Skelettmuskulatur ist wichtig für die Fortbewegung und ist der betreffenden Einrichtungen Hauptproteinspeicher. Muscle Gesundheitsmessungen innerhalb C. elegans beschrieben. Potenzielle Änderungen an Muskel Struktur und Funktion werden mit lokalisierten GFP und kationische Farbstoffe bewertet.
Muscle ist ein dynamisches Gewebe, das auf Veränderungen in der Ernährung, Bewegung und Krankheitszustand reagiert. Der Verlust von Muskelmasse und Funktion mit der Krankheit und Alter sind erhebliche öffentliche Gesundheitsprobleme. Wir verstehen derzeit wenig über die genetische Regulation der Muskel Gesundheit mit Krankheit oder Alter. Der Fadenwurm C. elegans ist ein etabliertes Modell für das Verständnis der genomischen Regulation biologischer Prozesse von Interesse. Körperwand Muskeln dieses Wurm zeigen einen hohen Grad an Homologie zu den Muskeln der höheren Metazoen Arten. Da C. elegans ist ein transparentes Organismus, die Lokalisierung von GFP an die Mitochondrien und Sarkomeren ermöglicht die Visualisierung dieser Strukturen in vivo. Ebenso Füttern von Tieren kationischen Farbstoffen, die auf das Vorhandensein einer mitochondrialen Membranpotentials anhand akkumulieren, erlaubt die Beurteilung der Mitochondrienfunktion in vivo. Diese Verfahren sowie Beurteilung der Muskelprotein homeostasis, sind bei der Beurteilung der gesamten Tiermuskelfunktion kombiniert, in Form von Bewegungs Assays zur Korrelation der subzellulären Defekte mit funktionellen Maßnahmen Muskelleistung zu ermöglichen. Somit stellt C. elegans eine leistungsfähige Plattform, mit der die Auswirkungen von Mutationen, Gen-Knockdown und / oder chemische Verbindungen auf Muskelstruktur und Funktion zu beurteilen. Schließlich ist, wie GFP, kationische Farbstoffe, und Bewegungstests beurteilt werden nicht-invasiv, kann prospektiven Studien der Muskelstruktur und Funktion über den gesamten Lebensverlauf durchgeführt werden und dies zur Zeit nicht leicht in vivo in einem anderen Organismus untersucht werden.
Muskel ist eine multifunktionale Gewebe, die für ihre Rolle bei der Fortbewegung, Haltungsunterstützung und Stoffwechsel geschätzt. Die Entwicklung und Pflege von gesunden Muskel erfordert die Koordination mehrerer zellulärer Prozesse und Komponenten. Entweder durch Schädigung oder Krankheit kann Dysregulation auftreten, was zu veränderten Muskelstruktur und / oder Funktion. Altersbedingte Abnahme der Muskelfunktion stellt eine erhebliche Belastung für die Gesundheitsbudgets in der westlichen Welt, da Muskelmasse 1,2 und insbesondere Muskelkraft und Ausdauer 3-5 sind negativ mit der Sterblichkeit korreliert. Die Messung von Aspekten der sich verschlechternden Muskelfunktion, beispielsweise bei einer veränderten mitochondrialen Funktion oder Sarkomer Störung kann ein besseres Verständnis der Mechanismen zugrunde Gesamtmuskelentwicklung und Gesundheit zu ermöglichen.
C aenorhabditis elegans (C. elegans) ist ein mikroskopisch kleinen Faden best bekannt, weil es das erste vielzelligen Organismus zu haben, ihre gesamte Genom sequenziert 6, der Erste, der Gene zum Schweigen gebracht mit RNAi 7 haben, und die einzige Metazoen, ihren gesamten Zelllinie 8 und Neuroanatomie 9 bestimmt. C. elegans wurde zuerst als vorgeschlagen haben ein Modell für die Untersuchung der genetischen Kontrolle des Verhaltens im Jahr 1974 von Sydney Brenner 10 und die Bedeutung dieser und nachfolgender Arbeit wurde mit dem ersten von drei Nobelpreise an C. elegans Forschern verliehen anerkannt. Ungefähr 35% der C. elegans-Gene wurden Orthologe beim Menschen identifiziert, mit C. elegans, ein Schlüsselorganismus verwendet, um die genetische Kontrolle der Muskelentwicklung 11 zu verstehen. Fast jedes Gen im Genom von C. elegans kann unten durch RNAi 7,12 stoßen werden. Somit kann durch Klopfen nach unten Gene in voll entwickelten Muskeln, genetische Komponenten für die Wieder Beitraggulation von Muskel Gesundheit kann mit relativer Einfachheit 13 untersucht werden.
