר מכן הוכר עם הראשון של שלושה פרסי הנובל שהוענק לחוקרי C. elegans. כ -35% מC. elegans גנים זיהו orthologues בבני אדם, עם סי אלגנס להיות האורגניזם מפתח המשמש להבנת הבקרה הגנטית של התפתחות שרירים 11. כמעט בכל גן בגנום סי אלגנס יכול להיות שברה באמצעות RNAi 7,12. כך, על ידי דריסה גנים בשרירים מפותחים במלואו, מרכיבים גנטיים תורמים למחדשgulation בריאות שרירים יכול להיחקר עם פשטות היחסית 13.
היכולת המשולבת לשימוש, מוטציות, ותרכובות כימיות RNAi עושה C. elegans מערכת מובילה לחקר הרגולציה הגנטית 7,14,15 של מבנה שרירים ובתפקוד עם גיל 16 ובמודלים של מחלות 17. ההשפעה של מציאה גן, מוטציה, ו / או חשיפה לחומרים כימיים במבנה שריר ו / או תפקוד ניתן למדוד באמצעות היבטים רבים. כאן אנו מתארים בקצרה טכניקות פשוטות להערכת מבנה C. elegans שרירים ובתפקוד, שרבים מהם יכולים לשמש במחקרים פרוספקטיביים של בריאות שרירים.
הפיתוח של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) 18 אפשר להדמיה של שני היישוב של חלבונים ספציפיים והמבנה הכללי של האברונים ב C. elegans. כאן אנחנו מסבירים כיצד ה- GFP הביע ספציפיfically בתוך המיטוכונדריה קיר שרירים גוף, ניתן להשתמש בגרעינים, או sarcomeres כדי לקבוע אם ניוון של מבנים תת-תאיים אלה הוא הווה. כמבנה הוא לא תמיד תחליף אמין לפונקציה, אנחנו גם מסבירים כיצד השימוש בצבע קטיוני in vivo מאפשר הערכת פוטנציאל קרום המיטוכונדריה פגום שבתוך שריר. כאשר הצבעים משמשים בשילוב עם ה- GFP, שמתירים ללימודי אדריכלות ולתפקד באופן זמני לאורך כל חיים. לבסוף, אנחנו גם מסבירים כיצד הומאוסטזיס חלבונים בתוך שריר ניתן להעריך וכיצד כל אלו, ניתן להשתמש כדי לתאם שינויים בבריאות שרירים בעלי החיים שלמים באמצעות שימוש במבחני תנועה. טכניקות אלו, בשילוב עם מציאה גן, מוטציות, ו / או תרכובות כימיות לספק ארסנל רב עוצמה ללימוד כיצד גנים או תרכובות מסוימים להשפיע על בריאות שרירים בגוף חי. המקבילות במבנה, חילוף חומרים ותפקוד ברוטו של שריר בין סי אלגנס ויונקים אומר סי אלגנס הוא אורגניזם מודל מצטיין להבנת הרגולציה של שריר באורגניזמים שונים, לרבות בני אדם.
שיטות אלה מאפשרות חקר של שריר מ macrophysiology של תנועה לזיהוי פגמי subcellular שיש בם כדי לגרום לפגם תנועה. בשילוב שיטות אלה יאפשרו ניתוח מפורט של שרירים. תובנה שנרכשו מאפשרת בדיקות נוספות של השערות בכיוון שרירים הקשורים לפיזיולוגיה כללית, הפתופיזיולוגיה והזדקנות.
