Skelettmuskulatur är avgörande för transport och är av organens huvudsakliga protein butik. Muskelhälsomätningar inom C. elegans beskrivs. Blivande förändringar muskel struktur och funktion bedöms med hjälp av lokal GFP och katjoniska färgämnen.
Muscle är en dynamisk vävnad som reagerar på förändringar i kost, motion, och sjukdomstillstånd. Den förlust av muskelmassa och funktion med sjukdom och ålder är betydande hälsoproblem offentliga. Vi har för närvarande förstår lite om den genetiska regleringen av muskelhälsa med sjukdom eller ålder. Nematoden C. elegans är en etablerad modell för att förstå den genomiska regleringen av biologiska processer av intresse. Denna mask kropp väggen muskler visar en hög grad av homologi med musklerna i högre flercelliga arter. Sedan C. elegans är en transparent organism, lokalisering av GFP till mitokondrier och sarkomerer möjliggör visualisering av dessa strukturer in vivo. På liknande sätt, mata djuren katjoniska färgämnen, som ackumuleras baserat på förekomsten av en mitokondriell membranpotential, möjligt att bedöma om mitokondriell funktion in vivo. Dessa metoder, samt bedömning av muskelprotein homeostasis, kombineras med bedömning av hela djuret muskelfunktion, i form av varuanalyser, för att möjliggöra korrelation av sub-cellulära defekter med funktionella mått på muskelprestanda. Således ger C. elegans en kraftfull plattform som man kan bedöma effekterna av mutationer, gen knockdown, och / eller kemiska föreningar vid muskelstruktur och funktion. Slutligen, såsom GFP, katjoniska färgämnen, och transportanalyser bedöms icke-invasivt kan prospektiva studier av muskelstruktur och funktion att utföras över hela livsförlopp och detta för närvarande inte lätt kan undersökas in vivo i någon annan organism.
Muscle är en multifunktionell vävnad, mycket uppskattat för sin roll i förflyttning, postural stöd och metabolism. Utveckling och underhåll av friska muskler kräver samordning av flera cellulära processer och komponenter. Antingen genom skada eller sjukdom, kan dysregulation uppstå, vilket leder till förändrad muskelstruktur och / eller funktion. Åldersrelaterad nedgång i muskelfunktion utgör en betydande börda för sjukvårdsbudgetar i västvärlden, eftersom muskelmassa 1,2 och speciellt muskelstyrka och uthållighet 3-5 är negativt korrelerad med dödlighet. Mätningen av aspekter försämrad muskelfunktion, såsom förändrad mitokondriefunktion eller sarcomere störningar, kan nå större kunskap om de mekanismer som ligger till grund övergripande muskelutveckling och hälsa.
C aenorhabditis elegans (C. elegans) är en mikroskopisk nematod best känt för att det var den första flercellig organism att ha hela sitt genom sekvens 6, den första som har gener tystas med hjälp av RNAi 7, och den enda metazoan att ha sina hela cellen härstamning 8 och neuroanatomi 9 bestämdes. C. elegans var först föreslagits som en modell för att studera genetisk kontroll av beteende 1974 av Sydney Brenner 10 och vikten av detta och efterföljande arbete belönades med det första av tre Nobelpris tilldelats C. elegans forskare. Cirka 35% av C. elegans gener har identifierat ortologer hos människor, med C. elegans är en nyckelorganism som används för att förstå den genetiska kontrollen av muskelutveckling 11. Nästan varje gen i C. elegans arvsmassa kan vara knackat genom RNAi 7,12. Således, genom att knacka ner gener i fullt utvecklad muskulatur, genetiska komponenter som bidrar till återgulation av muskel hälsa kan undersökas med relativ enkelhet 13.
Den kombinerade förmåga att använda RNAi, mutanter och kemiska föreningar gör C. elegans en ledande systemet för att utforska den genetiska regleringen 7,14,15 av muskel struktur och funktion med 16 års ålder och sjukdomsmodeller 17. Effekterna av genen knockdown, mutation, och / eller exponering för kemiska föreningar vid muskelstruktur och / eller funktion kan mätas genom flera aspekter. Här beskriver vi kortfattat enkla tekniker för bedömning C. elegans muskel struktur och funktion, av vilka många kan användas i prospektiva studier av muskelhälsa.