Die kombinierte Fähigkeit, RNAi, Mutanten und chemische Verbindungen verwenden macht C. elegans ein erstklassiges System für die Erkundung der genetischen Regulation 7,14,15 der Muskelstruktur und -funktion mit dem Alter 16 und in Krankheitsmodellen 17. Die Auswirkungen der Knock-down, Mutation und / oder durch Einwirkung von chemischen Verbindungen auf die Muskelstruktur und / oder Funktion kann durch mehrere Aspekte zu messen. Hier beschreiben wir kurz einfachen Techniken zur Bewertung C. elegans Muskelstruktur, von denen viele in prospektiven Untersuchungen der Muskel Gesundheit verwendet werden.
Die Entwicklung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) 18 hat Visualisierung sowohl der Ort bestimmter Proteine und die allgemeine Struktur von Organellen in C. elegans aktiviert. Hier erklären wir, wie GFP exprimiert Spezifically innerhalb Körperwand Muskel Mitochondrien, können Kerne oder Sarkomere verwendet, um festzustellen, ob Dystrophie dieser subzellulärer Strukturen vorhanden ist. Als Struktur ist nicht immer ein zuverlässiger Ersatz für die Funktion, die wir auch erklären, wie die Verwendung von kationischen Farbstoffen in vivo ermöglicht Beurteilung der Beeinträchtigung der mitochondrialen Membranpotentials im Muskel. Wenn die Farbstoffe in Kombination mit GFP verwendet, ermöglichen sie die Untersuchung der Architektur und Funktion in einer zeitlichen Weise in der gesamten Lebensdauer. Schließlich auch erklären wir, wie Proteinhomöostase innerhalb Muskel beurteilt werden kann und wie alle diese Maßnahmen verwendet werden, um Veränderungen in der ganzen Tiermuskel Gesundheit durch Verwendung von Bewegungstests korrelieren. Diese Techniken, kombiniert mit Knock-down, Mutationen und / oder chemische Verbindungen bieten eine leistungsfähige Arsenal für das Studium, wie bestimmte Gene oder Verbindungen beeinflussen Muskel Gesundheit in vivo. Die Parallelen in der Struktur, Stoffwechsel und grobe Funktion der Muskulatur zwischen C. elegans undSäuger, C. elegans ist ein hervorragender Modellorganismus für das Verständnis der Regulation der Muskel in höheren Organismen, einschließlich des Menschen.
Diese Methoden erlauben die Erforschung der Muskel vom macrophysiology der Bewegung, um die Identifizierung subzellulärer Mängel, die ausreichend ist, um eine Bewegung Defekt verursachen. Wenn sie kombiniert diese Methoden erlauben detaillierte Analyse von Muskel. Die gewonnenen Erkenntnisse können weitere Tests der Muskelorientierten Hypothesen, die auf allgemeine Physiologie, Pathophysiologie und Altern betreffen.
