Le muscle squelettique est essentiel pour la locomotion et est le principal magasin de protéine de corps. mesures de santé musculaire dans C. elegans sont décrits. Changements éventuels à la structure et la fonction musculaire sont évalués à l'aide GFP localisée et colorants cationiques.
Le muscle est un tissu dynamique qui répond aux changements dans la nutrition, l'exercice et l'état de la maladie. La perte de la masse musculaire et la fonction de la maladie et l'âge sont les charges publiques importantes pour la santé. Nous comprenons actuellement peu de choses sur la régulation génétique de la santé des muscles de la maladie ou de l'âge. Le nématode C. elegans est un modèle établi pour la compréhension de la régulation génomique des processus biologiques d'intérêt. Les muscles de la paroi du corps de ce ver affichent un grand degré d'homologie avec les muscles des espèces de métazoaires plus élevés. Etant donné que C. elegans est un organisme transparent, la localisation de la GFP à la mitochondrie et sarcomères permet la visualisation de ces structures in vivo. De même, l'alimentation des animaux des colorants cationiques, qui accumulent basé sur l'existence d'un potentiel de membrane mitochondriale, permet l'évaluation de la fonction mitochondriale in vivo. Ces méthodes, ainsi que l'évaluation de la protéine de muscle Homeostasis, sont combinées avec la fonction d'évaluation de l'ensemble des muscles des animaux, sous la forme de dosages de déplacement, afin de permettre la corrélation des défauts sous-cellulaires avec les mesures fonctionnelles de la performance musculaire. Ainsi, C. elegans fournit une puissante plate-forme permettant d'évaluer l'impact des mutations, knockdown de gènes, et / ou des composés chimiques sur la structure et la fonction musculaire. Enfin, comme la GFP, les colorants cationiques, et les analyses de mouvement sont évalués de manière non invasive, des études prospectives de la structure et de la fonction musculaire peuvent être menées sur l'ensemble du cycle de vie et ce à l'heure actuelle ne peuvent pas être facilement étudiés in vivo dans tout autre organisme.
Le muscle est un tissu multifonctionnel, très apprécié pour son rôle dans la locomotion, soutien postural et le métabolisme. Le développement et l'entretien des muscles en bonne santé nécessite la coordination de plusieurs processus et de composants cellulaires. Soit par des dommages ou maladie, dérèglement peut se produire, entraînant dans la structure et / ou la fonction musculaire altérée. déclin lié à l'âge dans la fonction musculaire présente une charge importante pour les budgets des soins de santé dans le monde occidental, depuis la masse musculaire 1,2 et en particulier de la force musculaire et l'endurance 3-5 sont corrélés négativement avec la mortalité. La mesure des aspects liés à la détérioration de la fonction musculaire comme la fonction mitochondriale modifiée ou perturbation du sarcomère, peut permettre une meilleure compréhension des mécanismes qui sous-tendent les développement musculaire global et la santé.
Elegans C aenorhabditis (C. elegans) est un microscopiques bes de nématodest connu parce qu'il a été le premier organisme multicellulaire d'avoir l'ensemble de son génome a été séquencé 6, le premier à avoir des gènes au silence en utilisant l'ARNi 7, et le seul à avoir des métazoaires toute sa lignée cellulaire 8 et 9 neuroanatomie déterminé. C. elegans a été proposée comme un modèle pour l'étude du contrôle génétique du comportement en 1974 par Sydney Brenner 10 et l'importance de ce travail et la suite a été reconnu avec la première des trois prix Nobel attribués à C. elegans chercheurs. Environ 35% des gènes de C. elegans ont identifié orthologues chez l'homme, avec C. elegans est un organisme clé utilisée pour comprendre le contrôle génétique du développement musculaire 11. Presque chaque gène dans le génome de C. elegans peut être renversé par ARNi 7,12. Ainsi, en abattant des gènes dans le muscle pleinement développé, les composants génétiques contribuer à la remisegulation de la santé des muscles peut être étudiée avec simplicité relative 13.
