कंकाल की मांसपेशी हरकत के लिए आवश्यक है और शरीर की मुख्य प्रोटीन की दुकान है. सी एलिगेंस भीतर स्नायु स्वास्थ्य माप वर्णित हैं. मांसपेशी संरचना और कार्य करने के लिए भावी परिवर्तनों स्थानीयकृत GFP और cationic रंजक का उपयोग मूल्यांकन कर रहे हैं.
स्नायु पोषण, व्यायाम, और रोग राज्य में परिवर्तन का जवाब है कि एक गतिशील ऊतक है. बीमारी और उम्र के साथ मांसपेशियों और समारोह के नुकसान महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य बोझ हैं. वर्तमान में हम रोग या उम्र के साथ मांसपेशियों के स्वास्थ्य की आनुवंशिक विनियमन के बारे में कम समझते हैं. निमेटोड सी एलिगेंस ब्याज की जैविक प्रक्रियाओं के जीनोमिक विनियमन को समझने के लिए एक स्थापित मॉडल है. यह कीड़ा शरीर दीवार मांसपेशियों उच्च metazoan प्रजातियों की मांसपेशियों के साथ अनुरूपता का एक बड़ा डिग्री प्रदर्शित करते हैं. सी एलिगेंस एक पारदर्शी जीव है, माइटोकॉन्ड्रिया और sarcomeres को GFP के स्थानीयकरण vivo में इन संरचनाओं के दृश्य की अनुमति देता है. इसी तरह, जानवरों एक mitochondrial झिल्ली क्षमता के अस्तित्व पर आधारित संचित जो cationic रंजक, खिला, विवो में mitochondrial समारोह के मूल्यांकन की अनुमति देता है. प्रोटीन मांसपेशियों homeosta की इन विधियों, साथ ही मूल्यांकनबहन, मांसपेशियों में प्रदर्शन के कार्यात्मक उपायों के साथ उप सेलुलर दोष के सहसंबंध अनुमति देने के लिए, आंदोलन assays के रूप में, पूरे पशु मांसपेशी समारोह के आकलन के साथ संयुक्त कर रहे हैं. इस प्रकार, सी एलिगेंस मांसपेशी संरचना और समारोह पर उत्परिवर्तन, जीन पछाड़ना, और / या रासायनिक यौगिकों के प्रभाव का आकलन करने के साथ जो एक शक्तिशाली मंच प्रदान करता है. अन्त में, GFP, cationic रंजक, और आंदोलन assays के रूप में मूल्यांकन कर रहे हैं गैर invasively, मांसपेशियों संरचना और समारोह के भावी पढ़ाई पूरी जिंदगी पाठ्यक्रम भर में आयोजित किया जा सकता है और वर्तमान में यह आसानी से किसी भी अन्य जीव में vivo में जांच नहीं की जा सकती.
स्नायु अच्छी तरह से हरकत, आसनीय समर्थन और चयापचय में अपनी भूमिका के लिए सराहना की एक multifunctional ऊतक, है. स्वस्थ मांसपेशियों के विकास और रखरखाव के कई सेलुलर प्रक्रियाओं और घटकों के समन्वय की आवश्यकता है. या तो क्षति या बीमारी के माध्यम से, अनियंत्रण बदल मांसपेशी संरचना और / या समारोह में जिसके परिणामस्वरूप हो सकता है. 1,2 जन और विशेष रूप से मांसपेशियों की शक्ति और सहनशीलता 3-5 मांसपेशी नकारात्मक मृत्यु दर के साथ सहसंबद्ध होते हैं क्योंकि मांसपेशी समारोह में उम्र जुड़े गिरावट, पश्चिमी दुनिया में स्वास्थ्य देखभाल के बजट के लिए एक महत्वपूर्ण बोझ प्रस्तुत करता है. ऐसे बदल mitochondrial समारोह या sarcomere विघटन के रूप में बिगड़ती मांसपेशी समारोह से संबंधित पहलुओं की माप समग्र मांसपेशी विकास और स्वास्थ्य underpinning तंत्र का अधिक से अधिक समझ अनुमति दे सकते हैं.