Bewegung Assays
Eine Bewegung Defekt bezeichnet eine Störung der normalen neuromuskulären Funktion. Dies kann bestimmte Nerven oder Muskeln, oder es kann gemeinsam auf mehrere Gewebe sein. Die schwierigsten Phasen der Vollendung Bewegung Assays Auswahl Würmer, die repräsentativ für die Bevölkerung und / oder der Behandlung sind, und auch dafür, dass der Experimentator nicht das Tier verletzen bei Übertragung auf M9. Es ist wichtig, einen großen Stichprobe eine repräsentative und genaue Beurteilung der Bewegung zu erhalten. Wenn Testen hoch Stiftetrant Wirkungen, wie beispielsweise häufig in Mutanten gesehen, jeweils eine Probengröße von zehn Tieren für die Bewegung zehnmal beurteilt ausreichend ist, um statistisch signifikante Unterschiede im Vergleich zu Wildtyp finden. , Die Einfachheit der Bewegung Assays und einfache Kultivierung C. elegans bedeuten jedoch, dass Hunderte von Würmern kann schnell um quantitativ robuste Ergebnisse zu gewährleisten beurteilt werden. Beim Testen von Effekten, die in nur einem Teil einer Population vorhanden erscheint es wichtig, zu bestimmen, welcher Anteil der Bevölkerung scheint ebenfalls betroffen sein, wie der Schwere des Defekts in den betroffenen Tieren. In solchen Situationen sollten, um die minimalen Daten Anteil der betroffenen Bevölkerung eine größere Anzahl von Tieren zu beurteilen. Häufig Arzneimittel- und RNAi-Behandlungen werden schwere Bewegungsfehler in einem kleinen Teil der Bevölkerung zu erzeugen. In einigen Fällen eine Erhöhung der Dosis der Behandlung und oder der Art der Lieferung wird der Anteil der aff erhöhenreflektierte Tieren und Lauf Dosis-Antwort-Kurven können nützlich in der Bestimmung der optimalen Konzentration eines Arzneimittels oder RNAi ist. Eine zweite Begrenzung dieser Bewegung Assays ist, dass die Würmer manipuliert werden, um die Bewegung abzuschätzen. Somit werden die Würmer sowohl stimuliert und zu einem gewissen Grad von osmotischem Stress ausgesetzt, wenn sie in flüssiger gerichtet. Der Grad der osmotischen Stress kann durch Verwendung M9 oder BU-Puffer 19, im Gegensatz zu Wasser beschränkt. Einige dieser Einschränkungen werden durch die Messung gewöhnlichen Bewegung auf Platten mit kommerziell erhältlichen Nachführsysteme 34 oder kostenlose Plug Ins für ImageJ 35 gemildert. Die Messung der Bewegungsgeschwindigkeit eines Tieres können wichtige Informationen über die allgemeine Muskel Gesundheit, einschließlich Änderungen der Funktion, die in der gesamten Lebensspanne gemessen werden kann und der nicht-Invasivität dieser Methode ist der Schlüssel für angeh lebenslangen Studien der Muskelfunktion bereitzustellen.
Imaging des kontraktilen Apparates
<p class = "jove_content"> Der Wurm Stamm Bild kontraktilen Apparates Struktur verwendet hier war PJ727 36, der eine Myosin GFP-Fusionsprotein, die Sarkomere innerhalb der Körperwand Muskeln lokalisiert ist Ausdruck bringt. Die Nutzung dieser Sorte ermöglicht die Visualisierung von Sarkomerstruktur in lebenden Tieren. Ähnlich zu der oben beschriebenen Bewegung Assay ist ein wichtiger Vorteil der Verwendung von GFP markierten Sarkomeren um Sarkomerstruktur beurteilen, daß das Verfahren relativ nicht-invasiv und können daher verwendet werden, um prospektiv folgen Sarkomerstruktur in einzelnen Tieren während des gesamten Lebensdauer. Die größte Schwierigkeit bei dieser Methode ist, dass die Würmer, die abgebildet ist noch am Leben sind und somit in Bewegung, was es schwierig macht gut fokussierte Bilder zu bekommen macht. Mehrere Verfahren können verwendet werden, um die Bewegung zu reduzieren und Abbilden einfacher; Dazu gehören Anästhesie oder Lähmung der Würmer und Immobilisierung über Druck, Sog, oder die Verwendung eines hochviskosen