El músculo esquelético es esencial para la locomoción y es la tienda principal proteína de los cuerpos. Se describen las medidas de salud musculares dentro de C. elegans. Los posibles cambios en la estructura y la función muscular se evaluó a través de las buenas prácticas agrarias localizadas y colorantes catiónicos.
El músculo es un tejido dinámico que responde a los cambios en la nutrición, el ejercicio, y el estado de la enfermedad. La pérdida de masa muscular y la función con la enfermedad y la edad son cargas importantes de salud pública. Actualmente entendemos muy poco sobre la regulación genética de la salud muscular con la enfermedad o la edad. El nematodo C. elegans es un modelo establecido para la comprensión de la regulación genómica de los procesos biológicos de interés. Músculos de la pared del cuerpo de este gusano muestran un alto grado de homología con los músculos de las especies de metazoos superiores. Desde C. elegans es un organismo transparente, la localización de GFP a las mitocondrias y sarcómeros permite la visualización de estas estructuras en vivo. Del mismo modo, la alimentación de animales colorantes catiónicos, que se acumulan basa en la existencia de un potencial de membrana mitocondrial, permite la evaluación de la función mitocondrial in vivo. Estos métodos, así como la evaluación de la proteína muscular homeostasis, se combinan con la evaluación de la función muscular animal completo, en forma de ensayos de movimiento, para permitir la correlación de defectos sub-celulares con medidas funcionales de rendimiento muscular. Así, C. elegans proporciona una potente plataforma con la cual evaluar el impacto de las mutaciones, caída de genes y / o compuestos químicos sobre la estructura y la función muscular. Por último, como GFP, colorantes catiónicos, y los ensayos de movimiento se evalúan de forma no invasiva, los estudios prospectivos de la estructura y la función muscular pueden llevar a cabo en todo el curso de la vida y esto en la actualidad no pueden ser fácilmente investigaron in vivo en cualquier otro organismo.
El músculo es un tejido multifuncional, muy apreciado por su papel en la locomoción, el apoyo postural y el metabolismo. El desarrollo y mantenimiento de músculo sano requiere la coordinación de múltiples procesos y componentes celulares. Ya sea a través daño o enfermedad, puede ocurrir la desregulación, resultando en la estructura muscular alterada y / o función. Declive asociado a la edad en la función muscular presenta una importante carga para los presupuestos de salud en el mundo occidental, ya que el músculo masa 1,2 y particularmente la fuerza muscular y la resistencia 3.5 se correlacionó negativamente con la mortalidad. La medición de los aspectos relacionados con el deterioro de la función muscular, tales como la función mitocondrial alterada o perturbación sarcómero, se puede lograr una mejor comprensión de los mecanismos que sustentan el desarrollo muscular y la salud en general.
Elegans C aenorhabditis (C. elegans) es una microscópicos bes nematodost sabe porque fue el primer organismo multicelular tener la totalidad de su genoma secuenciado 6, el primero en tener los genes silenciados mediante RNAi 7, y la única metazoos tener sus todo linaje de células 8 y 9 neuroanatomía determinado. C. elegans fue propuesto por primera vez como un modelo para el estudio del control genético de la conducta en 1974 por Sydney Brenner 10 y la importancia de esto y el trabajo posterior fue reconocida con el primero de los tres premios Nobel otorgados a C. elegans investigadores. Aproximadamente el 35% de C. elegans genes ortólogos han identificado en seres humanos, con C. elegans ser un organismo clave utilizada para entender el control genético del desarrollo muscular 11. Casi todos los genes en el genoma de C. elegans puede ser derribado mediante RNAi 7,12. Por lo tanto, derribando los genes en el músculo completamente desarrollado, los componentes genéticos que contribuyen a la regulación de la salud muscular puede ser investigado con relativa sencillez 13.
La capacidad combinada de usar RNAi, mutantes, y compuestos químicos hace que C. elegans un sistema principal de la exploración de la regulación genética 7,14,15 de la estructura y función de los músculos con 16 años de edad y en modelos de enfermedad 17. El impacto de la caída de genes, mutación y / o la exposición a compuestos químicos sobre la estructura y / o función muscular puede medirse a través de múltiples aspectos. Aquí se describen brevemente las técnicas simples para la evaluación de C. elegans estructura y función muscular, muchos de los cuales se puede utilizar en estudios prospectivos de la salud del músculo.