सी aenorhabditis एलिगेंस (सी एलिगेंस) एक सूक्ष्म निमेटोड bes हैयह अपने पूरे जीनोम 6 अनुक्रम के लिए सबसे पहले बहुकोशिकीय जीव, आरएनएआई 7 का उपयोग कर खामोश जीन को पहली बार, और पहले के रूप में प्रस्तावित किया गया था उसके पूरे सेल वंश 8 और neuroanatomy 9 निर्धारित किया. सी एलिगेंस है करने के लिए केवल metazoan था क्योंकि टी जाना जाता है सिडनी ब्रेनर 10 द्वारा 1974 में व्यवहार के आनुवंशिक नियंत्रण और इस का महत्व और बाद में काम के अध्ययन के लिए एक मॉडल सी एलिगेंस शोधकर्ताओं को सम्मानित किया तीन नोबेल पुरस्कार के पहले से मान्यता प्राप्त थी. सी के लगभग 35% जीन सी एलिगेंस मांसपेशी विकास 11 की आनुवंशिक नियंत्रण को समझने के लिए इस्तेमाल किया एक प्रमुख जीव होने के साथ मनुष्य में orthologues की पहचान की है एलिगेंस. लगभग सी एलिगेंस जीनोम में हर जीन आरएनएआई 7,12 के माध्यम से नीचे गिरा दिया जा सकता है. इस प्रकार, पूरी तरह से विकसित की मांसपेशी में जीन नीचे दस्तक द्वारा, आनुवंशिक घटक पुनः के लिए योगदानपेशी स्वास्थ्य की gulation रिश्तेदार सादगी 13 के साथ जांच की जा सकती है.
आरएनएआई, म्यूटेंट, और रासायनिक यौगिकों का उपयोग करने के लिए संयुक्त क्षमता सी उम्र 16 के साथ और रोग मॉडल 17 में पेशी संरचना और समारोह के आनुवंशिक विनियमन 7,14,15 की खोज के लिए एक प्रमुख प्रणाली एलिगेंस बनाता है. मांसपेशी संरचना और / या समारोह पर रासायनिक यौगिकों को जीन पछाड़ना, उत्परिवर्तन, और / या जोखिम के प्रभाव कई पहलुओं के माध्यम से मापा जा सकता है. यहाँ हम संक्षेप में पेशी स्वास्थ्य की भावी अध्ययनों में इस्तेमाल किया जा सकता है, जिनमें से कई सी एलिगेंस मांसपेशी संरचना और समारोह, का आकलन करने के लिए सरल तकनीक का वर्णन.
हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन का विकास (GFP) के 18 विशिष्ट प्रोटीन के इलाके और सी एलिगेंस में अंगों की सामान्य संरचना दोनों के दृश्य के लिए सक्षम है. यहाँ हम GFP तकनीक और नवीनता व्यक्त की व्याख्या कैसेfically शरीर दीवार मांसपेशियों माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर, नाभिक, या sarcomeres इन उप सेलुलर संरचनाओं की डिस्ट्रोफी मौजूद है, तो यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. संरचना हमेशा समारोह के लिए एक विश्वसनीय किराए की नहीं है, हम भी इन विवो में cationic रंजक का उपयोग पेशी के भीतर बिगड़ा mitochondrial झिल्ली क्षमता के आकलन के लिए अनुमति देता है कि कैसे समझा. रंगों GFP के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है, वे जीवन भर एक लौकिक ढंग से वास्तुकला और समारोह के अध्ययन की अनुमति. अन्त में, हम भी इन उपायों के सभी आंदोलन assays के उपयोग के माध्यम से पूरे जानवरों की मांसपेशियों स्वास्थ्य में परिवर्तन सहसंबंधी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे मांसपेशियों के भीतर प्रोटीन समस्थिति मूल्यांकन किया जा सकता है और कैसे समझा. जीन पछाड़ना, म्यूटेशन, और / या रासायनिक यौगिकों के साथ संयुक्त इन तकनीकों, विशिष्ट जीन या यौगिकों विवो में पेशी स्वास्थ्य को प्रभावित कैसे अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली शस्त्रागार प्रदान करते हैं. सी एलिगेंस और बीच संरचना, चयापचय और मांसपेशियों की सकल समारोह में समानताएंस्तनधारियों सी एलिगेंस मानव सहित उच्च जीवों में पेशी के विनियमन को समझने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है मतलब है.