Lösung. Jede dieser Methoden der immobilization hat den Nachteil, dass sie sich die neuromuskuläre Funktion verändern. Daher ist es wichtig, entsprechende unbehandelten Kontrollen in der Analyse enthalten. Es kann auch sinnvoll, mindestens zwei unabhängige Methoden der Immobilisierung zu verwenden, um zu bestätigen Ergebnisse nicht aufgrund von Problemen mit dem Immobilisierungsverfahren, je nachdem, wie weit verbreitet das gewählte Immobilisierungsverfahren ist für die Frage untersucht. Hier haben wir einfach dem Druck des Deckglases auf den Wurm verwendet, um eingeschränkter Bewegung zu induzieren. Nach dem Platzieren des Deckglases wird die Flüssigkeit unter dem Deckglas zu verdampfen und das Deckglas wird folglich beginnen, mehr Druck auf die Würmer produzieren, in der Regel dies dauert 2-5 min, genug reduziert Bewegung zu erzeugen, um einfache Bildgebung zu ermöglichen.Es ist wichtig, um die Würmer zu überwachen eng, nachdem die Deck hat wie der Druck wird schließlich zu erhöhen genug, um die Würmer zu veranlassen, von übermäßigem Druck platzen, typischerweise 10-15 min nach Co eingeführtverslip hinaus. Zusätzliche Puffer kann mit Hilfe einer Pipettenspitze an den Kanten des Deckglases eingebracht werden, um Quetschverletzungen zu vermeiden, die Würmer. Nagellack kann verwendet werden, um die Kanten des Deckglases abzudichten und zu verhindern, Verdampfung, obwohl dies verhindert, dass die Wiedergewinnung von Tieren unter dem Deckglas, falls gewünscht. Ebenso kann die Verwendung von Silikonkügelchen in der Lösung zur Verringerung der Menge an Druck, den die Deck Stellen der Würmer.
Genau wie bei der Beurteilung einer Bewegung Defekt ist es wichtig, die Penetranz Effekt berücksichtigen. Penetranz kann als hoch, wenn 80-100% Tieren zeigen eine Phänotyp auf der NGM Platte, teilweise, wenn 21 bis 79% und niedriger, wenn ≤20% der Bevölkerung Anzeige einen Einfluss. Für stark penetrant Wirkungen können kleinere Probengrößen verwendet werden, um signifikante quantitative Daten über Sarkomer Defekte zu produzieren. In Fällen, in denen der Effekt hat eine geringe Penetranz Auswahl der Tiere, die eine klare Bewegung Defekt in Reaktion auf Arzneimittel anzuzeigenoder RNAi-Behandlung kann bei der Bestimmung von Sarkomer Mängel in den meisten von der Behandlung betroffenen Tiere. Jedoch ist es nicht notwendigerweise der Fall, dass das Ausmaß der Behandlungseffekt auf die Bewegung und subzellulären Struktur ist die gleiche. Somit kann es wünschenswert sein, das Ausmaß der in einer großen Population vorliegende Defekte zu untersuchen, beispielsweise 100 Tiere. Dies ermöglicht das Verständnis der Verteilung von Defekten der gesamten Bevölkerung. Es kann auch wünschenswert sein, das Ausmaß des Defekts in den am stärksten betroffenen Tieren zu untersuchen und / oder überprüft die Korrelation zwischen Ausmaß des Defekts sarcomere und das Ausmaß der Bewegung Defekt. Mögliche Schwierigkeiten beiseite, ist diese Methode schneller und einfacher als andere Methoden zur Bewertung Sarkomerstruktur. Diese Geschwindigkeit und die Leichtigkeit ist, unterliegt jedoch eine wesentliche Einschränkung, Sarkomeren GFP-Fusionsproteine enthalten, sind nicht völlig normal 37 und daher Beurteilung unterbrochen Sarkomeren sollte mit zusätzlichen arbeitsintensive Verfahren bestätigt werden.Diese Methoden umfassen die Verwendung von polarisiertem Licht 38, Phalloidin Färbung 39 und indirekte Immunfluoreszenz 40. Von diesen Verfahren ist nur polarisiertes Licht relativ nicht-invasive; die anderen Methoden der Fixierung und kann daher nicht in prospektiven Studien einzelner Tiere verwendet werden, sondern sie können nur verwendet werden, um zu bestätigen, im Querschnitt die Ergebnisse solcher Studien.