El desarrollo de la proteína fluorescente verde (GFP) 18 ha permitido la visualización tanto de la localidad de proteínas específicas y la estructura general de los orgánulos en C. elegans. Aquí le explicamos cómo las buenas prácticas agrarias expresó especicamente dentro del cuerpo músculo de la pared mitocondrias, núcleos, o sarcómeros se pueden utilizar para determinar si la distrofia de estas estructuras subcelulares está presente. Como estructura no es siempre un sustituto fiable para la función, también explicamos cómo el uso de colorantes catiónicos en vivo permite la evaluación del potencial de membrana mitocondrial alterada dentro de los músculos. Cuando se utilizan los colorantes en combinación con GFP, que permiten el estudio de la arquitectura y de la función de una manera temporal durante toda la vida. Por último, también explicamos cómo la homeostasis de proteínas en el músculo puede ser evaluado y cómo todas estas medidas se puede utilizar para correlacionar los cambios en la salud músculo animal entero mediante el uso de ensayos de movimiento. Estas técnicas, combinadas con caída de genes, mutaciones, y / o compuestos químicos proporcionan un arsenal de gran alcance para el estudio de cómo los genes o compuestos específicos influyen en la salud del músculo in vivo. Los paralelos en la estructura, el metabolismo y la función muscular bruta de entre C. elegans ymamíferos significan C. elegans es un organismo modelo excelente para la comprensión de la regulación de los músculos en los organismos superiores, incluidos los humanos.
Estos métodos permiten la exploración de músculo de la macrophysiology de movimiento para la identificación de defectos subcelulares que son suficientes para causar un defecto movimiento. Cuando se combinan estos métodos permiten el análisis detallado de los músculos. El conocimiento adquirido permite realizar más pruebas de hipótesis musculares orientadas a que pertenecen a la general de la fisiología, la fisiopatología y el envejecimiento.
Movimiento ensayos
Un defecto de movimiento indica una alteración de la función neuromuscular normal. Esto puede ser específico a los nervios o músculos o puede ser común entre varios tejidos. Las etapas más difíciles de los ensayos de los movimientos que terminan están seleccionando los gusanos que son representativos de la población y / o el tratamiento, y también asegurar que el experimentador no daña al animal después de la transferencia a M9. Es importante tener un gran tamaño de la muestra para obtener una evaluación de representación y precisa de movimiento. Cuando el ensayo altamente plumaetrant efectos, por ejemplo, ven con tanta frecuencia en los mutantes, un tamaño de muestra de diez animales cada uno evaluó para el movimiento diez veces es suficiente para encontrar diferencias estadísticamente significativas frente de tipo salvaje. Sin embargo, la simplicidad de los ensayos de movimiento y la facilidad de cultivo de C. elegans significa que cientos de gusanos pueden ser rápidamente evaluados con el fin de asegurar resultados cuantitativamente robustos. Cuando el ensayo de los efectos que aparecen en la actualidad sólo una parte de la población es importante para determinar qué proporción de la población parece estar afectada, así como la gravedad de los defectos de los animales más afectados. En tales situaciones, un mayor número de animales deben ser evaluados con el fin de proporcionar los datos mínimos para la proporción de la población afectada. Frecuentes tanto de drogas y tratamientos RNAi producirán defectos graves con el movimiento en una pequeña proporción de la población. En algunos casos el aumento de la dosis del tratamiento y la o el método de entrega se incrementará la proporción de affanimales ejadas y curvas de respuesta de dosis de funcionamiento pueden ser útiles en la determinación de la concentración óptima de un fármaco o RNAi. Una segunda limitación de este ensayo movimiento es que los gusanos son manipulados para evaluar el movimiento. Por lo tanto, los gusanos se estimularon tanto y sometidos a algún grado de estrés osmótico al recogerlo en líquido. El grado de estrés osmótico puede ser limitada mediante el uso de M9 o BU tampón 19 en lugar de agua. Algunas de estas limitaciones se alivian mediante la medición de movimiento habitual en los platos usando los sistemas de seguimiento disponibles en el mercado 34 o plug-ins gratuitos para ImageJ 35. La medición de la velocidad de movimiento de un animal puede proporcionar información importante sobre la salud muscular en general, incluidos los cambios en la función que se puede medir a través de la esperanza de vida y la no invasividad de este método es la clave para los estudios de larga duración prospectivos de la función muscular.