इन तरीकों एक आंदोलन दोष पैदा करने के लिए पर्याप्त हैं कि subcellular दोषों की पहचान करने के लिए आंदोलन की macrophysiology से पेशी के अन्वेषण अनुमति देते हैं. जब संयुक्त इन तरीकों पेशी के विस्तृत विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं. प्राप्त की अंतर्दृष्टि सामान्य फिजियोलॉजी, pathophysiology और उम्र बढ़ने से संबंधित पेशी उन्मुख परिकल्पना की आगे की जांच की अनुमति देता है.
आंदोलन Assays
एक आंदोलन दोष सामान्य नयूरोमुस्कुलर समारोह के विघटन इंगित करता है. यह नसों या मांसपेशियों के लिए विशिष्ट हो सकता है या यह कई ऊतकों के बीच आम हो सकता है. पूरा आंदोलन assays के सबसे कठिन चरणों जनसंख्या और / या उपचार के प्रतिनिधि हैं जो कीड़े का चयन, और भी प्रयोगकर्ता M9 के लिए हस्तांतरण पर पशु घायल नहीं करता कि सुनिश्चित कर रहे हैं. यह आंदोलन का एक प्रतिनिधि और सटीक आकलन प्राप्त करने के लिए एक बड़ा नमूना आकार होना बहुत जरूरी है. अत्यधिक कलम परख करने की क्रिया जबउदाहरण के लिए etrant प्रभाव, के रूप में अक्सर म्यूटेंट में देखा, दस जानवरों का एक नमूना आकार एक आंदोलन के लिए दस बार का मूल्यांकन जंगली प्रकार बनाम सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेदों को खोजने के लिए पर्याप्त है. हालांकि, आंदोलन assays और संवर्धन सी एलिगेंस की आसानी के सादगी कीड़े के सैकड़ों जल्दी से मात्रात्मक मजबूत परिणाम सुनिश्चित करने के क्रम में मूल्यांकन किया जा सकता है कि इसका मतलब. आबादी के केवल एक हिस्से में मौजूद दिखाई देने वाले प्रभाव परख करने की क्रिया जब यह सबसे अधिक प्रभावित पशुओं में दोष की गंभीरता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रभावित हो गया लगता है जनसंख्या का अनुपात क्या निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है. ऐसी स्थितियों में जानवरों की बड़ी संख्या प्रभावित आबादी के अनुपात के लिए कम से कम डेटा उपलब्ध कराने के क्रम में मूल्यांकन किया जाना चाहिए. अकसर दवा और आरएनएआई उपचार दोनों आबादी के एक छोटे से अनुपात में गंभीर आंदोलन दोषों का उत्पादन होगा. कुछ मामलों में AFF के अनुपात में वृद्धि होगी उपचार और या प्रसव की विधि की खुराक में वृद्धिected जानवरों और चल खुराक प्रतिक्रिया घटता एक दवा या आरएनएआई का इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण करने में उपयोगी हो सकता है. इस आंदोलन परख का एक दूसरा सीमा कीड़े आंदोलन का आकलन करने के लिए चालाकी से किया जाता है. इस प्रकार, कीड़े दोनों उत्तेजित और तरल में उठाया जब आसमाटिक तनाव के कुछ डिग्री के अधीन हैं. आसमाटिक तनाव की डिग्री M9 या बीयू पानी के लिए विरोध के रूप में बफर 19 का उपयोग करके सीमित किया जा सकता है. इन सीमाओं के कुछ ImageJ 35 के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ट्रैकिंग सिस्टम 34 या मुफ्त प्लग इन का उपयोग प्लेटों पर अभ्यस्त आंदोलन को मापने के द्वारा क्रमशः समाप्त कर रहे हैं. एक जानवर के आंदोलन की दर को मापने उम्र भर मापा और इस विधि के गैर invasiveness मांसपेशी समारोह के भावी जीवन भर के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है कि हो सकता है समारोह में परिवर्तन सहित समग्र मांसपेशी स्वास्थ्य के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं.