מבחני תנועה
פגם תנועה מציין הפרעה בתפקוד עצבי-שרירית נורמלית. זה עשוי להיות ספציפי לעצבים או שרירים או שהוא עשוי להיות משותף בין כמה רקמות. השלבים הקשים ביותר של מבחני תנועה השלימו בוחרים תולעים שהם מייצג של האוכלוסייה ו / או הטיפול, וגם להבטיח כי הניסוי אינו פוגע בבעלי החיים בעת ההעברה לM9. חשוב להיות בגודל מדגם גדול לקבל הערכת נציג ומדויקת של תנועה. כאשר מנסים לאמוד מאוד עטהשפעות etrant, למשל ראו בתדירות גבוהה במוטציות, גודל מדגם של עשרה בעלי חיים כל העריך לתנועה פי עשרה הוא מספיק כדי למצוא הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית לעומת wild-type. עם זאת, הפשטות של מבחני תנועה וקלות של C. elegans culturing אומרת שמאות תולעים יכולים במהירות להיות מוערכות על מנת להבטיח תוצאות כמותית חזקות. כאשר מנסים לאמוד את ההשפעות המופיעות כיום רק בחלק של אוכלוסייה חשוב כדי לקבוע מה חלקה של האוכלוסייה מופיעה להיות מושפע, כמו גם את חומרת הפגם בבעלי החיים המושפעים ביותר. במצבים כאלה מספרים גדולים יותר של בעלי חיים צריכים להיות מוערכים על מנת לספק נתונים מינימאליים לשיעור האוכלוסייה שנפגעה. לעתים קרובות הן תרופה וטיפולי RNAi יפיקו פגמי תנועה חמורים בחלק קטן מהאוכלוסייה. במקרים מסוימים להגדיל את המינון של הטיפול ואו את שיטת המשלוח יגדיל את חלקם של AFFבעלי חיים השתקפו ועקומות מינון תגובת ריצה עשויים להיות שימושיים בקביעת הריכוז האופטימלי של תרופה או RNAi. מגבלה שנייה של assay תנועה זו היא שהתולעים הם מניפולציה כדי להעריך תנועה. כך, התולעים הם גירוי והן חשופים למידה מסוימת של לחץ האוסמוטי, כאשר הרים לנוזל. מידת לחץ האוסמוטי יכולה להיות מוגבלת על ידי שימוש M9 או BU חיץ 19 בניגוד למים. חלק מהמגבלות הללו נעלמות על ידי מדידת תנועה רגילה על צלחות באמצעות מערכות זמינות מסחרי מעקב 34 או תוספות תוסף חינם עבור 35 ImageJ. מדידת קצב התנועה של בעלי חיים יכול לספק מידע חשוב לגבי בריאות שרירים כללית, ובכלל זה שינויים בתפקוד שניתן למדוד לאורך חיי ואינה הפולשנות של שיטה זו היא מפתח ללימודים לכל חיים פוטנציאליים של תפקוד שרירים.
הדמיה של מכשירי ההתכווצות
<class = "jove_content" p> מתח התולעת משמש כאן למבנה מנגנון התכווצות תמונה היה PJ727 36 המבטא חלבון היתוך GFP שרירן שהוא מקומי לsarcomeres בתוך קיר שרירי גוף. שימוש בזן זה מאפשר הדמיה של מבנה sarcomere בבעלי חיים. בדומה לassay התנועה שתואר לעיל, יתרון מרכזי של שימוש בsarcomeres GFP שכותרתו להעריך מבנה sarcomere הוא שהשיטה היא יחסית לא פולשנית, ולכן ניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר מכאן ולהבא מבנה sarcomere בבעלי חיים בודדים במהלך החיים. הקושי הגדול ביותר בשיטה זו הוא שהתולעים שלהיות הדמיה עדיין בחיים, ולכן נעו, מה שהופך את זה קשה לקבל תמונות ממוקדות היטב. יכולים להיות מועסקים במספר שיטות כדי להפחית את התנועה ולהפוך את ההדמיה פשוטה; אלה כוללים הרדמה או לשתק את התולעים והקיבוע באמצעות