Formación de imágenes del aparato contráctil
<p class = "jove_content"> La cepa de gusano utiliza aquí para estructura del aparato contráctil imagen era PJ727 36, que expresa una proteína de fusión GFP miosina que se localiza en sarcómeros dentro de los músculos de la pared corporal. El uso de esta cepa permite la visualización de la estructura del sarcómero en animales vivos. Similar al ensayo de movimiento descrito anteriormente, una ventaja clave de la utilización de GFP marcado sarcómeros para evaluar la estructura del sarcómero es que el método es relativamente no invasiva y por lo tanto se puede utilizar para el seguimiento prospectivo estructura del sarcómero en los animales individuales durante toda la vida. La mayor dificultad con este método es que los gusanos que se toman las radiografías siguen vivos y por lo tanto en movimiento, lo que hace que sea difícil conseguir imágenes bien enfocadas. Varios métodos pueden ser empleados para reducir el movimiento y hacer más simple la formación de imágenes; estos incluyen anestesiar o paralizar los gusanos y la inmovilización a través de la presión, de aspiración, o el uso de una solución de alta viscosidad. Cada uno de estos métodos de immobilización tiene el inconveniente de que en sí mismo puede alterar la función neuromuscular. Por lo tanto, es esencial incluir controles no tratados apropiados en el análisis. También puede ser prudente para utilizar al menos dos métodos independientes de inmovilización para confirmar los resultados no se deben a problemas con el método de inmovilización, dependiendo de qué tan ampliamente utilizado el método elegido es la inmovilización de la cuestión en estudio. Aquí hemos utilizado una simple presión del cubreobjetos sobre el gusano para inducir movimiento reducida. Después de colocar el cubreobjetos, el líquido debajo del cubreobjetos se evaporará y el cubreobjetos en consecuencia comenzará a producir más presión sobre los gusanos, por lo general esto toma 2-5 min para producir suficiente movimiento reducido para permitir imágenes fácil.Es esencial controlar los gusanos de cerca después de que el cubreobjetos se ha introducido como la presión con el tiempo aumentará lo suficiente para hacer que los gusanos a punto de estallar por la presión excesiva, por lo general 10 a 15 minutos después de la coAdemás verslip. Tampón adicional puede ser introducido con la ayuda de una punta de pipeta alrededor de los bordes del cubreobjetos para evitar la lesión por aplastamiento a los gusanos. Esmalte de uñas se puede utilizar para sellar los bordes de la hoja de la cubierta y evitar la evaporación, aunque esto impide la recuperación de los animales de debajo de la hoja de la cubierta, si se desea. Del mismo modo, el uso de perlas de silicona en la solución puede ayudar a reducir la cantidad de presión de los lugares cubreobjetos sobre los gusanos.
