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Biology

Methoden zur subzellulärer Kompartimente der Muskel in Beurteilen doi: 10.3791/52043 Published: November 13, 2014

Summary

Skelettmuskulatur ist wichtig für die Fortbewegung und ist der betreffenden Einrichtungen Hauptproteinspeicher. Muscle Gesundheitsmessungen innerhalb C. elegans beschrieben. Potenzielle Änderungen an Muskel Struktur und Funktion werden mit lokalisierten GFP und kationische Farbstoffe bewertet.

Abstract

Muscle ist ein dynamisches Gewebe, das auf Veränderungen in der Ernährung, Bewegung und Krankheitszustand reagiert. Der Verlust von Muskelmasse und Funktion mit der Krankheit und Alter sind erhebliche öffentliche Gesundheitsprobleme. Wir verstehen derzeit wenig über die genetische Regulation der Muskel Gesundheit mit Krankheit oder Alter. Der Fadenwurm C. elegans ist ein etabliertes Modell für das Verständnis der genomischen Regulation biologischer Prozesse von Interesse. Körperwand Muskeln dieses Wurm zeigen einen hohen Grad an Homologie zu den Muskeln der höheren Metazoen Arten. Da C. elegans ist ein transparentes Organismus, die Lokalisierung von GFP an die Mitochondrien und Sarkomeren ermöglicht die Visualisierung dieser Strukturen in vivo. Ebenso Füttern von Tieren kationischen Farbstoffen, die auf das Vorhandensein einer mitochondrialen Membranpotentials anhand akkumulieren, erlaubt die Beurteilung der Mitochondrienfunktion in vivo. Diese Verfahren sowie Beurteilung der Muskelprotein homeostasis, sind bei der Beurteilung der gesamten Tiermuskelfunktion kombiniert, in Form von Bewegungs Assays zur Korrelation der subzellulären Defekte mit funktionellen Maßnahmen Muskelleistung zu ermöglichen. Somit stellt C. elegans eine leistungsfähige Plattform, mit der die Auswirkungen von Mutationen, Gen-Knockdown und / oder chemische Verbindungen auf Muskelstruktur und Funktion zu beurteilen. Schließlich ist, wie GFP, kationische Farbstoffe, und Bewegungstests beurteilt werden nicht-invasiv, kann prospektiven Studien der Muskelstruktur und Funktion über den gesamten Lebensverlauf durchgeführt werden und dies zur Zeit nicht leicht in vivo in einem anderen Organismus untersucht werden.

Introduction

Muskel ist eine multifunktionale Gewebe, die für ihre Rolle bei der Fortbewegung, Haltungsunterstützung und Stoffwechsel geschätzt. Die Entwicklung und Pflege von gesunden Muskel erfordert die Koordination mehrerer zellulärer Prozesse und Komponenten. Entweder durch Schädigung oder Krankheit kann Dysregulation auftreten, was zu veränderten Muskelstruktur und / oder Funktion. Altersbedingte Abnahme der Muskelfunktion stellt eine erhebliche Belastung für die Gesundheitsbudgets in der westlichen Welt, da Muskelmasse 1,2 und insbesondere Muskelkraft und Ausdauer 3-5 sind negativ mit der Sterblichkeit korreliert. Die Messung von Aspekten der sich verschlechternden Muskelfunktion, beispielsweise bei einer veränderten mitochondrialen Funktion oder Sarkomer Störung kann ein besseres Verständnis der Mechanismen zugrunde Gesamtmuskelentwicklung und Gesundheit zu ermöglichen.

C aenorhabditis elegans (C. elegans) ist ein mikroskopisch kleinen Faden best bekannt, weil es das erste vielzelligen Organismus zu haben, ihre gesamte Genom sequenziert 6, der Erste, der Gene zum Schweigen gebracht mit RNAi 7 haben, und die einzige Metazoen, ihren gesamten Zelllinie 8 und Neuroanatomie 9 bestimmt. C. elegans wurde zuerst als vorgeschlagen haben ein Modell für die Untersuchung der genetischen Kontrolle des Verhaltens im Jahr 1974 von Sydney Brenner 10 und die Bedeutung dieser und nachfolgender Arbeit wurde mit dem ersten von drei Nobelpreise an C. elegans Forschern verliehen anerkannt. Ungefähr 35% der C. elegans-Gene wurden Orthologe beim Menschen identifiziert, mit C. elegans, ein Schlüsselorganismus verwendet, um die genetische Kontrolle der Muskelentwicklung 11 zu verstehen. Fast jedes Gen im Genom von C. elegans kann unten durch RNAi 7,12 stoßen werden. Somit kann durch Klopfen nach unten Gene in voll entwickelten Muskeln, genetische Komponenten für die Wieder Beitraggulation von Muskel Gesundheit kann mit relativer Einfachheit 13 untersucht werden.

Die kombinierte Fähigkeit, RNAi, Mutanten und chemische Verbindungen verwenden macht C. elegans ein erstklassiges System für die Erkundung der genetischen Regulation 7,14,15 der Muskelstruktur und -funktion mit dem Alter 16 und in Krankheitsmodellen 17. Die Auswirkungen der Knock-down, Mutation und / oder durch Einwirkung von chemischen Verbindungen auf die Muskelstruktur und / oder Funktion kann durch mehrere Aspekte zu messen. Hier beschreiben wir kurz einfachen Techniken zur Bewertung C. elegans Muskelstruktur, von denen viele in prospektiven Untersuchungen der Muskel Gesundheit verwendet werden.

Die Entwicklung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) 18 hat Visualisierung sowohl der Ort bestimmter Proteine ​​und die allgemeine Struktur von Organellen in C. elegans aktiviert. Hier erklären wir, wie GFP exprimiert Spezifically innerhalb Körperwand Muskel Mitochondrien, können Kerne oder Sarkomere verwendet, um festzustellen, ob Dystrophie dieser subzellulärer Strukturen vorhanden ist. Als Struktur ist nicht immer ein zuverlässiger Ersatz für die Funktion, die wir auch erklären, wie die Verwendung von kationischen Farbstoffen in vivo ermöglicht Beurteilung der Beeinträchtigung der mitochondrialen Membranpotentials im Muskel. Wenn die Farbstoffe in Kombination mit GFP verwendet, ermöglichen sie die Untersuchung der Architektur und Funktion in einer zeitlichen Weise in der gesamten Lebensdauer. Schließlich auch erklären wir, wie Proteinhomöostase innerhalb Muskel beurteilt werden kann und wie alle diese Maßnahmen verwendet werden, um Veränderungen in der ganzen Tiermuskel Gesundheit durch Verwendung von Bewegungstests korrelieren. Diese Techniken, kombiniert mit Knock-down, Mutationen und / oder chemische Verbindungen bieten eine leistungsfähige Arsenal für das Studium, wie bestimmte Gene oder Verbindungen beeinflussen Muskel Gesundheit in vivo. Die Parallelen in der Struktur, Stoffwechsel und grobe Funktion der Muskulatur zwischen C. elegans undSäuger, C. elegans ist ein hervorragender Modellorganismus für das Verständnis der Regulation der Muskel in höheren Organismen, einschließlich des Menschen.