Imaging der mitochondrialen Networks
Die Wurmstamm für die mitochondriale Abbildungsexperimente verwendet wurde CB5600 7, die ein GFP-Fusionsprotein in die Mitochondrien und ein GFP β-Galactosidase-Fusionsprotein zu den Kernen lokalisiert lokalisiert drückt sowohl in den Körperwandmuskulatur. Wie bei Verwendung von PJ727 zur Bildgebung Sarkomeren Verwendung dieses Stammes ermöglicht die Visualisierung der mitochondrialen Netzstruktur in lebenden Tieren. Somit kann dieser Stamm verwendet werden, um dynamische Veränderungen, die auftreten zu bewerten, beispielsweise verringert mitochondrial Fusion und / oder erhöhte mitochondriale Spaltung 41. Auch als für die Bildgebung Sarkomere, die größte Schwierigkeit bei dieser Methode ist, dass die Würmer, die abgebildet sind noch am Leben und in Bewegung, was es erschwert, gut fokussierte Bilder zu bekommen. Während verschiedene Verfahren, wie oben im Detail diskutiert, kann verwendet werden, um die Bewegung zu reduzieren, Mitochondrien scheinen besonders empfindlich auf Eingriffe, verminderter Bewegung zu induzieren. B. gebräuchlichsten Anästhetika Zielkomponenten der mitochondrialen Atmungskette und sind daher mit Vorsicht in Studien der normalen mitochondriale Struktur und Funktion verwendet werden. Ebenso müssen die meisten Lähmungsmittel mit Vorsicht in den Studien der normalen mitochondrialen Struktur und Funktion ausreichend genutzt werden, da die meisten Lähmungsmittel verursachen weniger Signal durch den neuromuskulären Synapse und funktionelle Denervierung des Muskels übergeben wird, um die mitochondriale Fragmentierung induzieren. Die Experimente in dieser Studie angewandte Druck zu Tier immobilisierens aber andere erfolgreich eingesetzt Levamisol 42, obwohl es wesentlich ist, Bild Tiere sofort.
Schließlich verschiedene bakterielle Verunreinigungen in Kulturen, beispielsweise B. subtilis, kann mitochondriale Fragmentierung induzieren; Daher ist es wichtig, entsprechende unbehandelten Kontrollen in der Analyse enthalten. Für stark penetrant Wirkungen können kleinere Probengrößen verwendet werden, um signifikante quantitative Daten über mitochondriale Leitungensnetzen produzieren. Aufgrund der Prävalenz von kleineren Defekten im mitochondrialen Netz, ist diese kleine Anzahl der Tiere, die die doppelte Anzahl zur Beurteilung Sarkomerstruktur benötigt werden. In Fällen, in denen der Effekt hat eine geringe Penetranz kann die Auswahl von Tieren deutlich Anzeigen eines Mangels Bewegung in Reaktion auf Arzneimittel oder RNAi-Behandlung nützlich bei der Untersuchung der mitochondrialen Defekten in den meisten von der Behandlung nicht beeinflusst Tiere. Wie oben erwähnt, ist es jedoch nicht notwendigerweise der Fall, dass dasUmfang der Behandlungseffekt auf die Bewegung und subzellulären Struktur ist die gleiche. Somit kann es wünschenswert sein, das Ausmaß der in einer großen Population vorliegende Defekte zu prüfen, zum Beispiel 150-200 Tiere sowie das Ausmaß der Störung in den am stärksten betroffenen Tieren und die Anwesenheit oder Abwesenheit des Ausmaßes der Störung mit Ausmaß Bewegung Defekt. Andere Stämme mit fluoreszierend markierten Mitochondrien verwendet, um Ergebnisse in CB5600 bestätigen zu werden, aber die Verwendung unterschiedlicher Fluoreszenzproteine können die Basis Vernetzung von Mitochondrien beeinflussen. Beispielsweise wird die Verwendung eines TOMM-20 RFP Fusionsprotein an Mitochondrien sichtbar zu erhöhten Ausgangs mitochondriale Fragmentierung gegenüber der Verwendung von Mitochondrien lokalisiert GFP 17 verursachen. Während andere Methoden wie Immunfluoreszenz und Elektronenmikroskopie können verwendet werden, um die mitochondriale Struktur zu bewerten, sie erlauben nicht die in vivo-Beurteilung der Mitochondriendynamik, da eine Fixierungsschritt ist erforderlichd. Andere Verfahren wie die Verwendung von Mitochondrien lokalisiert Farbstoffe können ohne Befestigung verwendet werden und kann daher auch an Stelle der Benutzung Mitochondrien lokalisiert GFP verwendet werden. Wie im nächsten Abschnitt beschrieben, ermöglicht die Verwendung von solchen Farbstoffen auch rohe Beurteilung der in vivo Funktion der Mitochondrien.