Al igual que con la evaluación para un defecto de movimiento, es importante considerar la penetrancia de efecto. La penetrancia puede considerarse alta si 80-100% los animales muestran un fenotipo en la placa de NGM, parcial si 21-79% y baja si ≤20% de la pantalla una población afecta. Para efectos muy penetrantes, tamaños de muestra más pequeños se pueden utilizar para producir datos cuantitativos significativos sobre los defectos del sarcómero. En los casos en que el efecto tiene una penetrancia baja, la selección de los animales que deben mostrarse un claro defecto de movimiento en respuesta a las drogaso tratamiento RNAi puede ser útil en el ensayo de defectos del sarcómero en los animales más afectados por el tratamiento. Sin embargo, no es necesariamente el caso de que la medida del efecto del tratamiento sobre el movimiento y la estructura subcelular es el mismo. Por lo tanto, puede ser deseable para examinar la extensión de los defectos presentes en una población grande, por ejemplo 100 animales. Esto permite la comprensión de la distribución de los defectos a lo largo de una población. También puede ser deseable para examinar el grado del defecto en los animales más gravemente afectados y / o examinar la correlación entre la medida de defecto sarcómero y el grado de defecto de movimiento. Dificultades potenciales a un lado, este método es más rápido y más fácil que otros métodos de evaluación de la estructura del sarcómero. Esta velocidad y la facilidad es, sin embargo, sujetas a una limitación fundamental, sarcómeros contienen proteínas de fusión GFP no son del todo normales 37 y por lo tanto la evaluación de sarcómeros interrumpidos debe confirmarse mediante métodos de trabajo intensivo más adicionales.Estos métodos incluyen el uso de luz polarizada 38, phalloidin tinción de 39 años, y de inmunofluorescencia indirecta 40. De estos métodos, sólo la luz polarizada es relativamente no invasivo; los otros métodos requieren la fijación y por lo tanto no se pueden utilizar en estudios prospectivos de los animales individuales, sino que sólo pueden utilizarse para confirmar, cruzar en sección, los resultados de tales estudios.
Imaging de mitocondriales Redes
La cepa de gusano utilizado para los experimentos de formación de imágenes mitocondrial se CB5600 7 que expresa una proteína de fusión GFP localizada en las mitocondrias y una proteína de fusión β-galactosidasa GFP localizada en los núcleos, tanto en los músculos de la pared corporal. Al igual que con el uso de PJ727 para sarcómeros de imágenes, el uso de esta cepa permite la visualización de la estructura de la red mitocondrial en los animales vivos. Por lo tanto, esta cepa se puede utilizar para evaluar los cambios dinámicos que se producen, por ejemplo reducida mitochondrial de fusión y / o el aumento de la fisión mitocondrial 41. También como para sarcómeros de imágenes, la mayor dificultad con este método es que los gusanos se toman imágenes todavía están vivos y en movimiento, por lo que es difícil de conseguir imágenes bien enfocadas. Mientras varios métodos, como se discute en mayor detalle anteriormente, se pueden emplear para reducir el movimiento, las mitocondrias parecen ser especialmente sensibles a las intervenciones que inducen movimiento reducida. Por ejemplo, se usa más comúnmente componentes de destino anestésicos de la cadena respiratoria mitocondrial y son, por tanto, debe ser utilizado con precaución en los estudios de estructura normal y la función mitocondrial. Del mismo modo, la mayoría de los agentes paralizantes se deben utilizar con precaución en los estudios de la estructura mitocondrial y la función normal, como la mayoría de los agentes paralizantes causan menos señal pase a través de la unión neuromuscular y denervación funcional del músculo es suficiente para inducir la fragmentación mitocondrial. Los experimentos en este estudio utilizan la presión para inmovilizar animaless, pero otros han utilizado con éxito levamisol 42, aunque es esencial para los animales imagen inmediatamente.