לחץ, יניקה, או שימוש בפתרון צמיגות גבוה. כל אחת משיטות של immobiliz אלהיש ation החסרון שהוא יכול לשנות את התפקוד עצבי-שרירית עצמו. לכן, זה חיוני לכלול פקדים שלא טופלו מתאימים בניתוח. זה יכול להיות גם נבון לנצל לפחות שתי שיטות עצמאיות של חוסר תנועה כדי לאשר את התוצאות הן לא בגלל בעיות בשיטת הקיבוע, תלוי איך שימוש נרחב בשיטת הקיבוע שנבחרה היא לשאלה הנחקרת. כאן השתמשנו בלחץ פשוט מcoverslip לתולעת כדי לגרום לתנועה מופחתת. לאחר שהניח את coverslip, הנוזלים מתחת coverslip יתאדו וcoverslip כתוצאה מכך יתחיל לייצר יותר לחץ על התולעים, בדרך כלל זה לוקח 2-5 דקות כדי לייצר תנועה מופחתת מספיק כדי לאפשר הדמיה קלה.זה חיוני כדי לפקח על התולעים מקרוב אחרי coverslip כבר הציג כלחץ יגדיל סופו של דבר מספיק כדי לגרום לתולעים להתפוצץ מלחץ מוגזם, בדרך כלל 10-15 דקות לאחר שיתוףבנוסף verslip. מאגר נוסף יכול להיות הציג בסיוע pipet קצה מסביב לקצוות של coverslip כדי למנוע פגיעה למעוך לתולעים. לכה לציפורניים יכול לשמש כדי לאטום את הקצוות של להחליק את המכסה ולמנוע אידוי, אם כי זה מונע שליפה של בעלי חיים מתחת להחליק את המכסה, אם תרצה בכך. באופן דומה, השימוש בחרוזי סיליקון בפתרון יכול לעזור להפחית את כמות לחץ מקומות coverslip על התולעים.
בדיוק כמו עם ההערכה לפגם תנועה, חשוב לשקול את החדירות של השפעה. חדירות יכולות להיחשב גבוהות אם בעלי חיים 80-100% להציג פנוטיפ על צלחת NGM, חלקיים, אם 21-79% ונמוכים אם ≤20% מתצוגת האוכלוסייה משפיעים. להשפעות penetrant מאוד, ניתן להשתמש בגודל מדגם קטן יותר כדי לייצר נתונים כמותיים באופן משמעותי על פגמי sarcomere. במקרים בהם את ההשפעה שיש חדירות נמוכות, מבחר של בעלי חיים המציגות פגם תנועה ברור בתגובה לתרופהאו טיפול RNAi עשוי להיות שימושי במנסה לאמוד פגמי sarcomere בבעלי החיים המושפעים ביותר על ידי הטיפול. עם זאת, זה לא בהכרח המקרה שעל תנועה ומבנה התת-תאי מידת השפעת הטיפול היא אותו. כך, זה עשוי להיות רצוי לבחון את מידת הפגמים קיימים באוכלוסייה גדולה, למשל 100 בעלי חיים. זה מאפשר הבנה של חלוקת פגמים בכל אוכלוסייה. זה יכול להיות גם רצוי לבחון את מידתו של הפגם בבעלי החיים שנפגעו בצורה חמורה ביותר ו / או לבחון את הקשר בין המידה של פגם sarcomere ושל פגם תנועת מידה. קשיים פוטנציאליים בצד, בשיטה זו היא מהירה וקלה יותר מאשר שיטות אחרות של הערכת מבנה sarcomere. מהירות וקלות זהו, עם זאת, בכפוף למגבלה עיקרי, sarcomeres המכיל חלבוני היתוך GFP הוא לא לגמרי נורמלי 37, ולכן הערכה של sarcomeres שיבש צריכה להיות מאושרת תוך שימוש בשיטות עבודה אינטנסיבית יותר נוספות.שיטות אלה כוללות שימוש באור מקוטב 38, phalloidin מכתים 39, וimmunofluorescence העקיף 40. שיטות אלה, רק אור מקוטב הוא יחסית לא פולשנית; השיטות האחרות דורשות קיבוע ולכן לא ניתן להשתמש במחקרים פרוספקטיביים של בעלי חיים בודדים, ולא שהם יכולים לשמש רק כדי לאשר, לחצות sectionally, תוצאות ממחקרים כאלה.