La capacité combinée d'utiliser l'ARNi, des mutants et des composés chimiques permet de C. elegans un système de choix pour explorer la régulation génétique 7,14,15 de la structure et de la fonction musculaire avec 16 ans et dans les modèles de la maladie 17. L'impact de l'effet de choc de gène, mutation et / ou l'exposition à des composés chimiques sur la structure et / ou la fonction des muscles peut être mesurée par plusieurs aspects. Ici, nous décrivons brièvement des techniques simples pour l'évaluation de C. elegans la structure musculaire et la fonction, dont beaucoup peuvent être utilisés dans des études prospectives de la santé des muscles.
Le développement de la protéine fluorescente verte (GFP) 18 a permis la visualisation à la fois de la localisation de protéines spécifiques et la structure générale des organites chez C. elegans. Nous expliquons ici comment GFP exprimé spécifiquequement à l'intérieur de corps mitochondries paroi musculaire, des noyaux ou des sarcomères peuvent être utilisés pour déterminer si la dystrophie de ces structures sous-cellulaires est présent. Comme la structure est pas toujours un substitut fiable pour fonction, nous expliquons aussi comment l'évaluation du potentiel de membrane mitochondriale altérée dans le muscle de l'utilisation de colorants cationiques in vivo permet. Quand les colorants sont utilisés en combinaison avec la GFP, ils permettent l'étude de l'architecture et le fonctionnement d'une manière tout au long de la durée de vie temporelle. Enfin, nous expliquons aussi comment homéostasie protéique dans le muscle peut être évaluée et comment toutes ces mesures peuvent être utilisées pour établir une corrélation entre les changements dans l'ensemble de la santé des muscles des animaux via l'utilisation de tests de mouvement. Ces techniques, combinées avec knock-down de gènes, de mutations et / ou des composés chimiques fournissent un arsenal puissant pour étudier la façon dont les gènes ou les composés spécifiques influent sur la santé de muscle in vivo. Les parallèles de la structure, le métabolisme et la fonction du muscle brut entre C. elegans etmammifères signifient C. elegans est un organisme modèle exceptionnel pour la compréhension de la régulation de muscle dans les organismes supérieurs, y compris les humains.
Ces méthodes permettent l'exploration du muscle à partir de la macro-physiologie de mouvement pour identifier les défauts sous-cellulaires qui sont suffisantes pour provoquer un défaut de mouvement. Lorsqu'il est combiné ces méthodes permettent une analyse détaillée de muscle. L'idée acquise permet en outre de tester des hypothèses orienté muscles qui se rapportent à la physiologie générale, la physiopathologie et le vieillissement.
Mouvement Essais
A défaut de mouvement indique une perturbation de la fonction neuromusculaire normale. Ce peut être spécifique à des nerfs ou des muscles ou il peut être commun entre plusieurs tissus. Les étapes les plus difficiles de l'achèvement des essais de mouvement sélectionnent vers qui sont représentatifs de la population et / ou le traitement, et veillant à ce que l'expérimentateur ne blesse pas l'animal au moment du transfert à M9. Il est important d'avoir une grande taille de l'échantillon pour obtenir une évaluation précise et représentative de mouvement. Lorsque le dosage hautement styloeffets etrant, par exemple comme fréquemment observés chez les mutants, une taille de dix animaux de chaque échantillon évalué pour le mouvement dix fois est suffisant pour trouver des différences statistiquement significatives par rapport à de type sauvage. Cependant, la simplicité des tests de mouvement et de facilité de mise en culture de C. elegans signifie que des centaines de vers peuvent être rapidement évaluées afin de garantir des résultats quantitativement robustes. Lorsque les effets qui apparaissent présente dans seulement une partie d'une population de dosage, il est important de déterminer quelle proportion de la population semble être affectée ainsi que la gravité de l'anomalie chez les animaux les plus touchés. Dans de telles situations grand nombre d'animaux devraient être évalués afin de fournir les données minimales pour la proportion de la population touchée. Foire à la fois drogue et traitements ARNi se produire de graves anomalies de mouvement dans une petite proportion de la population. Dans certains cas, l'augmentation de la dose du traitement et ou la méthode d'administration va augmenter la proportion d'afféchies animaux et des courbes de réponse de dose en cours d'exécution peut être utile pour déterminer la concentration optimale d'un médicament ou d'ARNi. Une deuxième limite de cet essai de mouvement est que les vers sont manipulés pour évaluer le mouvement. Ainsi, les vers sont à la fois stimulés et soumis à un certain degré de stress osmotique quand ramassé en liquide. Le degré de stress osmotique peut être limitée en utilisant M9 ou BU tampon 19 par opposition à l'eau. Certaines de ces limitations sont atténués par la mesure de mouvement habituel sur des plaques en utilisant des systèmes de suivi disponibles dans le commerce 34 ou plug-ins gratuits pour ImageJ 35. Mesurer le taux d'un animal de mouvement peut fournir des informations importantes concernant la santé musculaire globale, y compris les changements dans la fonction qui peut être mesurée tout au long de la durée de vie et la non-invasif de cette méthode est la clé pour les études long de la vie potentiels de la fonction musculaire.