Por último, diversos contaminantes bacterianos en los cultivos, por ejemplo B. subtilis, pueden inducir la fragmentación mitocondrial; por lo tanto, es esencial incluir controles no tratados apropiados en el análisis. Para efectos muy penetrantes, tamaños de muestra más pequeños pueden ser utilizados para producir datos cuantitativos significativos sobre los defectos mitocondriales de red. Sin embargo, debido a la prevalencia de los defectos menores en la red mitocondrial, este pequeño número de animales es probable que sea el doble del número necesario para la evaluación de la estructura del sarcómero. En casos en que el efecto tiene una penetrancia baja, la selección de animales que presenten claramente un defecto de movimiento en respuesta a medicamento o tratamiento RNAi puede ser útil en el ensayo de defectos mitocondriales en los animales más afectados por el tratamiento. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, no es necesariamente el caso que lamedida del efecto del tratamiento sobre el movimiento y la estructura subcelular es el mismo. Por lo tanto, puede ser deseable para examinar la extensión de los defectos presentes en una población grande, por ejemplo 150-200 animales, así como el grado de alteración en los animales más gravemente afectados y la presencia o ausencia de la extensión de la interrupción con la extensión de defecto de movimiento. Otras cepas con etiqueta fluorescente mitocondrias se pueden utilizar para confirmar los resultados obtenidos en CB5600, sin embargo, el uso de diferentes proteínas fluorescentes puede influir en la creación de redes de línea de base de las mitocondrias. Por ejemplo, el uso de una proteína de fusión TOMM-20 RFP para visualizar las mitocondrias parece causar aumento de la fragmentación mitocondrial línea de base frente a la utilización de GFP localizada mitocondrial 17. Mientras que otros métodos tales como la inmunofluorescencia y microscopía electrónica pueden utilizarse para evaluar la estructura mitocondrial, que no permiten la evaluación in vivo de la dinámica mitocondrial porque una etapa de fijación es requiered. Otros métodos tales como el uso de tintes mitochondrially localizadas pueden ser utilizados sin fijación y por lo tanto también se pueden utilizar en lugar del uso de GFP localizada mitocondrial. Como se explica en la siguiente sección, el uso de estos colorantes también permite la evaluación de crudo in vivo la función mitocondrial.
La evaluación de la membrana mitocondrial potencial in vivo en C. elegans
Una variedad de colorantes están disponibles para el etiquetado 28 mitocondrias. Estos colorantes proporcionan un método alternativo de visualizar la estructura de red mitocondrial en C. elegans vivos. Muchos de estos colorantes también permiten la evaluación de la funcionalidad mitocondrial crudo in vivo porque se acumulan en las mitocondrias basados en el potencial de membrana mitocondrial. Aquí hemos utilizado C 32 H 32 Cl 2 N 2 O que se ingiere a través deel tracto digestivo, con la introducción de algunos adicionalmente el gusano a través de la cutícula debido a la permeabilización proporcionada por su disolución en 0,5% de DMSO. Tras la entrada en la célula C 32 H 32 Cl 2 N 2 O se oxida y secuestrado por las mitocondrias donde se une el azufre que contiene aminoácidos (por ejemplo, metionina y cisteína). La formación de estos complejos de colorante-péptido significa C 32 H 32 Cl 2 N 2 O permanece en la mitocondria una vez etiquetados 28. Una dificultad clave con el uso de tintes mitocondriales es que va a etiquetar todas las mitocondrias en el animal. Por lo tanto, hemos realizado etiquetado en CB5600, la misma cepa se ha descrito anteriormente para evaluar la estructura de la red mitocondrial muscular. Mediante el uso de un colorante rojo mitocondrial, una cepa de gusanos que expresan GFP en las mitocondrias del músculo, y un filtro de triple pase, es relativamente sencillo de imagen sólo las mitocondrias en el músculo mediante la búsqueda de las mitocondrias que son Orango por colocalización de colorante rojo y las mitocondrias GFP etiquetados. El paso más difícil en la realización de este enfoque es colocalización de imágenes debido a que el tinte es foto-blanqueado en cuestión de segundos bajo luz fluorescente de alta intensidad. Este efecto puede ser limitado por mantenimiento de la fluorescencia en baja potencia hasta que el experimentador está listo para la imagen y luego ajustando la intensidad de fluorescencia en consecuencia. Una vez que uno se experimenta con el uso de tintes otro enfoque es utilizar la microscopía confocal con Z-pilas a imagen sólo las mitocondrias en el tejido derecho; las redes mitocondrial en el músculo son muy diferentes en comparación con otros tejidos. Desafortunadamente, la incapacidad de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O dejar mitocondrias 28 significa que, a diferencia de las técnicas del sarcómero y de imagen mitocondrial discutidos anteriormente, no puede ser utilizado para el seguimiento prospectivo pérdida de la función mitocondrial con el tiempo, a menos que C 32 H 32 Cl 2 N 2 Ose añade en los puntos de tiempo discretos para separar las poblaciones de animales. Esta limitación se puede superar mediante el uso de colorantes tales como JC-10 que lo hacen salir de la mitocondria al colapso del potencial de membrana 43. Las mitocondrias también puede ser aislado de C. elegans 30 para los análisis bioquímicos subsiguientes. Dicha extracción permite la cuantificación del potencial de membrana mitocondrial mediante la cuantificación de la tasa de absorción de colorante lipofílico catiónico usando citometría de flujo o un lector de placas fluorescente 44. Habiendo establecido un deterioro potencial de la membrana mitocondrial, también es posible determinar si la pérdida de gradiente de protones se traduce en una pérdida de la producción de ATP usando un método basado en la luciferasa sensible bioluminometric 45.