Protocol

1. Die Stämme, Kultur und Mikroskopie

  1. Handhabung und Wartung Stämme von C. elegans, wie zuvor beschrieben 19. Die Stämme sind von der Caenorhabditis Genetics Center (CGC).
    ANMERKUNG: Die in diesen Versuchen verwendeten Stämme waren CB5600 (ccIs4251 (pMyo-3 :: Ngfp-lacZ; pMyo-3 :: Mtgfp) I; er-8 (e1489) IV) mit GFP Fusionsproteine ​​an die Mitochondrien und Zellkerne lokalisiert; PJ727 (jls01 (myo-3 :: GFP, rol-6 (su1006)); unc-54 :: lacZ V) mit GFP-Fusionsproteine ​​auf die kontraktilen Apparates und PD55 (ccIs55 (sup-7 (ST5) lokalisiert; UNC- 54 :: lacZ) V) mit β-Galactosidase-Fusionsproteine ​​in das Cytosol lokalisiert.
  2. Komplette RNAi-Experimente, wie zuvor für Mehrgenerationen RNAi-Experimente 13 aus der Folge beschrieben und erhalten RNAi Bakterien verifiziert ORF-RNAi-Bibliothek von Marc Vidal et al. 12 aufgebaut.
  3. Construct-Stämme, die <em> KKI 4251, jls01 oder KKI 55 unter Verwendung von Standardverfahren 20. Verwenden Sie diese Transgene, um einen Stamm zu schaffen, um die mitochondriale Netzwerkstruktur, Myosin Organisation oder den Zustand der Proteostase beurteilen sind. Überqueren Sie die Stämme in eine Mutante, wo suchen Sie sich eines dieser subzellulärer Kompartimente in jedes Tier ist erwünscht.
  4. Verwenden Sie die PtdIns-3-Kinase-Inhibitor, LY-294002 (LY), wie zuvor beschrieben 21. Kurz gesagt, fügen LY-294002 bei einer Endkonzentration von 160 & mgr; M auf der Oberseite des Trocken OP50-NGM-Platten ausgesät.
  5. Erfassung aller Bilder mit einem GFP-Filter für GFP-basierten Experimenten und ein Mikroskop mit einer Dreifach-Passfilter, das Abbildungs ​​von roten, grünen und blauen Kanälen für die Bewertung der in vivo Membranpotential mit C 32 H 32 Cl 2 N 2 O kann gleichzeitig, allgemein als MitoTracker Red CMXRos vermarktet. Führen Bildanalyse und Abbildung Vorbereitung in Bildbearbeitungssoftware.

  1. Ein Minimum von 1 Tag vor erforderlich, stellen M9-Puffer - 22.04 mM KH 2 PO 4, 42,27 mM Na 2 HPO 4, 85,56 mM NaCl (Endkonzentrationen) und durch Autoklavieren sterilisieren. Nachdem auf 45 ° C abgekühlt, fügen sterile MgSO 4 bis 1 mM nach dem Autoklavieren, um eine Ausfällung zu verhindern 22. Damit das M9 bei 4 ° C und Aliquots in 50-ml-Röhrchen abkühlen.
  2. Am Tag des Experiments, 3 ml M9-Puffer zu einer einzigen Platte mit 9 cm hohe Zahl von L1-Larven. Wiederholt waschen der Platte durch Ansaugen der flüssigen M9 und Pipettieren auf die Oberfläche des Agars mit einem Winkel gehalten Platte.
  3. Waschen Sie die L1 ist von der Platte und überweisen Sie den M9 auf eine 10-ml-Röhrchen mit einer Pipette dann.
  4. Lassen Sie für 2,5 min, damit die größeren Erwachsenen und später Larvenstadium Tieren auf den Grund des Reagenzglas fallen und die kleineren L1 Tiere in der Nähe des t bleibenop des M9-Puffer.
  5. Entfernen Sie die Top-500-ul M9 im Reagenzglas mit einer Pipette. Dann pipettieren die M9 enthält L1-Larven auf eine neue NGM-Platte mit 500 ul OP50 unter einem Binokular ausgesät.
  6. Typischerweise wollen pro Platte übertragen ~ 200-300 L1-Larven. Überwachen Platten täglich von Erwachsensein und, falls erforderlich, holen Tiere auf die frische OP50 NGM-Platten zu verhindern OP50 Nahrungsquelle verbraucht.
    ANMERKUNG: Diese ist in der Regel 1-3 Tropfen M9 mit einer P1000-Pipette, obwohl dies variiert stark in Abhängigkeit von der Anzahl von L1 auf der Originalplatte.
  7. Wenn prospektive Studien in einzelnen Tieren gewünscht werden, sobald Tiere das Erwachsenenalter erreichen, nehmen einzelne Tiere zu ausgesät NGM-Platten zu trennen. Überweisung Tiere jeden 24-48 h, von Larven Tieren zu trennen.

3. Bewegung Assays 19

  1. Ein Minimum von 2 Stunden vor Beginn der Experimente, entfernen Sie ein 50 ml Aliquot M9 und auf Raumtemperatur ins Gleichgewichteratur.
  2. Wählen Sie ein einzelnes erwachsenes Tier in 50 ul M9-Puffer auf einem Objektträger.
  3. Zählen die Anzahl der linken und rechten Körper Biegungen in 10 sec, wobei eine nach links und eine nach rechts gerichtete Krümmung gleich einem Takt ist.
  4. Wiederholen die Anzahl der Schläge um einen Körper insgesamt mindestens 5 Messungen, aus denen ein Mittelwert genommen werden kann ergeben. Multiplizieren Sie diese Zahlen um sechs, um die Bewegungsrate pro Minute geben.
  5. Mit einer Pipette das Tier zurück in die Petrischale. Dieses Verfahren ermöglicht die zeitliche Messung der Bewegung in der gesamten Lebensspanne in C. elegan s.

Figur 1
Abbildung 1: Bewegung Assays. Sobald Würmer werden in den Puffer aufgenommen werden eine nach links (A) und eine nach rechts (B) Biege addiert, um eine vollständige Bewegung zu geben(Schlaganfall).

4. Imaging der mitochondrialen Netzwerke und Sarkomere in Körperwandmuskulatur

  1. HINWEIS: Das gleiche Protokoll gilt für die Bildgebung sowohl der Mitochondrien und Sarkomere.
  2. Synchronisieren Würmer wie zuvor beschrieben (Abschnitt 1) ​​und wachsen für 48-60 h bei 20 ° C, wenn sie im jungen Erwachsenenalter zu erreichen.
  3. Pick 20 Würmer (Vertreter der Platte) von den Platten in 20 & mgr; l M9 auf einem Objektträger.
  4. Tragen Sie einen Deckglas und fahren Sie mit Bild unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops unter einem GFP-Filter (460-500 nm, blau Lichtanregung) bei 40-facher Vergrößerung.