Imagerie de l'appareil contractile
<p class = "jove_content"> La souche utilisée ici à vis sans fin à structure d'appareil de prise de contractile était PJ727 36 qui exprime une protéine de fusion GFP de la myosine qui est localisé à l'intérieur de sarcomères les muscles de la paroi du corps. L'utilisation de cette souche permet la visualisation de la structure du sarcomère chez les animaux vivants. Comme pour le dosage de mouvement décrit ci-dessus, un avantage important de l'utilisation de GFP étiqueté sarcomères pour évaluer la structure du sarcomère est que la méthode est relativement non invasive et peut donc être utilisé pour suivre la structure du sarcomère prospective dans chaque animal tout au long de la durée de vie. La plus grande difficulté de cette méthode est que les vers qui imagées sont encore en vie et en mouvement donc, ce qui rend difficile d'obtenir des images bien ciblées. Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour réduire le mouvement et faire l'imagerie simple; agit notamment anesthésier ou paralyser les vers et immobilisation par pression, aspiration, ou l'utilisation d'une solution de haute viscosité. Chacune de ces méthodes de immobilization présente l'inconvénient qu'il peut lui-même modifier la fonction neuromusculaire. Par conséquent, il est essentiel d'inclure des témoins non traités appropriés dans l'analyse. Il peut également être prudent d'utiliser au moins deux méthodes indépendantes d'immobilisation pour confirmer les résultats ne sont pas dus à des problèmes avec la méthode d'immobilisation, selon la façon dont largement utilisé la méthode d'immobilisation choisi est de la question à l'étude. Ici, nous avons utilisé une simple pression de la lamelle sur le ver à induire mouvement réduite. Après avoir placé la lamelle, le liquide sous la lamelle sera s'évaporer et la lamelle sera donc commencer à produire plus de pression sur les vers, généralement cela prend 2-5 min à produire suffisamment de mouvement réduit pour permettre l'imagerie facile.Il est essentiel de surveiller étroitement les vers après la lamelle a été présenté comme la pression finira par augmenter suffisamment pour que les vers d'éclater de pression excessive, généralement 10-15 min après coOutre verslip. Tampon supplémentaire peut être introduite à l'aide d'une pipette sur les bords de la lamelle pour éviter l'écrasement des blessures aux vers. Vernis à ongles peut être utilisé pour sceller les bords de la lamelle et éviter l'évaporation, bien que cela empêche la récupération des animaux sous la lamelle, si désiré. De même, l'utilisation de billes de silicone dans la solution peut aider à réduire la quantité de pression les places de lamelle sur les vers.