Beurteilung der Mitochondrienmembranpotential in vivo in C. elegans
Eine Vielzahl von Farbstoffen zur Markierung Mitochondrien 28 zur Verfügung. Diese Farbstoffe stellen eine alternative Methode zur Visualisierung mitochondrialen Netzstruktur in lebenden C. elegans. Viele dieser Farbstoffe auch ermöglichen rohe Beurteilung der mitochondrialen Funktion in vivo, da sie in den Mitochondrien, bezogen auf das mitochondriale Membranpotential zu akkumulieren. Hier haben wir verwendet haben C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, die durch Einnahme wirdder Verdauungstrakt, wobei einige zusätzlich in die Schnecke über die Kutikula durch die Permeabilisierung indem sie in 0,5% DMSO gelöst lieferte. Nach dem Eintritt in die Zelle C 32 H 32 Cl 2 N 2 O oxidiert und von den Mitochondrien, wo sie schwefelhaltige Aminosäuren (zB Methionin und Cystein) bindet sequestriert. Die Bildung dieser Farbstoff-Peptid-Komplexe bedeutet C 32 H 32 Cl 2 N 2 O bleibt in den Mitochondrien einmal markiert 28. Eine Hauptschwierigkeit bei der Verwendung von mitochondrialen Farbstoffe ist, dass sie alle Mitochondrien in das Tier zu markieren. Deshalb haben wir die Kennzeichnung in CB5600, die oben für die Beurteilung Muskel mitochondrialen Netzstruktur beschrieben demselben Stamm durchgeführt. Durch die Verwendung eines roten mitochondrialen Farbstoff, ein Stamm von Würmern, die GFP im Muskel Mitochondrien und eine dreifache Passfilter, ist es relativ einfach, nur Bild Mitochondrien in der Muskulatur durch Auffinden Mitochondrien, die sind oBereich durch Kolokalisation von roten Farbstoff und GFP-markierten Mitochondrien. Der schwierigste Schritt in der Durchführung dieses Kolokalisation Ansatz ist Bildgebung, weil der Farbstoff photo gebleicht innerhalb von Sekunden unter hoher Intensität Fluoreszenzlicht. Dieser Effekt kann durch Halten der Fluoreszenz auf Low-Power, bis der Experimentator ist bereit, das Bild und dann entsprechend Einstellen der Fluoreszenzintensität begrenzt. Sobald man bei der Verwendung von Farbstoffen erlebt weiterer Ansatz ist die konfokale Mikroskopie mit Z-Stapel, um Bild nur Mitochondrien in der rechten Gewebe zu verwenden; die mitochondriale Netzwerke Muskel ganz verschieden im Vergleich zu anderen Geweben. Leider ist die Unfähigkeit der C 32 H 32 Cl 2 N 2 O an die Mitochondrien 28 verlassen, bedeutet, dass, anders als die sarcomere und mitochondriale Bildgebungstechniken oben diskutiert, kann es nicht verwendet werden, um prospektiv folgen Verlust von Mitochondrienfunktion mit der Zeit, es sei denn, C 32 H 32 Cl 2 N 2 Owird zu diskreten Zeitpunkten hinzugefügt, um Tierpopulationen zu trennen. Diese Einschränkung kann durch Verwendung von Farbstoffen, wie JC-10, die verlassen den Mitochondrien bei Zusammenbruch des Membranpotentials 43 tun überwunden werden. Mitochondrien können auch aus C isoliert werden elegans 30 für nachfolgende biochemische Analysen. Derartige Extraktion erlaubt eine Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials durch die Quantifizierung der Geschwindigkeit von lipophilen kationischen Farbstoffaufnahme unter Verwendung von Durchflusszytometrie oder Fluoreszenz-Plattenlesegerät 44. Nachdem fest eine gestörte mitochondriale Membranpotential, ist es auch möglich zu bestimmen, ob der Verlust von Protonengradienten führt zu einem Verlust von ATP-Produktion unter Verwendung eines empfindlichen bioluminometric Luciferase-basierte Methode 45.