5. Bewertung Membrane Potential mithilfe eines In-vivo-Akkumulation Assay mit MitoTracker Red CMXRos (C 32 H 32 Cl 2 N 2 O)

  1. Synchronisieren CB5600 (Abschnitt 1), die alle mit GFP in den Mitochondrien der Muskeln bezeichnet und wachsen, um im frühen Erwachsenenalter auf NGM enthält OP50 für 48-60 h bei 20 ° C.
  2. Füge 100 ul DMSO zu 50 & mgr; g-Aliquot C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, um eine Stammlösung von 940,692 & mgr; M zu machen.
  3. Nehmen Sie 1 ul der 940,692 uM Stammlösung und resuspendieren in 199 ul M9 um eine Arbeitslösung von 4,70 um (4,70346 uM) zu erstellen. Bereiten Sie diese in braun 1,5-ml-Röhrchen, weil C 32 H 32 Cl 2 N 2 O ist lichtempfindlich.
  4. Es werden 20 ul Aliquots der 4,70 uM Arbeitslösung (20 erwachsenen Würmer pro 20 ul Aliquot).
  5. Wählen Sie 20 erwachsenen Tieren in 20 ul 4,70 uM C 32 H 32 Cl 2 N 2 O in den braunen 1,5-ml-Röhrchen. Inkubieren bei 20 ° C für 1 Stunde.
  6. Nach der 1-stündigen Inkubation mit 1 ml M9 den braunen 1,5-ml-Röhrchen mit den Würmern, Zentrifuge bei 2.000 × g für 10 sec und entfernen Sie dann den Überstand. Wiederholen Sie diesen Waschschritt vor Resuspendieren des Wurmpellet und die Übertragung der restlichen 20 μl (enthaltend die Würmer) auf einen Objektträger für die Bildgebung.
  7. Nehmen Sie Bilder der Mitochondrien mit 40-facher Vergrößerung mit einem Dreifach-Passfilter, der Visualisierung von sowohl den roten, blauen und grünen Kanäle gleichzeitig ermöglicht. Aufnahme nach dem Triple Passfilter zeigt, die Co-Lokalisierung von C 32 H 32 Cl 2 N 2 O mit GFP Mitochondrien wie Orange erscheint lokalisiert.
  8. Nachdem ein Bild des orangefarbenen Mitochondrien genommen, Foto bleichen das Tier für 10 Sekunden mit Licht der Wellenlänge 540/25 nm auf maximalen Einstellungen mit allen Filtern entfernt. Dies wird den roten in den Mitochondrien zu bleichen und zeigen die mitochondriale GFP allein Kolokalisation im Muskel Mitochondrien bestätigen.

6. Bewertung der Muskelproteinabbau in C. elegans

  1. Synchronisieren PD55s (oder einem Stamm, der das lacZ-Transgen) an NGM-Platten ausgesät mit OP50 (Abschnitt 1). Wachsen, um jungen Erwachsenenalter für 48-60 h bei 20 ° C.
  2. Wählen Sie 20 erwachsenen Würmer in 20 ul ddH 2 O auf einem Objektträger. Seien Sie vorsichtig, um zu versuchen und holen nur den Wurm und nicht alle Bakterien mit dem Pick. Beschriften Sie die Objektträger mit Bleistift.
  3. Zeigen im Exsikkator für 30 Minuten, um zu trocknen und Crack die Schuppenschicht der Tiere. Achten Sie auf eine gute Abdichtung auf den Exsikkator mit Fett um die Dichtung.
  4. Überprüfen Sie die Austrocknung wurde unter einem Binokular (Abbildung 2) wirksam.
  5. Tauchen Sie den Objektträger in eiskaltem Aceton für 3,5 min verlassen dann die Objektträger auf ein Papiertuch bei Raumtemperatur für 15 Minuten, damit das Aceton auf dem Objektträger zu verdampfen. An diesem Punkt auftauen X-gal und Oxidationspuffer und ermöglichen Äquilibrierung auf Raumtemperatur.
  6. In 2 ul X-Gal zu 100 ul Oxidationspuffer und Wirbel vorsichtig, um sicherzustellen, das ist homogen. Dies ist die X-gal / Oxidationspuffer Mastermix.
  7. Mit 20 & mgr; l X-gal / Oxidationspuffer Mastermix jedem original Fläche von 20 Würmer. Untersuchen Sie unter einem Binokular, um sicherzustellen, dass die Master-Mix alle Tiere vollständig abdeckt total. Sanft neigen die Objektträger, um den Master-Mix in Bereichen bewegen, wo Tiere sind nicht abgedeckt.
  8. Legen Sie die Objektträger in einer feuchten Kammer für 1-2,5 h bei 20 ° C. Bild Tiere, wenn eine dunkelblaue Farbe in der Körperwand Muskeln von Kontrolltieren vorhanden ist. Beurteilen Kontrolltieren unter einem Binokular alle 15 min, um zu bestimmen, wenn die Tiere sollten abgebildet werden.

Figur 2
Abbildung 2: Beurteilung der Muskelproteinabbau mit β-Galaktosidase-Assays. (A) Tiere, die ein lacZ Transgen aus den Petrischalen bis 20 & mgr; l ddH 2 O auf einem Mikroskopie Schieber (B) gerichtet. Die Tiere sind ausgetrocknet und werden gebrochen (D) gewaschen. Nachdem Aceton verdampft das X-gal / Oxidationspuffer Mastermix zugesetzt wird (E). Die Entwicklung der blauen Farbe in Kontrolltieren auf 15 min-Intervallen (FL) von t = 0 min (F), bis eine dunkelblaue Farbe über die Länge der Tiere (L) erhalten wird beurteilt. Bilder von Würmern werden zu 2,5-facher Vergrößerung in AE und 8X in FL gemacht. Zoomt in C, D, F, G und L sind 4X die ursprüngliche Vergrößerung.