सिकुड़ा उपकरण की इमेजिंग
<पी वर्ग = "jove_content"> छवि सिकुड़ा तंत्र की संरचना करने के लिए यहां इस्तेमाल कीड़ा तनाव शरीर दीवार की मांसपेशियों के भीतर sarcomeres के लिए स्थानीय है कि एक मायोसिन GFP संलयन प्रोटीन व्यक्त जो PJ727 36 था. इस तनाव का प्रयोग रहने वाले जानवरों में sarcomere संरचना के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है. ऊपर वर्णित आंदोलन परख के लिए इसी प्रकार, sarcomere संरचना का आकलन करने के लिए GFP लेबल sarcomeres का उपयोग करने का एक प्रमुख लाभ विधि अपेक्षाकृत गैर इनवेसिव है और इसलिए भावी जीवन भर व्यक्ति पशुओं में sarcomere संरचना का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस विधि के साथ सबसे बड़ी कठिनाई imaged किया जा रहा है कि कीड़े यह मुश्किल अच्छी तरह से ध्यान केंद्रित छवियों को प्राप्त करने के लिए बनाता है, जो अब भी घूम रहा है इसलिए जिंदा है और हो रहा है. कई तरीकों आंदोलन को कम करने और सरल इमेजिंग बनाने के लिए नियोजित किया जा सकता है; इन anesthetizing या दबाव, सक्शन, या एक उच्च चिपचिपापन समाधान के उपयोग के माध्यम से कीड़े और स्थिरीकरण लकवाग्रस्त शामिल हैं. Immobiliz के इन तरीकों में से प्रत्येकसमझना यह खुद नयूरोमुस्कुलर समारोह को बदल सकते हैं कि खामी है. इसलिए, यह विश्लेषण में उपयुक्त अनुपचारित नियंत्रण शामिल करने के लिए आवश्यक है. यह भी चुना स्थिरीकरण विधि अध्ययन के तहत प्रश्न के लिए कितना व्यापक रूप से इस्तेमाल पर निर्भर करता है, के कारण स्थिरीकरण विधि के साथ समस्याओं का परिणाम नहीं हैं पुष्टि करने के लिए स्थिरीकरण के कम से कम दो स्वतंत्र तरीकों का उपयोग करने के लिए विवेकपूर्ण हो सकता है. यहाँ हम कम आंदोलन को प्रेरित करने के लिए कीड़ा पर coverslip से सरल दबाव का इस्तेमाल किया है. Coverslip के रखने के बाद, coverslip के नीचे तरल लुप्त हो जाएगा और coverslip फलस्वरूप आम तौर पर यह आसान इमेजिंग सक्षम करने के लिए पर्याप्त कम आंदोलन का उत्पादन करने के लिए 2-5 मिनट लगते हैं, कीड़े पर अधिक दबाव का उत्पादन शुरू हो जाएगा.Coverslip के अंत में, सह के बाद आम तौर पर 10-15 मिनट के अत्यधिक दबाव से फट करने के लिए कीड़े पैदा करने के लिए पर्याप्त वृद्धि होगी दबाव के रूप में पेश किया गया है बारीकी के बाद यह कीड़े नजर रखने के लिए आवश्यक हैverslip अलावा. अतिरिक्त बफर कीड़े को कुचलने की चोट से बचने के लिए coverslip के किनारों के आसपास एक pipet टिप की सहायता से पेश किया जा सकता है. अगर वांछित यह कवर पर्ची के नीचे से जानवरों की बहाली को रोकता है, हालांकि नेल वार्निश, कवर पर्ची के किनारों को सील और वाष्पीकरण को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसी तरह, समाधान में सिलिकॉन मोतियों का उपयोग दबाव की राशि कीड़े पर coverslip स्थानों कम करने में मदद कर सकते हैं.