Tout comme avec l'évaluation d'un défaut de mouvement, il est important de considérer la pénétrance d'effet. Pénétrance peut être considéré comme élevé si 80-100% des animaux présentent un phénotype sur la plaque NGM, partielle si 21-79% et faible si ≤20% de l'affichage de la population un effet. Pour les effets très pénétrants, des échantillons plus petits peuvent être utilisés pour produire des données quantitatives importantes sur les anomalies du sarcomère. Dans les cas où l'effet a une pénétrance faible, la sélection des animaux qui affiche un défaut de mouvement clair en réponse à la drogueou un traitement ARNi peut être utile dans le dosage des défauts de sarcomères chez les animaux les plus affectés par le traitement. Cependant, ce ne sont pas nécessairement le cas où la mesure de l'effet du traitement sur la circulation et de la structure sous-cellulaire est le même. Ainsi, il peut être souhaitable d'examiner l'étendue de défauts présents dans une population importante, par exemple 100 animaux. Cela permet à la compréhension de la répartition des défauts dans l'ensemble d'une population. Il peut également être souhaitable d'examiner l'étendue de la lésion chez les animaux les plus sévèrement affectées et / ou d'examiner la corrélation entre la mesure du défaut de sarcomères et l'étendue des défauts de mouvement. Les difficultés potentielles de côté, cette méthode est plus rapide et plus facile que d'autres méthodes d'évaluation de la structure du sarcomère. Cette rapidité et la facilité est, cependant, soumise à une limitation clé, sarcomères contenant des protéines de fusion GFP ne sont pas tout à fait normal 37 et donc l'évaluation de sarcomères perturbé devrait être confirmée à l'aide des méthodes de main-d'œuvre supplémentaires.Ces méthodes comprennent l'utilisation de la lumière polarisée 38, 39 phalloidin coloration, et immunofluorescence indirecte 40. Parmi ces méthodes, seule la lumière polarisée est relativement non invasive; les autres méthodes nécessitent fixation et ne peuvent donc pas être utilisés dans des études prospectives d'animaux individuels, plutôt qu'ils ne peuvent être utilisés pour confirmer, traverser en section, les résultats de ces études.
Imagerie de mitochondriales Réseaux
La souche à vis sans fin utilisé pour les expériences d'imagerie mitochondriales est CB5600 7 qui exprime une protéine de fusion GFP localisée à la mitochondrie et une GFP β-galactosidase protéine de fusion localisé au noyau, à la fois dans les muscles de la paroi du corps. Comme dans le cas de l'utilisation de sarcomères PJ727 d'imagerie, l'utilisation de cette souche permet la visualisation de la structure de réseau mitochondrial dans les animaux vivants. Ainsi, cette souche peut être utilisée pour évaluer les changements dynamiques qui se produisent, par exemple, réduit mitochofusion ndrial et / ou une augmentation de la fission mitochondriale 41. Aussi pour sarcomères d'imagerie, la plus grande difficulté de cette méthode est que les vers imagées sont encore en vie et en mouvement, ce qui rend difficile d'obtenir des images bien ciblées. Bien que plusieurs méthodes, comme on le verra plus en détail ci-dessus, peuvent être employés pour réduire les mouvements, les mitochondries apparaissent particulièrement sensibles aux interventions qui induisent une circulation réduite. Par exemple, le plus couramment utilisé composants anesthésiques cibles de la chaîne respiratoire mitochondriale et sont doit donc être utilisé avec prudence dans les études de la structure mitochondriale et la fonction normales. De même, la plupart des agents paralytiques doivent être utilisés avec prudence dans les études de la structure mitochondriale et la fonction normales, comme la plupart des agents paralytiques causent moins de signal de passer à travers la jonction neuromusculaire et dénervation fonctionnelle du muscle est suffisante pour induire la fragmentation mitochondriale. Les expériences de cette étude employées pression pour immobiliser l'animals, mais d'autres ont utilisé avec succès le lévamisole 42, bien qu'il soit essentiel à l'image des animaux immédiatement.