Representative Results

Bewegung Assays zur Bewegung Mängel Quantifizieren

Bewegung Rückgang ist ein guter Prädiktor für die Mortalität in C. elegans 16, mit verminderter Raten anzeigt Probleme mit der neuromuskulären Systems. Veränderungen in der Bewegung, wie durch Bewegung Assays beurteilt, von RNAi gegen ein spezifisches Gen oder medikamentöse Behandlung (Abbildungen 3-5) oder in mutierten Tiere 13, 23 führen kann. Ein Rückgang der Bewegung kann aus veränderten Entwicklung beispielsweise folgende Entwicklungs knock down des Elektronentransports Gene Komplex I, III, IV oder V 24 kodiert führen. Darüber hinaus können spezifische Interventionen nur auf erwachsene C. elegans, um die Wirkung auf die Post-Entwicklungsphysiologie untersuchen getestet werden. Die C. B. Tiere mit RNAi gegen unc-112, die codiert behandelt elegans Ortholog Kindlin-1, die an Integrin lokalisiert ist, enthaltendMuskelansatzkomplexe (Abbildungen 3 und 4), oder Gas-1, das eine Komponente des Komplex I der Atmungskette (Abbildung 4) kodiert, zeigen eine progressive Verringerung der Bewegung gegen Kontrolle 48-72 h nach Erwachsenenalter. Dies kann ein Hinweis auf Probleme mit der Muskelphysiologie werden. Ähnlich wird ein Bewegungsverlust von 24 - 72 Stunden wird in Reaktion auf die Behandlung von normal entwickelten Erwachsenen mit der Behandlung mit dem PI3K-Inhibitor LY-294002 (Abbildung 5) beobachtet. Es ist auch möglich, die Wirkung eines zweiten RNAi-Behandlung, Mutation oder eines Arzneimittels in Rückstellbewegung in Tiere mit vermindertem Bewegung in Reaktion auf einen Anfangseingriff zu testen. Zum Beispiel anzuzeigen UNC- 112 Mutanten eine quantifizierbare Verringerung Bewegung im Vergleich zu Wildtyp-Tiere, die in Gegenwart einer zweiten Mutation in dim-1 13 gedämpft. Daher kann die Bewegung Assays beide Interventionen, neuromuscu verändern identifizierenlar Entwicklung und / oder Funktion wie diejenigen, die zur Verbesserung und / oder Wiederherstellung neuromuskuläre Funktion.

Bewertung der Sarkomer Störung

Mit einem Bewegungsfehler ermittelt, ist es oft wünschenswert, zu bestimmen, ob die Ursache der Bewegung Defekt kann durch Probleme in Nerven, Muskeln oder beide erläutert. Sarkomere sind die Multi-Protein-Komplexe in Muskel, der für die Kontraktion zu ermöglichen und damit Krafterzeugung und Bewegung. Durch Verwendung Tieren exprimieren Myosin-GFP-Fusionsproteine ​​auf die kontraktilen Apparat lokalisiert ist, das Ausmaß der Störung des Myosin-Filamenten und Sarkomeren relativ nicht-invasiv und prospektiv in einzelnen Tieren durch die Entwicklung und / oder im Erwachsenenalter beobachtet werden. Wildtyp-Tiere anzuzeigen Arrayed Sarkomere, die als mehrfache grüne parallele Geraden in jeder Körperwandmuskulatur (Abbildung 3) erscheinen. Unterbrechung dieser normalen Arrays können relativ geringe mit seinangeordnet Sarkomere erscheinen eher zusammenführen als in parallel bleibt. Dieser Phänotyp, mit unc-112 RNAi sichtbar bei t = 24 h oder 48 h (Figur 3), ist vergleichbar mit Z-line-Streaming von Aktin-Bindungsstellen in Säugetiermuskel. Ebenso können kleine Abschnitte der Anordnungen zusammenfallen, oder sie vollständig wie Behandlung mit unc-112 RNAi bei t verschwinden = 48 h bzw. t = 72 h (Figur 3). Die Anwesenheit von Defekten sarcomere im Muskel von Tieren, die einen Bewegungsfehler anzuzeigen (Abbildung 3) ausreichend ist, um die Bewegung Defekt ausmachen, aber nicht unbedingt um andere Probleme, Muskeln, Nerven, und / oder anderen Geweben in Reaktion auf ein Eingreifen .

Bewertung der Mitochondriale Netzwerkstruktur

In Gegenwart eines Bewegungsfehler ist es manchmal wünschenswert, Muskel für andere Defekte verursachen oder dazu beitragen, die Bewegung de prüfen kannfect. Mitochondrien stellen den Großteil der Zellenergie und nimmt in Bewegung kann das Ergebnis der reduzierten ATP vorgesehen sein, wodurch der für die Muskelkontraktion verfügbaren Energie. So ist die Struktur der Mitochondrien Anomalien untersucht werden. Es ist wichtig, nicht zu Tieren mit Natriumazid induziert schnelle mitochondriale Fragmentierung betäuben; Tiere in diesen Experimenten wurden durch den Druck, der durch das Deckglas aufgebracht immobilisiert. Innerhalb Wildtyp C. elegans Körperwand Muskel, sind Mitochondrien innerhalb organisierte Netzwerke (Abbildung 4) enthalten und Mitochondrien existieren und funktionieren als Retikulum 25. Störung des Netzwerks von Mitochondrien zeigt Fragmentierung des Netzwerks (Gas-1 RNAi, 4B) 26. Fragmentierung kann stark genug geworden, dass kein Anschein von organisierten Netzwerken bleibt wie die Behandlung mit unc-112 RNAi (4B und C) 13. Wie with Störungen in Sarkomerstruktur können Defekte im Muskel mitochondriale Struktur in Tieren, die ein Bewegungsfehler anzuzeigen ausreicht, um für die Bewegung Defekt ausmachen, aber dies muss nicht unbedingt um andere Probleme, Muskeln, Nerven, und / oder anderen Geweben. Zum Beispiel, unc-112-Mutanten 13 und Behandlung mit unc-112 RNAi (Abbildungen 3 und 4) sowohl gestört Sarkomere und zerbrochenen mitochondriale Struktur.

Bewertung der mitochondrialen Funktion in vivo

Die mitochondriale Membranpotential bestimmt die Kapazität der Mitochondrien protonenmotorische Kraft, die Fähigkeit, das mitochondriale Membranpotential in vivo zu beurteilen schaffen und ATP 27 zeigt somit die Fähigkeit des Tieres, um ATP zu erzeugen. Wie mitochondrialen strukturellen Störungen können oder nicht mitochondrialen Funktionsfähigkeit zu verändern, kann es sein, desibaren die Mitochondrienfunktion in Tiere mit veränderten mitochondrialen Struktur zu beurteilen. C 32 H 32 Cl 2 N 2 O akkumuliert in Mitochondrien von allen Zelltypen, in denen ein Membranpotential vorhanden ist, und färbt die Mitochondrien 28 (4C). Um konkret zu beurteilen, die Funktion der Mitochondrien in den Muskeln, man verwenden kann, C 32 H 32 Cl 2 N 2 O und GFP-markierten Muskel Mitochondrien, um die Auswirkungen einer Intervention speziell auf Muskel Mitochondrien (4C) zu demonstrieren. Zum Beispiel den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials nach der Behandlung mit unc-112 RNAi verhindert C 32 H 32 Cl 2 N 2 O aus in die Matrix. Die Mitochondrien zeigen daher wenig, falls rote Färbung der Mitochondrien zusätzlich zum GFP Kennzeichnung Mitochondrien (4C). Fotobleichen kann auch verwendet werden, um zu bestätigen, dass die beobachtete werdenMitochondrien sind insbesondere diejenigen, die in den Muskel (4C). Identifizierung einer reduzierten Kapazität zu produzieren ATP ist ausreichend, um eine beobachtete Bewegung Defekt ausmachen, aber schließt nicht aus, andere Probleme in Muskel-, Nerven- und / oder anderen Geweben. Unabhängig davon verringert ATP Produktionskapazität mit Krankheitszuständen bei Menschen 29 und Alterungs 30 zugeordnet, die Identifizierung derartiger Defekt in Reaktion auf einen Eingriff stellt eine Plattform für das Screening auf Verbindungen und / oder RNAi-Behandlungen, die ATP Produktionskapazität zu verbessern, und diese können dann für therapeutische Potenzial weiter untersucht werden.