बस एक आंदोलन दोष के लिए आकलन करने के साथ ही, यह प्रभाव का अंतर्वेधन विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है. 80-100% जानवरों आबादी प्रदर्शन के ≤20% एक को प्रभावित अगर 21-79% अगर आंशिक और कम, एन जी एम प्लेट पर एक phenotype प्रदर्शित अगर अंतर्वेधन उच्च माना जा सकता है. अत्यधिक व्याप्ति प्रभाव के लिए, छोटे नमूना आकार sarcomere दोषों पर महत्वपूर्ण मात्रात्मक डेटा का उत्पादन किया जा सकता है. प्रभाव दवा के जवाब में एक स्पष्ट आंदोलन दोष प्रदर्शित कि जानवरों की एक कम अंतर्वेधन, चयन किया है जहां मामलों मेंया आरएनएआई उपचार सबसे उपचार से प्रभावित पशुओं में sarcomere दोष परख करने की क्रिया में उपयोगी हो सकता है. हालांकि, यह आंदोलन और subcellular संरचना पर उपचार प्रभाव की हद तक एक ही है कि जरूरी मामला नहीं है. इस प्रकार, यह उदाहरण के लिए, 100 पशुओं को एक बड़ी आबादी में उपस्थित दोषों की हद तक जांच करने के लिए वांछनीय हो सकता है. यह आबादी भर में दोष के वितरण की समझ में सक्षम बनाता है. यह भी सबसे गंभीर रूप से प्रभावित पशुओं में दोष की हद तक की जांच और / या sarcomere दोष की हद और आंदोलन दोष की हद के बीच संबंध की जांच करने के लिए वांछनीय हो सकता है. संभावित कठिनाइयों तरफ, इस विधि sarcomere संरचना का आकलन करने के अन्य तरीकों की तुलना में जल्दी और आसान है. यह गति और आसानी, हालांकि, एक प्रमुख सीमा के अधीन है, GFP संलयन प्रोटीन युक्त sarcomeres बाधित sarcomeres के 37 और इसलिए मूल्यांकन अतिरिक्त अधिक श्रम प्रधान तरीकों का उपयोग कर पुष्टि की जानी चाहिए पूरी तरह से सामान्य नहीं हैं.इन विधियों 39 धुंधला phalloidin ध्रुवीकृत प्रकाश 38 का उपयोग, और अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस 40 में शामिल हैं. इन तरीकों में से केवल ध्रुवीकृत प्रकाश अपेक्षाकृत गैर इनवेसिव है; अन्य तरीकों निर्धारण की आवश्यकता होती है और इसलिए अलग-अलग जानवरों की भावी अध्ययनों में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता, बल्कि वे ही, इस तरह के अध्ययन से परिणाम, पुष्टि sectionally पार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Mitochondrial नेटवर्क की इमेजिंग
माइटोकॉन्ड्रियल इमेजिंग प्रयोगों के लिए इस्तेमाल कीड़ा तनाव शरीर दीवार की मांसपेशियों में दोनों, माइटोकॉन्ड्रिया और नाभिक के लिए स्थानीय एक GFP β-galactosidase संलयन प्रोटीन के लिए स्थानीय एक GFP संलयन प्रोटीन व्यक्त जो CB5600 7 था. इमेजिंग sarcomeres के लिए PJ727 के उपयोग के साथ के रूप में, इस तनाव का उपयोग रहने वाले जानवरों में mitochondrial नेटवर्क संरचना के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है. इस प्रकार, इस तनाव उदाहरण कम mitocho के लिए, हो जो गतिशील परिवर्तन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैndrial फ्यूजन और / या बढ़ा माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन 41. इसके अलावा इमेजिंग sarcomeres के लिए, के रूप में इस विधि के साथ सबसे बड़ी कठिनाई imaged किया जा रहा कीड़े यह मुश्किल अच्छी तरह से ध्यान केंद्रित छवियों को प्राप्त करने के लिए कर रही है, अभी भी जीवित है और आगे बढ़ रहे हैं. ऊपर अधिक से अधिक विस्तार में चर्चा के रूप में कई तरीकों, आंदोलन को कम करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, माइटोकॉन्ड्रिया कम आंदोलन को प्रेरित है कि हस्तक्षेप करने के लिए विशेष रूप से संवेदनशील दिखाई देते हैं. उदाहरण के लिए, सबसे अधिक mitochondrial श्वसन श्रृंखला की एनेस्थेटिक्स लक्ष्य घटकों का इस्तेमाल किया और इसलिए सामान्य माइटोकॉन्ड्रियल संरचना और समारोह के अध्ययन में सावधानी से किया जाना चाहिए रहे हैं. सबसे लकवाग्रस्त एजेंट कम संकेत neuromuscular जंक्शन और मांसपेशियों के कार्यात्मक वितंत्रीभवन के माध्यम से पारित करने के कारण के रूप में इसी तरह, सबसे लकवाग्रस्त एजेंटों mitochondrial विखंडन प्रेरित करने के लिए, सामान्य माइटोकॉन्ड्रियल संरचना और समारोह के अध्ययन में सावधानी के साथ पर्याप्त है इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इस अध्ययन में प्रयोगों पशु स्थिर दबाव कार्यरतयह तुरंत छवि पशुओं के लिए आवश्यक है, हालांकि एस लेकिन दूसरों को सफलतापूर्वक, levamisole 42 का इस्तेमाल किया है.