Enfin, divers contaminants bactériens dans les cultures, par exemple B. subtilis, peuvent induire la fragmentation mitochondriale; par conséquent, il est essentiel d'inclure des témoins non traités appropriés dans l'analyse. Pour les effets très pénétrants, des échantillons plus petits peuvent être utilisés pour produire des données quantitatives importantes sur les anomalies du réseau mitochondrial. Toutefois, en raison de la prévalence des anomalies mineures du réseau mitochondrial, ce petit nombre d'animaux est susceptible d'être deux fois le nombre nécessaire pour l'évaluation de la structure du sarcomère. Dans les cas où l'effet a une faible pénétrance, la sélection d'animaux présentant clairement un défaut de mouvement en réponse à la drogue ou traitement ARNi peut être utile dans le dosage de défauts mitochondriaux chez les animaux les plus touchés par le traitement. Cependant, comme mentionné ci-dessus, ne sont pas forcément le cas où lemesure de l'effet du traitement sur la circulation et de la structure sous-cellulaire est le même. Ainsi, il peut être souhaitable d'examiner l'étendue de défauts présents dans une population importante, par exemple de 150 à 200 animaux, ainsi que l'ampleur de la perturbation dans les animaux les plus sévèrement affectées, et la présence ou l'absence de mesure de la perturbation de mesure avec défaut de mouvement. D'autres souches avec les mitochondries marquées par fluorescence peuvent être utilisés pour confirmer les résultats obtenus dans CB5600, cependant, l'utilisation de différentes protéines fluorescentes peuvent influencer le réseau de base de la mitochondrie. Par exemple, l'utilisation d'une protéine DP-20 TOMM de fusion de visualiser les mitochondries semble entraîner une augmentation de la fragmentation des mitochondries de référence par rapport à l'utilisation de GFP localisée 17 mitochondries. Bien que d'autres méthodes telles que l'immunofluorescence et microscopie électronique peuvent être utilisées pour évaluer la structure mitochondriale, ils ne permettent pas l'évaluation in vivo de la dynamique mitochondriales à cause d'une étape de fixation est exigentd. D'autres procédés tels que l'utilisation de colorants mitochondries localisées peuvent être utilisés sans fixation et par conséquent peuvent également être utilisés à la place de l'utilisation de GFP localisée mitochondries. Tel que discuté dans la section suivante, l'utilisation de ces colorants permet également une évaluation grossière de la fonction vivo dans mitochondriale.
Évaluation du potentiel de membrane mitochondriale in vivo chez C. elegans
Une variété de colorants sont disponibles pour le marquage des mitochondries 28. Ces colorants donnent un autre mode de visualisation structure de réseau mitochondrial chez C. elegans vivants. Beaucoup de ces colorants permettent également l'évaluation de la fonctionnalité brut mitochondrial in vivo, car ils accumulent dans les mitochondries sur la base du potentiel de la membrane mitochondriale. Ici nous avons utilisé C 32 H 32 Cl 2 N 2 O qui est ingérée parle tube digestif, avec en outre une certaine entrée de la vis sans fin par l'intermédiaire de la cuticule du fait de la perméabilisation offerte par dissolution dans 0,5% de DMSO. Après l'entrée dans la cellule C 32 H 32 Cl 2 N 2 O est oxydé et séquestrée par les mitochondries où il se lie soufre contenant des acides aminés (par exemple, la méthionine et la cystéine). La formation de ces complexes colorant-peptide signifie C 32 H 32 Cl 2 N 2 O demeure dans les mitochondries marquées 28 fois. Un problème fondamental que pose l'utilisation de colorants mitochondriales est qu'ils vont étiqueter tous les mitochondries chez l'animal. Nous avons donc effectué étiquetage CB5600, la même souche décrite ci-dessus pour évaluer la structure du réseau mitochondrial musculaire. En utilisant un colorant rouge mitochondriale, d'une souche de vers exprimant la GFP dans les mitochondries du muscle, et un filtre passe triple, il est relativement simple de l'image uniquement des mitochondries dans le muscle de la recherche des mitochondries qui sont ogamme de colocalisation de colorant rouge et mitochondries GFP marqués. L'étape la plus difficile dans l'exécution de cette approche de co-localisation est l'imagerie parce que le colorant est photo-blanchi en quelques secondes sous haute intensité de la lumière fluorescente. Cet effet peut être limitée par le maintien de fluorescence à faible puissance jusqu'à ce que l'expérimentateur est prêt à l'image, puis en ajustant l'intensité de fluorescence en conséquence. Une fois que l'on a connu avec l'utilisation de colorants autre approche est d'utiliser la microscopie confocale à Z piles à l'image seulement mitochondries dans le tissu droit; les réseaux mitochondriales dans les muscles sont tout à fait distinctes par rapport à d'autres tissus. Malheureusement, l'incapacité de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O à partir des mitochondries 28 signifie que, contrairement aux techniques de sarcomères et imagerie mitochondrial discuté ci-dessus, il ne peut pas être utilisé pour suivre de manière prospective la perte de la fonction mitochondriale dans le temps, sauf si C 32 H 32 Cl 2 N 2 Oest ajouté à des points de temps discrets pour séparer les populations animales. Cette limitation peut être surmontée en utilisant des colorants tels que JC-10 qui le font sortir de la mitochondrie par l'affaissement du potentiel de 43 membrane. Les mitochondries peut également être isolé à partir de C. elegans 30 pour les analyses biochimiques suivantes. Cette extraction permet de quantifier le potentiel de la membrane mitochondriale par la quantification de la vitesse d'absorption de colorant cationique lipophile en utilisant la cytométrie de flux ou d'un lecteur de plaque fluorescente 44. Après avoir établi un potentiel de membrane mitochondriale altérée, il est également possible de déterminer si la perte de gradient de protons se traduit par une perte de la production d'ATP en utilisant un procédé à base de luciférase-bioluminometric sensible 45.