La evaluación de la degradación de proteínas en C. elegans
La cepa de gusano utilizado aquí para evaluar la degradación de la proteína muscular fue PD55, que contiene una β específica musculargalactosidasa que se sintetiza de forma continua durante todo el desarrollo hasta que se alcanza la edad adulta y que permanece estable en el citosol para la próxima 72-96 hr 19. Por lo tanto, la medición de los niveles de β-galactosidasa durante el desarrollo predominantemente indica el impacto de las intervenciones sobre la síntesis a partir del promotor de miosina, mientras que la pérdida de β-galactosidasa durante la edad adulta indica una intervención ha provocado el aumento de la degradación de proteínas citosólicas 19. El paso clave en la evaluación de la actividad β-galactosidasa es asegurar la desecación efectiva. Si no se deseque efectivamente los animales resulta en pobres disposición del sustrato X-gal y el color azul, por tanto, pobre en los músculos de la pared corporal de los animales. Para garantizar una buena desecación del sello en el desecador se debe comprobar y la muestra debe ser revisado a intervalos a lo largo de 5-10 min desecación para evaluar el progreso (es decir, la muestra de 20 l debería haber secado en 10 minutos y el restante 20 mines asegurar la desecación completa). El ensayo de β-galactosidasa es un ensayo de actividad, por tanto, un control apropiado es esencial. Además, la disminución de la tinción de los adultos en una condición de tratamiento con respecto al control no demuestra que se está produciendo la degradación; sino que más bien indica disminución de la actividad enzimática en respuesta al tratamiento. Para confirmar la degradación, más análisis de transferencia Western de mano de obra debe ser completada en contra de β-galactosidasa 13 y esto permite que la degradación de proteínas cuantificación en pequeñas poblaciones de gusanos contados. Densidades banda de Western blot se pueden cuantificar usando ImageJ 46. Otra limitación de este método es que el uso de proteínas transgénicas no informa como a los objetivos fisiológicos de la degradación y para tales respuestas de hipótesis impulsada Western blots proteómicos y / o específicas, se debe emplear 13. Por último, como la síntesis de la proteína transgénica empleada en estos estudios se apaga en la edad adulta temprana 19 </sup>, otros métodos deben ser utilizados cuando se desea examinar las alteraciones en la síntesis de proteínas musculares en plenamente desarrollado C. elegans muscular; por ejemplo, métodos de isótopos estables o radiactivos.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a grant from the US National Institutes of Health National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (AR-054342) to NJS. CJG was funded by a Doctoral training studentship funded by the University of Nottingham. JJB was funded by an MRC Doctoral training award (J500495). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) | Invitrogen | M-7512 | Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential |
DMSO | Thermo Scientific | 67-63-5 | |
KH2 PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
Na2HPO4 | BDH | 301584L | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
MgSO4 | Sigma | M-7506 | |
Microscopy Slides | Starfrost | K220 | |
Microscopy Cover Slips | VW2 International | 631-0124 | |
1.5ml Eppendorph Tubes | Fisher Scientific | FB74031 | |
Dessicator | Nalgene | D2672 | |
Nikon Microscope | Nikon | H600L | Nikon H600L microscope with proprietary software |
Nikon Camera | Nikon | DS-Fi1 | Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera |
Zeiss Microscope | Zeiss | Ax10 | Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter |
Plates 9cm | Starstedt | 82-1473 | |
Plates 6cm | Gosselin | BP53-01 | |
Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
Na3PO4 | Sigma-Aldrich | 7601-54-9 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside | Sigma-Aldrich | 7240-90-6 | |
N,N8-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 68-12-2 | |