הדמיה של מיטוכונדריאלי רשתות
זן התולעת המשמש לניסויי הדמיה המיטוכונדריה היה CB5600 7 המבטא חלבון היתוך GFP המקומי למיטוכונדריה וחלבון היתוך GFP β-galactosidase המקומי לגרעינים, הן בקיר שרירי גוף. כמו בשימוש בPJ727 לsarcomeres הדמיה, שימוש בזן זה מאפשר הדמיה של מבנה רשת של המיטוכונדריה בבעלי חיים. כך, זן זה יכול לשמש כדי להעריך את השינויים דינמיים המתרחשים, לדוגמא mitocho המופחתתהיתוך ndrial ו / או ביקוע של המיטוכונדריה מוגברת 41. גם כעבור sarcomeres הדמיה, הקושי הגדול ביותר בשיטה זו הוא שהתולעים להיות הדמיה עדיין בחיים ומרגשים, שהופך אותו קשה כדי לקבל תמונות ממוקדות היטב. בעוד כמה שיטות, כפי שנדון ביתר פירוט לעיל, יכולות להיות מועסקות על מנת להפחית את התנועה, המיטוכונדריה מופיעה רגישה במיוחד להתערבויות שגורמות לתנועה מופחתת. לדוגמא, נפוץ ביותר רכיבי יעד הרדמה של שרשרת הנשימה במיטוכונדריה ולכן יש להשתמש בזהירות במחקרים של מבנה המיטוכונדריה נורמלי ותפקוד. בדומה לכך, רוב סוכני שיתוק יש להשתמש בזהירות במחקרים של מבנה המיטוכונדריה נורמלי ותפקוד, כמו רוב סוכני שיתוק לגרום פחות אות תעבור דרך הצומת העצבית-שהרירית וdenervation התפקודי של השריר מספיק כדי לגרום לפיצול של המיטוכונדריה. הניסויים במחקר זה מועסקים לחץ כדי לשתק בעלי חייםשל אבל אחרים השתמשו בהצלחה levamisole 42, למרות שזה חיוני לבעלי חיים תמונה באופן מיידי.
לבסוף, מזהמים שונים בקטריאלי בתרבויות, לsubtilis דוגמא ב ', יכולים לגרום לפיצול במיטוכונדריה; לכן זה חיוני לכלול פקדים שלא טופלו מתאימים בניתוח. להשפעות penetrant מאוד, ניתן להשתמש בגודל מדגם קטן יותר כדי לייצר נתונים כמותיים באופן משמעותי על פגמי רשת המיטוכונדריה. עם זאת, בשל השכיחות של ליקויים קלים ברשת של המיטוכונדריה, מספר הקטן של בעלי חיים עשוי להיות פי שניים מהמספר הדרוש להערכה של מבנה sarcomere. במקרים בהם את ההשפעה שיש חדירות נמוכות, מבחר של בעלי חיים באופן ברור בו מוצגות פגם תנועה בתגובה לתרופה או טיפול RNAi עשוי להיות שימושי במנסה לאמוד פגמים במיטוכונדריה בבעלי החיים המושפעים ביותר על ידי הטיפול. עם זאת, כאמור לעיל, זה לא בהכרח המקרה שמידת השפעת הטיפול בתנועה ומבנה התת-תאים זהה. כך, זה עשוי להיות רצוי לבחון את מידת הפגמים קיימים באוכלוסייה גדולה, למשל 150-200 בעלי חיים, כמו גם את מידת ההפרעה בבעלי החיים שנפגעו בצורה קשה ביותר ונוכחות או עדר של הפרעה המידה עם של מידה פגם תנועה. זנים אחרים עם המיטוכונדריה שכותרתו fluorescently ניתן להשתמש כדי לאשר את התוצאות שהושגו בCB5600, לעומת זאת, השימוש בחלבוני ניאון שונים יכולים להשפיע על הרשת בנקודת ההתחלה של המיטוכונדריה. לדוגמא, השימוש בחלבון היתוך RFP-20 tomm לדמיין המיטוכונדריה נראה לגרום להגברת פיצול המיטוכונדריה בסיסית לעומת השימוש של ה- GFP המקומי mitochondrially 17. בעוד שניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון immunofluorescence במיקרוסקופ אלקטרונים כדי להעריך מבנה המיטוכונדריה, הם לא מאפשרים הערכת vivo של דינמיקה במיטוכונדריה כי צעד קיבעון הוא מחייבד. שיטות אחרות כגון שימוש בצבעים מקומיים mitochondrially ניתן להשתמש ללא קיבעון ולכן יכולות לשמש גם במקום שימוש של ה- GFP המקומי mitochondrially. כפי שנדון בסעיף הבא, שימוש בצבע כזה גם מאפשר הערכה גסה של in vivo תפקוד המיטוכונדריה.