Évaluation de la dégradation des protéines dans C. elegans
La souche de vis sans fin utilisé ici pour évaluer la dégradation des protéines musculaires est PD55, qui contient un β spécifique de musclela ß-galactosidase qui est synthétisé en continu au cours du développement jusqu'à l'âge adulte est atteint et qui reste stable dans le cytosol pour la prochaine 72 à 96 h 19. Ainsi, la mesure des niveaux de β-galactosidase pendant le développement indique principalement l'impact des interventions sur la synthèse à partir du promoteur de la myosine alors que la perte de la β-galactosidase à l'âge adulte indique une intervention a provoqué une dégradation accrue des protéines cytosoliques 19. L'étape clé dans l'évaluation de l'activité β-galactosidase est d'assurer la dessication efficace. Le défaut de dessécher efficacement les animaux en résulte une mauvaise disposition du substrat X-gal et donc pauvres couleur bleue dans les muscles tégument des animaux. Pour assurer une bonne dessiccation le sceau sur le dessiccateur doit être vérifié et l'échantillon doit être vérifiée à intervalles de 5-10 min tout au long de dessiccation pour évaluer les progrès (ie, l'échantillon de 20 pi aurait séché à 10 min et 20 min le resteest de veiller à la dessiccation complète). Le test β-galactosidase est un dosage de l'activité donc un contrôle approprié est essentiel. En outre, une diminution de la coloration des adultes dans un état de traitement par rapport au témoin ne prouve pas que la dégradation se produit; il indique plutôt diminution de l'activité enzymatique en réponse au traitement. Pour confirmer la dégradation, plus analyse par transfert Western de main-d'œuvre doit être faite contre β-galactosidase 13, ce qui permet la dégradation des protéines de quantification dans les petites populations de vers comptés. Blot densités de bande occidentaux peuvent être quantifiés en utilisant ImageJ 46. Une autre limitation de cette méthode est que l'utilisation de protéines transgéniques ne communique pas à des cibles physiologiques de dégradation et de ces réponses hypothèse conduit des transferts Western protéomiques et / ou ciblées doivent être utilisés 13. Enfin, comme la synthèse de la protéine transgénique utilisé dans ces études est coupée au début de l'âge adulte 19 </sup>, d'autres procédés doivent être utilisés lorsque l'on souhaite examiner des modifications de la synthèse des protéines musculaires dans C. elegans pleinement développé muscle; par exemple, les méthodes d'isotopes stables ou radioactifs.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a grant from the US National Institutes of Health National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (AR-054342) to NJS. CJG was funded by a Doctoral training studentship funded by the University of Nottingham. JJB was funded by an MRC Doctoral training award (J500495). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) | Invitrogen | M-7512 | Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential |
DMSO | Thermo Scientific | 67-63-5 | |
KH2 PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
Na2HPO4 | BDH | 301584L | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
MgSO4 | Sigma | M-7506 | |
Microscopy Slides | Starfrost | K220 | |
Microscopy Cover Slips | VW2 International | 631-0124 | |
1.5ml Eppendorph Tubes | Fisher Scientific | FB74031 | |
Dessicator | Nalgene | D2672 | |
Nikon Microscope | Nikon | H600L | Nikon H600L microscope with proprietary software |
Nikon Camera | Nikon | DS-Fi1 | Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera |
Zeiss Microscope | Zeiss | Ax10 | Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter |
Plates 9cm | Starstedt | 82-1473 | |
Plates 6cm | Gosselin | BP53-01 | |
Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
Na3PO4 | Sigma-Aldrich | 7601-54-9 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside | Sigma-Aldrich | 7240-90-6 | |
N,N8-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 68-12-2 | |