Beurteilung der Proteinabbau

In Gegenwart eines Bewegungsfehler und normale Sarkomeren und Mitochondrien ist es manchmal wünschenswert, Muskel für andere Defekte verursachen oder dazu beitragen, die Bewegung Defekt zu untersuchen. Die Fähigkeit, die Protein Homöostase ist eine Unterschrift odermal Gesundheit, während eine Verringerung der Proteinsynthese und / oder eine Erhöhung der Proteinabbau ist eine Folge der Alterung 31 und mehreren Krankheitszuständen 32,33. Daher kann es wünschenswert sein, die Muskeln von Tieren mit einem Bewegungsfehler für veränderte Proteinhomöostase untersuchen. Dies kann über Beurteilung Ebenen cytosolischen Muskelproteine ​​erreicht werden. Die Verwendung von transgen kodierten Proteine ​​ermöglicht Beurteilung der muskelspezifischen Proteostase. Zum Beispiel die Verwendung von Tieren, enthaltend β-Galactosidase, zu einem N-terminalen Teil des Myosins fusioniert, das unter der Kontrolle eines Promotors synthetisiert Myosin und Enhancer ermöglicht Beurteilung der cytosolischen Muskelproteingehalt 19. Die Anwesenheit von Blaufärbung in Wildtyp Erwachsenen zeigt die Anwesenheit von aktivem β-Galaktosidase und das Fehlen von pathologischen cytosolischen Proteinabbau. Ein Verlust der Färbung in Reaktion auf die Behandlung schlägt pathologischen Proteinabbau auftritt (Bild 5 13,14,19. Zum Beispiel anzuzeigen unbehandelten Wildtyp-Tiere eine intensive Blaufärbung 72 Stunden nach Erwachsenenalter, während LY-249002 behandelten Tiere zeigen eine fehlende Färbung (Abbildung 5). Wie bei Defekten in Sarkomerstruktur und Mitochondrienfunktion, ist das Vorhandensein von pathologischen Muskelproteinabbau ausreichend Rechnung für eine beobachtete Bewegung Defekt aber nicht unbedingt um andere Probleme mit Muskeln, Nerven, und / oder anderen Geweben.

Figur 3
Abbildung 3: (A) unc-112 RNAi bewirkt eine signifikante Bewegung Defekt bei t = 72 h (B) Beurteilung angeordnet A-Bandstruktur im Körperwand Muskel.. In wT, A-Bands im Muskel erscheint als gerade Linien bei jungen Erwachsenenalter (t = 0 h) und bleiben weitgehend einheitliche, bis über 72 Stunden des Erwachsenenalters (siehe Gew Zoom). unc-112 RNAi bewirkt, dass die Sarkomere, Architektur in kleinen Bereichen zu verlieren der Muskel (t = 24 h), zusammengebrochen und fehlende Sarkomere (t = 48 h), Aggregation (t = 72 h Spitzenplatte und Zoom) und Verlust der Linearität der Sarkomere (t = 72 h Bodenplatte und Zoom). Skalenbalken stellen 25 uM und Zooms sind 2.5X.

Figur 4
Abbildung 4: (A) unc-112 oder Gas-1 RNAi eine Bewegung Defekt (B) Beurteilung der Mitochondrienstruktur innerhalb Körperwand Muskel.. Mitochondrien in der Muskulatur werden als vernetzte Geraden bei jungen Erwachsenenalter (wt). Die Behandlung von Tieren mit unc-112 RNAi führt mitochondrial Fragmentierung, wie zuvor zwischen 24 h und 72 h Erwachsenenalter (Zooms und Pfeil) 13 beobachtet. Ebenso RNAi gegen Gas -1 führt Fragmentierung der Mitochondrien-Netzwerke wie zuvor beobachtet 26. Diese sind wie kleine Lücken in der mitochondrialen Netzwerk bei t = 24 h und Fortschritt für den breiten Desorganisation bei 72 h (siehe Zoom und Pfeil). (C) Bewertung der mitochondrialen Membranpotentials in vivo vorhanden. Bei Tieren auch enthalten GFP zu Mitochondrien lokalisiert, C 32 H 32 Cl 2 N 2 O sammelt sich in Körperwand Muskel Mitochondrien und erscheint Orange unter einem dreifachen Passfilter vom jungen Erwachsenenalter (t = 0 h) bis 72 h nach Erwachsenenalter. Die Behandlung mit unc-112 RNAi bewirkt einen fortschreitenden Verlust von Membranpotential als bei 72 h gezeigt, wo die restlichen Mitochondrien zeigen weniger Akkumulation von C 32 H 32 Cl 2 N 2 O vs. Gew. Photobleaching für 10 SEc mit 540/25 nm-Licht bleicht das rote vom MitoTracker und offenbart die GFP zu Muskel Mitochondrien (+ Foto Bleiche) lokalisiert. Skalenbalken stellen 25 & mgr; m und zoomt sind 2.5X.

Figur 5
Abbildung 5: (A) Behandlung mit LY-294002 Tieren induziert eine Bewegung Defekt (B) Beurteilung der Proteinabbau unter Verwendung eines β-Galactosidase-Assay.. Alter Gew L1-Larven synchronisiert sind, um im jungen Erwachsenenalter bei 20 ° C (t = 0 h) vor der Übertragung auf NGM gewachsen ausgesät mit OP50 (Gew Kontrolle) oder NGM ausgesät mit LY-294002 (PI3K-Inhibitor-Behandlung) für 24 h bei 20 ° C . In A, sind ca. 20-30 Tiere für β-Galactosidase-Aktivität (blau) bei t = 0 h und nach 24 h, 48 h und 72 h angefärbt.

Discussion

Diese Methoden erlauben die Erforschung der Muskel vom macrophysiology der Bewegung, um die Identifizierung subzellulärer Mängel, die ausreichend ist, um eine Bewegung Defekt verursachen. Wenn sie kombiniert diese Methoden erlauben detaillierte Analyse von Muskel. Die gewonnenen Erkenntnisse können weitere Tests der Muskelorientierten Hypothesen, die auf allgemeine Physiologie, Pathophysiologie und Altern betreffen.