अन्त में, उदाहरण के बी subtilis के लिए संस्कृतियों में विभिन्न बैक्टीरियल contaminants, mitochondrial विखंडन पैदा कर सकते हैं; इसलिए यह विश्लेषण में उपयुक्त अनुपचारित नियंत्रण शामिल करने के लिए आवश्यक है. अत्यधिक व्याप्ति प्रभाव के लिए, छोटे नमूना आकार माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क दोषों पर महत्वपूर्ण मात्रात्मक डेटा का उत्पादन किया जा सकता है. हालांकि, माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क में छोटे दोष के प्रसार के कारण, जानवरों की इस छोटी संख्या sarcomere संरचना के मूल्यांकन के लिए आवश्यक दो बार संख्या होने की संभावना है. प्रभाव एक कम अंतर्वेधन है जहां मामलों में, स्पष्ट रूप से दवा या आरएनएआई उपचार के जवाब में एक आंदोलन दोष प्रदर्शित पशुओं का चयन सबसे उपचार से प्रभावित पशुओं में mitochondrial दोष परख करने की क्रिया में उपयोगी हो सकता है. उपरोक्त के रूप में हालांकि, यह मामला जरूरी नहीं है किआंदोलन और subcellular संरचना पर उपचार प्रभाव की हद तक ही है. इस प्रकार, यह उदाहरण के लिए, 150-200 पशुओं के लिए, साथ ही सबसे गंभीर रूप से प्रभावित पशुओं में व्यवधान की हद और की हद से विघटन की हद तक की उपस्थिति या अनुपस्थिति एक बड़ी आबादी में उपस्थित दोषों की हद तक जांच करने के लिए वांछनीय हो सकता है आंदोलन दोष. Fluorescently लेबल माइटोकॉन्ड्रिया के साथ अन्य उपभेदों CB5600 में प्राप्त परिणामों की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि, विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग mitochondria की आधारभूत नेटवर्किंग प्रभावित कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया कल्पना करने के लिए एक TOMM-20 आरएफपी संलयन प्रोटीन का उपयोग mitochondrially स्थानीयकृत GFP 17 का उपयोग बनाम आधारभूत mitochondrial विखंडन वृद्धि हुई पैदा करने के लिए प्रकट होता है. ऐसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में अन्य तरीकों माइटोकॉन्ड्रियल संरचना का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जबकि एक नियतन कदम की आवश्यकता होती है, क्योंकि वे माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता के vivo मूल्यांकन की अनुमति नहीं देतेडी. ऐसे mitochondrially स्थानीयकृत रंगों के प्रयोग के रूप में अन्य विधियों निर्धारण के बिना इस्तेमाल किया जा सकता है और इसलिए भी mitochondrially स्थानीयकृत GFP के उपयोग के स्थान पर प्रयोग किया जा सकता है. अगले भाग में चर्चा की, इस तरह के रंगों का प्रयोग भी इन विवो mitochondrial समारोह के कच्चे मूल्यांकन की अनुमति देता है.