הערכת פוטנציאל מיטוכונדריאלי ממברנה in vivo ב C. elegans
מגוון של צבעים זמינים למיטוכונדריה תיוג 28. צבעים אלה מספקים שיטה חלופית לדמיין מבנה רשת של המיטוכונדריה ב C. elegans החי. רבים מצבעים אלה גם לאפשר הערכה גסה של פונקציונליות של המיטוכונדריה in vivo, כי הם מצטברים במיטוכונדריה המבוססת על פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה. כאן השתמשנו H C 32 32 Cl 2 N 2 O שנצרך דרךמערכת עיכול, עם כמה בנוסף נכנס התולעת באמצעות הציפורן בגלל permeabilization המוענק על ידי להיות מומס ב0.5% DMSO. בעקבות כניסתו לתא C 32 H 32 Cl 2 N 2 O מתחמצן ומוחרם על ידי המיטוכונדריה שם הוא נקשר גופרית המכילה חומצות אמינו (לדוגמא: מתיונין וציסטאין). ההיווצרות של קומפלקסי צבע-פפטיד אלה משמעות C 32 H 32 Cl 2 N 2 O נשאר במיטוכונדריה שכותרתו 28 פעם. קושי עיקרי עם השימוש בצבעי המיטוכונדריה הוא שהם יהיו תווית כל המיטוכונדריה בבעלי החיים. לכן יש לנו לבצע תיוג בCB5600, אותו הזן שתואר לעיל להערכת מבנה רשת של המיטוכונדריה שרירים. על ידי שימוש בצבע אדום במיטוכונדריה, זן של תולעים להביע GFP במיטוכונדריה שרירים, ולעבור סינון משולש, זה הוא יחסית פשוט לתמונת מיטוכונדריה רק בשריר על ידי מציאת המיטוכונדריה שoטווח על ידי colocalization של צבע אדום ומיטוכונדריה GFP שכותרתו. הצעד הקשה ביותר בביצוע גישת colocalization זה הדמיה כי הצבע הוא בתוך שניות תחת אור הניאון בעוצמה גבוהה-מולבן תמונה. השפעה זו יכולה להיות מוגבלת על ידי שמירה על הקרינה בעצמה נמוכה עד הנסיין מוכן תמונה ולאחר מכן להתאים את עוצמת הקרינה בהתאם. ברגע אחד הוא חווה עם השימוש בצבעי גישה אחרת היא להשתמש במיקרוסקופ confocal עם Z- ערימות לתמונה מיטוכונדריה בלבד ברקמה תקין; רשתות המיטוכונדריה בשרירים הן די ברורות בהשוואה לרקמות אחרות. לרוע המזל, חוסר היכולת של C 32 H 32 Cl 2 N 2 O לעזוב המיטוכונדריה 28 משמעות הדבר היא כי, בניגוד לטכניקות sarcomere וההדמיה של המיטוכונדריה שנדונו לעיל, אין היא יכולה להשתמש בהם כדי לעקוב מכאן ולהבא אובדן תפקוד המיטוכונדריה עם זמן, אלא אם כן C 32 H 32 Cl 2 N 2 Oהוא הוסיף בנקודות זמן בדידות להפריד בין אוכלוסיות בעלי חיים. מגבלה זו ניתן להתגבר על ידי שימוש בצבעים כגון JC-10 שעושים לעזוב את המיטוכונדריה על קריסה של קרום פוטנציאלי 43. יכולה גם להיות מבודדת המיטוכונדריה מג 30 elegans עבור ניתוחים ביוכימיים שלאחר מכן. חילוץ כזה מאפשר כימות של פוטנציאל קרום המיטוכונדריה על ידי כימותי שיעור ספיגת lipophilic צבע קטיוני באמצעות cytometry זרימה או צלחת קורא ניאון 44. לאחר שבסס את פוטנציאל קרום המיטוכונדריה פגום, אפשר גם לקבוע אם אובדן שיפוע פרוטון מתורגם לאובדן של ייצור ATP באמצעות שיטה המבוססת על לוציפראז bioluminometric רגישה 45.