Bewegung Assays

Eine Bewegung Defekt bezeichnet eine Störung der normalen neuromuskulären Funktion. Dies kann bestimmte Nerven oder Muskeln, oder es kann gemeinsam auf mehrere Gewebe sein. Die schwierigsten Phasen der Vollendung Bewegung Assays Auswahl Würmer, die repräsentativ für die Bevölkerung und / oder der Behandlung sind, und auch dafür, dass der Experimentator nicht das Tier verletzen bei Übertragung auf M9. Es ist wichtig, einen großen Stichprobe eine repräsentative und genaue Beurteilung der Bewegung zu erhalten. Wenn Testen hoch Stiftetrant Wirkungen, wie beispielsweise häufig in Mutanten gesehen, jeweils eine Probengröße von zehn Tieren für die Bewegung zehnmal beurteilt ausreichend ist, um statistisch signifikante Unterschiede im Vergleich zu Wildtyp finden. , Die Einfachheit der Bewegung Assays und einfache Kultivierung C. elegans bedeuten jedoch, dass Hunderte von Würmern kann schnell um quantitativ robuste Ergebnisse zu gewährleisten beurteilt werden. Beim Testen von Effekten, die in nur einem Teil einer Population vorhanden erscheint es wichtig, zu bestimmen, welcher Anteil der Bevölkerung scheint ebenfalls betroffen sein, wie der Schwere des Defekts in den betroffenen Tieren. In solchen Situationen sollten, um die minimalen Daten Anteil der betroffenen Bevölkerung eine größere Anzahl von Tieren zu beurteilen. Häufig Arzneimittel- und RNAi-Behandlungen werden schwere Bewegungsfehler in einem kleinen Teil der Bevölkerung zu erzeugen. In einigen Fällen eine Erhöhung der Dosis der Behandlung und oder der Art der Lieferung wird der Anteil der aff erhöhenreflektierte Tieren und Lauf Dosis-Antwort-Kurven können nützlich in der Bestimmung der optimalen Konzentration eines Arzneimittels oder RNAi ist. Eine zweite Begrenzung dieser Bewegung Assays ist, dass die Würmer manipuliert werden, um die Bewegung abzuschätzen. Somit werden die Würmer sowohl stimuliert und zu einem gewissen Grad von osmotischem Stress ausgesetzt, wenn sie in flüssiger gerichtet. Der Grad der osmotischen Stress kann durch Verwendung M9 oder BU-Puffer 19, im Gegensatz zu Wasser beschränkt. Einige dieser Einschränkungen werden durch die Messung gewöhnlichen Bewegung auf Platten mit kommerziell erhältlichen Nachführsysteme 34 oder kostenlose Plug Ins für ImageJ 35 gemildert. Die Messung der Bewegungsgeschwindigkeit eines Tieres können wichtige Informationen über die allgemeine Muskel Gesundheit, einschließlich Änderungen der Funktion, die in der gesamten Lebensspanne gemessen werden kann und der nicht-Invasivität dieser Methode ist der Schlüssel für angeh lebenslangen Studien der Muskelfunktion bereitzustellen.

Imaging des kontraktilen Apparates

<p class = "jove_content"> Der Wurm Stamm Bild kontraktilen Apparates Struktur verwendet hier war PJ727 36, der eine Myosin GFP-Fusionsprotein, die Sarkomere innerhalb der Körperwand Muskeln lokalisiert ist Ausdruck bringt. Die Nutzung dieser Sorte ermöglicht die Visualisierung von Sarkomerstruktur in lebenden Tieren. Ähnlich zu der oben beschriebenen Bewegung Assay ist ein wichtiger Vorteil der Verwendung von GFP markierten Sarkomeren um Sarkomerstruktur beurteilen, daß das Verfahren relativ nicht-invasiv und können daher verwendet werden, um prospektiv folgen Sarkomerstruktur in einzelnen Tieren während des gesamten Lebensdauer. Die größte Schwierigkeit bei dieser Methode ist, dass die Würmer, die abgebildet ist noch am Leben sind und somit in Bewegung, was es schwierig macht gut fokussierte Bilder zu bekommen macht. Mehrere Verfahren können verwendet werden, um die Bewegung zu reduzieren und Abbilden einfacher; Dazu gehören Anästhesie oder Lähmung der Würmer und Immobilisierung über Druck, Sog, oder die Verwendung eines hochviskosen Lösung. Jede dieser Methoden der immobilization hat den Nachteil, dass sie sich die neuromuskuläre Funktion verändern. Daher ist es wichtig, entsprechende unbehandelten Kontrollen in der Analyse enthalten. Es kann auch sinnvoll, mindestens zwei unabhängige Methoden der Immobilisierung zu verwenden, um zu bestätigen Ergebnisse nicht aufgrund von Problemen mit dem Immobilisierungsverfahren, je nachdem, wie weit verbreitet das gewählte Immobilisierungsverfahren ist für die Frage untersucht. Hier haben wir einfach dem Druck des Deckglases auf den Wurm verwendet, um eingeschränkter Bewegung zu induzieren. Nach dem Platzieren des Deckglases wird die Flüssigkeit unter dem Deckglas zu verdampfen und das Deckglas wird folglich beginnen, mehr Druck auf die Würmer produzieren, in der Regel dies dauert 2-5 min, genug reduziert Bewegung zu erzeugen, um einfache Bildgebung zu ermöglichen.

Es ist wichtig, um die Würmer zu überwachen eng, nachdem die Deck hat wie der Druck wird schließlich zu erhöhen genug, um die Würmer zu veranlassen, von übermäßigem Druck platzen, typischerweise 10-15 min nach Co eingeführtverslip hinaus. Zusätzliche Puffer kann mit Hilfe einer Pipettenspitze an den Kanten des Deckglases eingebracht werden, um Quetschverletzungen zu vermeiden, die Würmer. Nagellack kann verwendet werden, um die Kanten des Deckglases abzudichten und zu verhindern, Verdampfung, obwohl dies verhindert, dass die Wiedergewinnung von Tieren unter dem Deckglas, falls gewünscht. Ebenso kann die Verwendung von Silikonkügelchen in der Lösung zur Verringerung der Menge an Druck, den die Deck Stellen der Würmer.

Genau wie bei der Beurteilung einer Bewegung Defekt ist es wichtig, die Penetranz Effekt berücksichtigen. Penetranz kann als hoch, wenn 80-100% Tieren zeigen eine Phänotyp auf der NGM Platte, teilweise, wenn 21 bis 79% und niedriger, wenn ≤20% der Bevölkerung Anzeige einen Einfluss. Für stark penetrant Wirkungen können kleinere Probengrößen verwendet werden, um signifikante quantitative Daten über Sarkomer Defekte zu produzieren. In Fällen, in denen der Effekt hat eine geringe Penetranz Auswahl der Tiere, die eine klare Bewegung Defekt in Reaktion auf Arzneimittel anzuzeigenoder RNAi-Behandlung kann bei der Bestimmung von Sarkomer Mängel in den meisten von der Behandlung betroffenen Tiere. Jedoch ist es nicht notwendigerweise der Fall, dass das Ausmaß der Behandlungseffekt auf die Bewegung und subzellulären Struktur ist die gleiche. Somit kann es wünschenswert sein, das Ausmaß der in einer großen Population vorliegende Defekte zu untersuchen, beispielsweise 100 Tiere. Dies ermöglicht das Verständnis der Verteilung von Defekten der gesamten Bevölkerung. Es kann auch wünschenswert sein, das Ausmaß des Defekts in den am stärksten betroffenen Tieren zu untersuchen und / oder überprüft die Korrelation zwischen Ausmaß des Defekts sarcomere und das Ausmaß der Bewegung Defekt. Mögliche Schwierigkeiten beiseite, ist diese Methode schneller und einfacher als andere Methoden zur Bewertung Sarkomerstruktur. Diese Geschwindigkeit und die Leichtigkeit ist, unterliegt jedoch eine wesentliche Einschränkung, Sarkomeren GFP-Fusionsproteine ​​enthalten, sind nicht völlig normal 37 und daher Beurteilung unterbrochen Sarkomeren sollte mit zusätzlichen arbeitsintensive Verfahren bestätigt werden.Diese Methoden umfassen die Verwendung von polarisiertem Licht 38, Phalloidin Färbung 39 und indirekte Immunfluoreszenz 40. Von diesen Verfahren ist nur polarisiertes Licht relativ nicht-invasive; die anderen Methoden der Fixierung und kann daher nicht in prospektiven Studien einzelner Tiere verwendet werden, sondern sie können nur verwendet werden, um zu bestätigen, im Querschnitt die Ergebnisse solcher Studien.