Beurteilung Proteinabbau in C. elegans
Die Wurmstamm für die Beurteilung Muskelproteinabbau verwendet hier war PD55, der einen Muskel spezifische β enthält-Galactosidase, dass kontinuierlich während der gesamten Entwicklung synthetisiert bis ins Erwachsenenalter erreicht ist und der für den nächsten 72-96 Stunden 19 im Cytosol stabil bleibt. Somit Messung der β-Galactosidase-Niveaus während der Entwicklung hauptsächlich zeigt die Auswirkungen von Eingriffen Synthese der Myosin-Promotor, wohingegen der Verlust von β-Galactosidase im Erwachsenenalter zeigt eine Intervention ausgelöst erhöhte cytosolische Proteinabbau 19. Der Schlüsselschritt bei der Beurteilung der β-Galactosidase-Aktivität ist die effektive Trocknung zu gewährleisten. Versagen, die Tiere wirksam austrocknen zu schlechten Bereitstellung der X-gal-Substrat und daher schlecht blaue Farbe der Körperwand-Muskulatur der Tiere. Um eine gute Austrocknung sicherzustellen, dass die Dichtung auf dem Exsikkator sollten überprüft werden, und die Probe sollte bei 5-10 min Abständen während Austrocknung überprüft, um die Fortschritte zu bewerten (dh die 20 ul Probe sollte innerhalb von 10 Minuten und die restlichen 20 Minuten getrocknet habenist es, umfassende Austrocknung zu gewährleisten). Die β-Galactosidase-Assay ist ein Aktivitätstest ist daher ein geeignetes Steuer wesentlich. Zusätzlich verringerte Färbung der Erwachsenen in einem Behandlungsbedingung im Vergleich zur Kontrolle, beweist nicht, dass der Abbau stattfindet; sondern sie zeigt verringerte enzymatische Aktivität in Reaktion auf die Behandlung. Um den Abbau zu bestätigen, müssen arbeitsintensiver Western-Blot-Analyse gegen β-Galactosidase 13 abgeschlossen werden und dies ermöglicht die Quantifizierung der Proteinabbau in kleinen Populationen von gezählten Würmer. Western-Blot-Band Dichten mit ImageJ 46 quantifiziert werden. Eine weitere Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass die Verwendung von transgenen Proteinen nicht als den physiologischen Ziele Abbau und für solche Antworten proteomischen und / oder Zielhypothese angetrieben Westernblots muss verwendet 13 werden mit. Schließlich ist, wie die Synthese des transgenen Proteins in diesen Studien verwendeten schaltet im frühen Erwachsenenalter 19 </sup>, andere Methoden müssen eingesetzt werden, wenn zu wollen Veränderungen in der Muskelproteinsynthese in voll entwickelten C. elegans zu untersuchen Muskel; zum Beispiel stabil oder radioaktives Isotop Methoden.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a grant from the US National Institutes of Health National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (AR-054342) to NJS. CJG was funded by a Doctoral training studentship funded by the University of Nottingham. JJB was funded by an MRC Doctoral training award (J500495). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) | Invitrogen | M-7512 | Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential |
DMSO | Thermo Scientific | 67-63-5 | |
KH2 PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
Na2HPO4 | BDH | 301584L | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
MgSO4 | Sigma | M-7506 | |
Microscopy Slides | Starfrost | K220 | |
Microscopy Cover Slips | VW2 International | 631-0124 | |
1.5ml Eppendorph Tubes | Fisher Scientific | FB74031 | |
Dessicator | Nalgene | D2672 | |
Nikon Microscope | Nikon | H600L | Nikon H600L microscope with proprietary software |
Nikon Camera | Nikon | DS-Fi1 | Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera |
Zeiss Microscope | Zeiss | Ax10 | Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter |
Plates 9cm | Starstedt | 82-1473 | |
Plates 6cm | Gosselin | BP53-01 | |
Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
Na3PO4 | Sigma-Aldrich | 7601-54-9 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside | Sigma-Aldrich | 7240-90-6 | |
N,N8-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 68-12-2 | |