הערכת פירוק חלבונים בג elegans
זן התולעת משמש כאן להערכת פירוק חלבוני שריר היה PD55, המכיל β ספציפי שרירים-galactosidase שמסונתז ברציפות לאורך התפתחות עד שתגיע לבגרות ואשר נשארה יציב בcytosol ל72-96 שעות הבאות 19. כך, מדידה של רמות β-galactosidase במהלך פיתוח בעיקר מציינת את ההשפעה של התערבויות על סינתזה מאמרגן שרירן ואילו ההפסד של β-galactosidase במהלך הבגרות מצביעה על התערבות ביאה מוגברת פירוק חלבוני cytosolic 19. צעד מפתח בהערכת פעילות β-galactosidase הוא להבטיח התייבשות יעילה. אי לייבש ביעילות בעלי החיים תוצאות בהפרשה לקויה של מצע X-gal וצבע כחול עני ולכן בגוף קיר שרירים של בעלי החיים. כדי להבטיח התייבשות טובה החותם על הייבוש צריך להיבדק והמדגם צריך להיבדק ב5-10 דקות במרווחים לאורך התייבשות כדי להעריך את ההתקדמות (כלומר, מדגם 20 μl צריך מיובש בתוך 10 דקות ו -20 דקות שנותרוהוא להבטיח התייבשות מקיפה). Assay β-galactosidase הוא assay פעילות לכן בקרה נאותה חיונית. בנוסף, ירידה בהכתמה של מבוגרים במצב טיפול ביחס לשליטה אינו מוכיח השפלה שמתרחשת; אלא מציין ירידה בפעילות האנזימטית בתגובה לטיפול. כדי לאשר השפלה, יותר ניתוח כתם מערבי עתירת עבודה חייב להסתיים נגד β-galactosidase 13 וזה מאפשר פירוק חלבוני כימות באוכלוסיות קטנות של תולעים נספרים. ניתן לכמת צפיפות להקת כתם מערבית באמצעות ImageJ 46. מגבלה נוספת של שיטה זו היא כי השימוש בחלבונים מהונדסים אינו מודיע כלמטרות פיזיולוגיות של השפלה ותשובות כגון כתמים מערביים השערה מונעת proteomic ו / או ממוקדים חייבים להיות מועסקים 13. לבסוף, כסינתזה של החלבון המהונדס המועסק במחקרים אלה סוגרים את בבגרות המוקדמת 19 </sup>, שיטות אחרות חייבים להיות מנוצלים כאשר מבקשים לבחון שינויים בסינתזה של חלבוני שריר בג המפותח במלוא elegans שרירים; לדוגמא, שיטות איזוטופ יציבים או רדיואקטיבי.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a grant from the US National Institutes of Health National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (AR-054342) to NJS. CJG was funded by a Doctoral training studentship funded by the University of Nottingham. JJB was funded by an MRC Doctoral training award (J500495). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) | Invitrogen | M-7512 | Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential |
DMSO | Thermo Scientific | 67-63-5 | |
KH2 PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
Na2HPO4 | BDH | 301584L | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
MgSO4 | Sigma | M-7506 | |
Microscopy Slides | Starfrost | K220 | |
Microscopy Cover Slips | VW2 International | 631-0124 | |
1.5ml Eppendorph Tubes | Fisher Scientific | FB74031 | |
Dessicator | Nalgene | D2672 | |
Nikon Microscope | Nikon | H600L | Nikon H600L microscope with proprietary software |
Nikon Camera | Nikon | DS-Fi1 | Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera |
Zeiss Microscope | Zeiss | Ax10 | Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter |
Plates 9cm | Starstedt | 82-1473 | |
Plates 6cm | Gosselin | BP53-01 | |
Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
Na3PO4 | Sigma-Aldrich | 7601-54-9 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside | Sigma-Aldrich | 7240-90-6 | |
N,N8-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 68-12-2 | |