Imaging der mitochondrialen Networks

Die Wurmstamm für die mitochondriale Abbildungsexperimente verwendet wurde CB5600 7, die ein GFP-Fusionsprotein in die Mitochondrien und ein GFP β-Galactosidase-Fusionsprotein zu den Kernen lokalisiert lokalisiert drückt sowohl in den Körperwandmuskulatur. Wie bei Verwendung von PJ727 zur Bildgebung Sarkomeren Verwendung dieses Stammes ermöglicht die Visualisierung der mitochondrialen Netzstruktur in lebenden Tieren. Somit kann dieser Stamm verwendet werden, um dynamische Veränderungen, die auftreten zu bewerten, beispielsweise verringert mitochondrial Fusion und / oder erhöhte mitochondriale Spaltung 41. Auch als für die Bildgebung Sarkomere, die größte Schwierigkeit bei dieser Methode ist, dass die Würmer, die abgebildet sind noch am Leben und in Bewegung, was es erschwert, gut fokussierte Bilder zu bekommen. Während verschiedene Verfahren, wie oben im Detail diskutiert, kann verwendet werden, um die Bewegung zu reduzieren, Mitochondrien scheinen besonders empfindlich auf Eingriffe, verminderter Bewegung zu induzieren. B. gebräuchlichsten Anästhetika Zielkomponenten der mitochondrialen Atmungskette und sind daher mit Vorsicht in Studien der normalen mitochondriale Struktur und Funktion verwendet werden. Ebenso müssen die meisten Lähmungsmittel mit Vorsicht in den Studien der normalen mitochondrialen Struktur und Funktion ausreichend genutzt werden, da die meisten Lähmungsmittel verursachen weniger Signal durch den neuromuskulären Synapse und funktionelle Denervierung des Muskels übergeben wird, um die mitochondriale Fragmentierung induzieren. Die Experimente in dieser Studie angewandte Druck zu Tier immobilisierens aber andere erfolgreich eingesetzt Levamisol 42, obwohl es wesentlich ist, Bild Tiere sofort.

Schließlich verschiedene bakterielle Verunreinigungen in Kulturen, beispielsweise B. subtilis, kann mitochondriale Fragmentierung induzieren; Daher ist es wichtig, entsprechende unbehandelten Kontrollen in der Analyse enthalten. Für stark penetrant Wirkungen können kleinere Probengrößen verwendet werden, um signifikante quantitative Daten über mitochondriale Leitungensnetzen produzieren. Aufgrund der Prävalenz von kleineren Defekten im mitochondrialen Netz, ist diese kleine Anzahl der Tiere, die die doppelte Anzahl zur Beurteilung Sarkomerstruktur benötigt werden. In Fällen, in denen der Effekt hat eine geringe Penetranz kann die Auswahl von Tieren deutlich Anzeigen eines Mangels Bewegung in Reaktion auf Arzneimittel oder RNAi-Behandlung nützlich bei der Untersuchung der mitochondrialen Defekten in den meisten von der Behandlung nicht beeinflusst Tiere. Wie oben erwähnt, ist es jedoch nicht notwendigerweise der Fall, dass dasUmfang der Behandlungseffekt auf die Bewegung und subzellulären Struktur ist die gleiche. Somit kann es wünschenswert sein, das Ausmaß der in einer großen Population vorliegende Defekte zu prüfen, zum Beispiel 150-200 Tiere sowie das Ausmaß der Störung in den am stärksten betroffenen Tieren und die Anwesenheit oder Abwesenheit des Ausmaßes der Störung mit Ausmaß Bewegung Defekt. Andere Stämme mit fluoreszierend markierten Mitochondrien verwendet, um Ergebnisse in CB5600 bestätigen zu werden, aber die Verwendung unterschiedlicher Fluoreszenzproteine ​​können die Basis Vernetzung von Mitochondrien beeinflussen. Beispielsweise wird die Verwendung eines TOMM-20 RFP Fusionsprotein an Mitochondrien sichtbar zu erhöhten Ausgangs mitochondriale Fragmentierung gegenüber der Verwendung von Mitochondrien lokalisiert GFP 17 verursachen. Während andere Methoden wie Immunfluoreszenz und Elektronenmikroskopie können verwendet werden, um die mitochondriale Struktur zu bewerten, sie erlauben nicht die in vivo-Beurteilung der Mitochondriendynamik, da eine Fixierungsschritt ist erforderlichd. Andere Verfahren wie die Verwendung von Mitochondrien lokalisiert Farbstoffe können ohne Befestigung verwendet werden und kann daher auch an Stelle der Benutzung Mitochondrien lokalisiert GFP verwendet werden. Wie im nächsten Abschnitt beschrieben, ermöglicht die Verwendung von solchen Farbstoffen auch rohe Beurteilung der in vivo Funktion der Mitochondrien.