सी एलिगेंस में vivo में mitochondrial झिल्ली क्षमता का आकलन
रंगों की एक किस्म लेबलिंग माइटोकॉन्ड्रिया 28 के लिए उपलब्ध हैं. इन रंगों लाइव सी एलिगेंस में mitochondrial नेटवर्क संरचना visualizing का एक वैकल्पिक तरीका प्रदान करते हैं. वे mitochondrial झिल्ली क्षमता पर आधारित माइटोकॉन्ड्रिया में जमा क्योंकि इन रंगों के कई लोग भी विवो में mitochondrial कार्यक्षमता के कच्चे मूल्यांकन अनुमति देते हैं. के माध्यम से किया जाता है जो यहाँ हम इस्तेमाल किया है सी 32 एच 32 सीएल 2 एन 2 हेकुछ अतिरिक्त क्योंकि 0.5% DMSO में भंग किया जा रहा द्वारा afforded permeabilization की छल्ली के माध्यम से कीड़ा प्रवेश करने के साथ पाचन तंत्र,. सेल सी 32 एच 32 सीएल 2 एन 2 ओ में प्रवेश के बाद ऑक्सीकरण और यह अमीनो एसिड (जैसे methionine और सिस्टीन) युक्त सल्फर बांध जहां माइटोकॉन्ड्रिया से तनहा है. इन डाई-पेप्टाइड परिसरों के गठन एच 32 सीएल 2 एन 2 हे एक बार 28 लेबल माइटोकॉन्ड्रिया में रहता सी 32 का मतलब है. माइटोकॉन्ड्रियल रंगों के उपयोग के साथ एक प्रमुख कठिनाई वे पशु के सभी माइटोकॉन्ड्रिया लेबल होगा. इसलिए हम CB5600, मांसपेशियों माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क संरचना का आकलन करने के लिए ऊपर वर्णित एक ही तनाव में लेबलिंग प्रदर्शन किया है. एक लाल माइटोकॉन्ड्रियल डाई, मांसपेशियों में माइटोकॉन्ड्रिया में GFP व्यक्त कीड़े के एक तनाव, और एक ट्रिपल पास फिल्टर का उपयोग करके, यह छवि के लिए कर रहे हैं कि माइटोकॉन्ड्रिया ओ खोजने के द्वारा पेशी में केवल माइटोकॉन्ड्रिया अपेक्षाकृत सरल हैलाल डाई और GFP लेबल माइटोकॉन्ड्रिया की colocalization द्वारा सीमा. डाई फोटो प्रक्षालित उच्च तीव्रता फ्लोरोसेंट रोशनी के तहत सेकंड के भीतर है क्योंकि इस colocalization दृष्टिकोण प्रदर्शन में सबसे कठिन कदम इमेजिंग है. इस आशय प्रयोगकर्ता छवि के लिए तैयार है जब तक कम बिजली पर प्रतिदीप्ति रखने और फिर उसके अनुसार प्रतिदीप्ति तीव्रता का समायोजन करके सीमित किया जा सकता है. एक रंगों के उपयोग के साथ अनुभवी हो जाने के बाद एक और दृष्टिकोण सही ऊतक में छवि केवल माइटोकॉन्ड्रिया को जेड के ढेर के साथ confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए है; मांसपेशियों में mitochondrial नेटवर्क अन्य ऊतकों की तुलना में काफी अलग हैं. दुर्भाग्य से, माइटोकॉन्ड्रिया 28 छोड़ने के लिए सी 32 की अक्षमता एच 32 सीएल 2 एन 2 हे sarcomere और mitochondrial इमेजिंग तकनीक के ऊपर चर्चा के विपरीत, यह भावी एच 32 सी 32 है, जब तक समय के साथ mitochondrial समारोह के नुकसान का पालन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, इसका मतलब है कि सीएल 2 एन 2 हेजानवर आबादी को अलग करने के असतत समय बिंदुओं पर जोड़ा जाता है. इस सीमा में इस तरह के 43 संभावित झिल्ली के पतन पर माइटोकॉन्ड्रिया छोड़ कर कि जे.सी.-10 के रूप में रंगों का उपयोग करके दूर किया जा सकता है. माइटोकॉन्ड्रिया भी सी से अलग किया जा सकता बाद में जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए एलिगेंस 30. इस तरह की निकासी प्रवाह cytometry का उपयोग lipophilic cationic डाई तेज या एक फ्लोरोसेंट प्लेट पाठक 44 की दर बढ़ाता द्वारा mitochondrial झिल्ली क्षमता की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है. एक बिगड़ा mitochondrial झिल्ली क्षमता स्थापित करने के बाद, यह प्रोटॉन ढाल का नुकसान एक संवेदनशील bioluminometric luciferase आधारित विधि 45 का उपयोग करते हुए एटीपी उत्पादन का नुकसान में तब्दील निर्धारित करने के लिए भी संभव है.
सी में प्रोटीन गिरावट का आकलन एलिगेंस
प्रोटीन मांसपेशियों गिरावट का आकलन करने के लिए यहां इस्तेमाल कीड़ा तनाव एक मांसपेशी विशिष्ट β जिसमें PD55 था,वयस्कता पहुंच गया और अगले 72-96 घंटे 19 के लिए cytosol में स्थिर बनी हुई है, जो है, जब तक -galactosidase कि लगातार विकास भर में संश्लेषित है. वयस्कता के दौरान β-galactosidase का नुकसान एक हस्तक्षेप साइटोसोलिक प्रोटीन गिरावट 19 की वृद्धि हुई शुरू हो गया है इंगित करता है जबकि इस प्रकार, विकास के दौरान β-galactosidase के स्तर की माप मुख्य रूप से मायोसिन प्रमोटर से संश्लेषण पर हस्तक्षेप के प्रभाव को दर्शाता है. β-galactosidase गतिविधि का आकलन करने में महत्वपूर्ण कदम प्रभावी सुखाना सुनिश्चित करने के लिए है. प्रभावी ढंग से जानवरों सूखना करने में विफलता जानवरों के शरीर दीवार की मांसपेशियों में एक्स-लड़की सब्सट्रेट और इसलिए गरीब नीले रंग की गरीब प्रावधान में यह परिणाम है. Desiccator पर मुहर जाँच की जानी चाहिए और नमूना प्रगति का आकलन करने के लिए सुखाना भर में 5-10 मिनट के अंतराल पर जाँच की जानी चाहिए अच्छा सुखाना सुनिश्चित करने के लिए (यानी, 20 μl नमूना 10 मिनट और शेष 20 मिनट के भीतर सूख गए हैं चाहिए) व्यापक सुखाना सुनिश्चित करने के लिए है. β-galactosidase परख एक गतिविधि परख इसलिए एक उपयुक्त नियंत्रण आवश्यक है. साथ ही, कि गिरावट होने वाली है साबित नहीं करता नियंत्रित करने के लिए एक इलाज हालत सापेक्ष में वयस्कों के धुंधला कमी आई; बल्कि यह उपचार के जवाब में enzymatic गतिविधि में कमी आई इंगित करता है. गिरावट की पुष्टि करने के लिए, अधिक श्रम प्रधान पश्चिमी धब्बा विश्लेषण β-galactosidase 13 के खिलाफ पूरा किया और इस गिना कीड़े की छोटी आबादी में मात्रा का ठहराव प्रोटीन गिरावट की अनुमति देता है किया जाना चाहिए. पश्चिमी धब्बा बैंड घनत्व ImageJ 46 का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. इस पद्धति की एक और सीमा ट्रांसजेनिक प्रोटीन का उपयोग गिरावट के शारीरिक लक्ष्य के रूप में और प्रोटिओमिक और / या लक्षित परिकल्पना संचालित पश्चिमी blots 13 नियोजित किया जाना चाहिए इस तरह के जवाब के लिए सूचित नहीं करता है. अन्त में, इन अध्ययनों में कार्यरत ट्रांसजेनिक प्रोटीन के संश्लेषण के रूप में जल्दी वयस्कता 19 में बंद हो जाता है </suपी> पूरी तरह से विकसित सी में पेशी प्रोटीन संश्लेषण में परिवर्तन की जांच करने के इच्छुक हैं, तो अन्य तरीकों का उपयोग किया जाना चाहिए पेशी एलिगेंस; उदाहरण के लिए, स्थिर या रेडियोधर्मी आइसोटोप तरीकों.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a grant from the US National Institutes of Health National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (AR-054342) to NJS. CJG was funded by a Doctoral training studentship funded by the University of Nottingham. JJB was funded by an MRC Doctoral training award (J500495). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) | Invitrogen | M-7512 | Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential |
DMSO | Thermo Scientific | 67-63-5 | |
KH2 PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
Na2HPO4 | BDH | 301584L | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
MgSO4 | Sigma | M-7506 | |
Microscopy Slides | Starfrost | K220 | |
Microscopy Cover Slips | VW2 International | 631-0124 | |
1.5ml Eppendorph Tubes | Fisher Scientific | FB74031 | |
Dessicator | Nalgene | D2672 | |
Nikon Microscope | Nikon | H600L | Nikon H600L microscope with proprietary software |
Nikon Camera | Nikon | DS-Fi1 | Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera |
Zeiss Microscope | Zeiss | Ax10 | Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter |
Plates 9cm | Starstedt | 82-1473 | |
Plates 6cm | Gosselin | BP53-01 | |
Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
Na3PO4 | Sigma-Aldrich | 7601-54-9 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside | Sigma-Aldrich | 7240-90-6 | |
N,N8-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 68-12-2 | |