Beurteilung der Mitochondrienmembranpotential in vivo in C. elegans

Eine Vielzahl von Farbstoffen zur Markierung Mitochondrien 28 zur Verfügung. Diese Farbstoffe stellen eine alternative Methode zur Visualisierung mitochondrialen Netzstruktur in lebenden C. elegans. Viele dieser Farbstoffe auch ermöglichen rohe Beurteilung der mitochondrialen Funktion in vivo, da sie in den Mitochondrien, bezogen auf das mitochondriale Membranpotential zu akkumulieren. Hier haben wir verwendet haben C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, die durch Einnahme wirdder Verdauungstrakt, wobei einige zusätzlich in die Schnecke über die Kutikula durch die Permeabilisierung indem sie in 0,5% DMSO gelöst lieferte. Nach dem Eintritt in die Zelle C 32 H 32 Cl 2 N 2 O oxidiert und von den Mitochondrien, wo sie schwefelhaltige Aminosäuren (zB Methionin und Cystein) bindet sequestriert. Die Bildung dieser Farbstoff-Peptid-Komplexe bedeutet C 32 H 32 Cl 2 N 2 O bleibt in den Mitochondrien einmal markiert 28. Eine Hauptschwierigkeit bei der Verwendung von mitochondrialen Farbstoffe ist, dass sie alle Mitochondrien in das Tier zu markieren. Deshalb haben wir die Kennzeichnung in CB5600, die oben für die Beurteilung Muskel mitochondrialen Netzstruktur beschrieben demselben Stamm durchgeführt. Durch die Verwendung eines roten mitochondrialen Farbstoff, ein Stamm von Würmern, die GFP im Muskel Mitochondrien und eine dreifache Passfilter, ist es relativ einfach, nur Bild Mitochondrien in der Muskulatur durch Auffinden Mitochondrien, die sind oBereich durch Kolokalisation von roten Farbstoff und GFP-markierten Mitochondrien. Der schwierigste Schritt in der Durchführung dieses Kolokalisation Ansatz ist Bildgebung, weil der Farbstoff photo gebleicht innerhalb von Sekunden unter hoher Intensität Fluoreszenzlicht. Dieser Effekt kann durch Halten der Fluoreszenz auf Low-Power, bis der Experimentator ist bereit, das Bild und dann entsprechend Einstellen der Fluoreszenzintensität begrenzt. Sobald man bei der Verwendung von Farbstoffen erlebt weiterer Ansatz ist die konfokale Mikroskopie mit Z-Stapel, um Bild nur Mitochondrien in der rechten Gewebe zu verwenden; die mitochondriale Netzwerke Muskel ganz verschieden im Vergleich zu anderen Geweben. Leider ist die Unfähigkeit der C 32 H 32 Cl 2 N 2 O an die Mitochondrien 28 verlassen, bedeutet, dass, anders als die sarcomere und mitochondriale Bildgebungstechniken oben diskutiert, kann es nicht verwendet werden, um prospektiv folgen Verlust von Mitochondrienfunktion mit der Zeit, es sei denn, C 32 H 32 Cl 2 N 2 Owird zu diskreten Zeitpunkten hinzugefügt, um Tierpopulationen zu trennen. Diese Einschränkung kann durch Verwendung von Farbstoffen, wie JC-10, die verlassen den Mitochondrien bei Zusammenbruch des Membranpotentials 43 tun überwunden werden. Mitochondrien können auch aus C isoliert werden elegans 30 für nachfolgende biochemische Analysen. Derartige Extraktion erlaubt eine Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials durch die Quantifizierung der Geschwindigkeit von lipophilen kationischen Farbstoffaufnahme unter Verwendung von Durchflusszytometrie oder Fluoreszenz-Plattenlesegerät 44. Nachdem fest eine gestörte mitochondriale Membranpotential, ist es auch möglich zu bestimmen, ob der Verlust von Protonengradienten führt zu einem Verlust von ATP-Produktion unter Verwendung eines empfindlichen bioluminometric Luciferase-basierte Methode 45.

Beurteilung Proteinabbau in C. elegans

Die Wurmstamm für die Beurteilung Muskelproteinabbau verwendet hier war PD55, der einen Muskel spezifische β enthält-Galactosidase, dass kontinuierlich während der gesamten Entwicklung synthetisiert bis ins Erwachsenenalter erreicht ist und der für den nächsten 72-96 Stunden 19 im Cytosol stabil bleibt. Somit Messung der β-Galactosidase-Niveaus während der Entwicklung hauptsächlich zeigt die Auswirkungen von Eingriffen Synthese der Myosin-Promotor, wohingegen der Verlust von β-Galactosidase im Erwachsenenalter zeigt eine Intervention ausgelöst erhöhte cytosolische Proteinabbau 19. Der Schlüsselschritt bei der Beurteilung der β-Galactosidase-Aktivität ist die effektive Trocknung zu gewährleisten. Versagen, die Tiere wirksam austrocknen zu schlechten Bereitstellung der X-gal-Substrat und daher schlecht blaue Farbe der Körperwand-Muskulatur der Tiere. Um eine gute Austrocknung sicherzustellen, dass die Dichtung auf dem Exsikkator sollten überprüft werden, und die Probe sollte bei 5-10 min Abständen während Austrocknung überprüft, um die Fortschritte zu bewerten (dh die 20 ul Probe sollte innerhalb von 10 Minuten und die restlichen 20 Minuten getrocknet habenist es, umfassende Austrocknung zu gewährleisten). Die β-Galactosidase-Assay ist ein Aktivitätstest ist daher ein geeignetes Steuer wesentlich. Zusätzlich verringerte Färbung der Erwachsenen in einem Behandlungsbedingung im Vergleich zur Kontrolle, beweist nicht, dass der Abbau stattfindet; sondern sie zeigt verringerte enzymatische Aktivität in Reaktion auf die Behandlung. Um den Abbau zu bestätigen, müssen arbeitsintensiver Western-Blot-Analyse gegen β-Galactosidase 13 abgeschlossen werden und dies ermöglicht die Quantifizierung der Proteinabbau in kleinen Populationen von gezählten Würmer. Western-Blot-Band Dichten mit ImageJ 46 quantifiziert werden. Eine weitere Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass die Verwendung von transgenen Proteinen nicht als den physiologischen Ziele Abbau und für solche Antworten proteomischen und / oder Zielhypothese angetrieben Westernblots muss verwendet 13 werden mit. Schließlich ist, wie die Synthese des transgenen Proteins in diesen Studien verwendeten schaltet im frühen Erwachsenenalter 19 C. elegans zu untersuchen Muskel; zum Beispiel stabil oder radioaktives Isotop Methoden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) Invitrogen M-7512 Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential
DMSO Thermo Scientific 67-63-5
KH2PO4 Sigma 7778-77-0
Na2HPO4 BDH 301584L
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
MgSO4 Sigma M-7506
Microscopy Slides Starfrost K220
Microscopy Cover Slips VW2 International 631-0124
1.5 ml Eppendorph Tubes Fisher Scientific FB74031
Dessicator Nalgene D2672
Nikon Microscope Nikon H600L Nikon H600L microscope with proprietary software
Nikon Camera Nikon DS-Fi1 Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera 
Zeiss Microscope Zeiss Ax10 Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter
Plates 9 cm Starstedt 82-1473
Plates 6 cm Gosselin BP53-01
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich 14459-95-1 
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3
Na3PO4 Sigma-Aldrich 7601-54-9
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside Sigma-Aldrich 7240-90-6 
N,N-dimethylformamide Sigma-Aldrich 68-12-2 

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References

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Gaffney, C. J., Bass, J. J., Barratt, T. F., Szewczyk, N. J. Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans. J. Vis. Exp. (93), e52043, doi:10.3791/52043 (2014).More

Gaffney, C. J., Bass, J. J., Barratt, T. F., Szewczyk, N. J. Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans. J. Vis. Exp. (93), e52043, doi:10.3791/52043 (2014).

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