Utvecklingen av grönt fluorescerande protein (GFP) 18 har möjliggjort visualisering av både tätort av specifika proteiner och den allmänna strukturen hos organeller i C. elegans. Här förklarar vi hur GFP uttryckt specifically inom kroppen väggen muskler mitokondrier, kan kärnor eller sarkomerer användas för att avgöra om dystrofi av dessa undercellulära strukturer är närvarande. Eftersom strukturen är inte alltid en tillförlitlig surrogat för funktion, förklarar vi också hur användningen av katjoniska färgämnen in vivo möjliggör bedömning av nedsatt mitokondriell membranpotential i muskeln. När färgämnen används i kombination med GFP, medger de att studera arkitektur och funktion på ett tidsmässigt sätt i hela livslängd. Slutligen förklarar vi också hur protein homeostas i muskeln kan bedömas och hur alla dessa åtgärder kan användas för att korrelera förändringar av hela djuret muskelhälsa genom användning av rörelseanalyser. Dessa tekniker, i kombination med gen knockdown, mutationer och / eller kemiska föreningar ger en kraftfull arsenal för att studera hur specifika gener eller föreningar påverkar muskelhälsa in vivo. De paralleller i strukturen, metabolism och brutto funktion av muskler mellan C. elegans ochdäggdjur menar C. elegans är en enastående modellorganism för att förstå regleringen av muskeln i högre organismer, inklusive människor.
Dessa metoder gör det möjligt att utforska muskler från den macrophysiology rörligheten till att identifiera subcellulära defekter som är tillräckligt för att orsaka en rörelse defekt. När de kombineras dessa metoder tillåter detaljerad analys av muskler. Insikten fick möjliggör ytterligare tester av muskelinriktade hypoteser som rör allmän fysiologi, patofysiologi och åldrande.
Riktning Analyser
En rörelse fel indikerar en störning av normal neuromuskulär funktion. Detta kan vara specifika för nerver eller muskler eller det kan vara gemensamma mellan flera vävnader. De svåraste faserna i skapandet rörelseanalyser väljer maskar som är representativa för befolkningen och / eller behandling, och även se till att försöksledaren inte skadar djuret vid överföring till M9. Det är viktigt att ha en stor provstorlek för att erhålla en representativ och korrekt bedömning av rörelse. Vid analys av mycket pennaetrant effekter, till exempel som ofta ses i mutanter, en provstorlek av tio djur vardera utvärderas för rörelse tio gånger är tillräcklig för att finna statistiskt signifikanta skillnader jämfört med vildtypen. Men enkelheten rörelseanalyser och enkel odling C. elegans gör att hundratals maskar snabbt kan bedömas för att säkerställa kvantitativt robusta resultat. När analys av effekterna som visas föreligger i endast en del av en population är det viktigt att avgöra hur stor del av befolkningen förefaller att påverkas liksom svårighetsgraden av fel i de drabbade djuren. I sådana situationer ska bedömas för att ge de grundläggande uppgifter för andel av befolkningen som drabbats större antal djur. Ofta både läkemedel och RNAi-behandlingar kommer att producera svåra rörelsedefekter i en liten del av befolkningen. I vissa fall att öka dosen av behandling och eller den metod för leverans kommer att öka andelen av affsad djur och kör dos-responskurvor kan vara användbara för att bestämma den optimala koncentrationen av ett läkemedel eller RNAi. En andra begränsning av denna rörelse analys är att maskarna är manipulerade för att utvärdera rörelsen. Sålunda maskarna är båda stimuleras och utsattes för en viss grad av osmotisk påfrestning när de plockas in i vätskan. Graden av osmotisk stress kan begränsas med hjälp av M9 eller BU-buffert 19 i stället för vatten. En del av dessa begränsningar lindras genom att mäta vanliga rörelser på plattor med hjälp av kommersiellt tillgängliga spårningssystem 34 eller gratis plug ins för ImageJ 35. Mätning av rörelsehastigheten hos ett djur kan ge viktig information om den totala muskelhälsa, inklusive förändringar i funktion som kan mätas under hela livet och den icke-invasivt med denna metod är nyckeln för blivande livslånga studier av muskelfunktion.
Imaging av kontraktila Apparatus
<p class = "jove_content"> Snäckstam som används här för att bild kontraktila apparat struktur var PJ727 36 som uttrycker en myosin GFP-fusionsprotein som är lokaliserad till sarkomerer i kroppen väggen muskler. Användning av denna stam möjliggör visualisering av sarcomere struktur i levande djur. I likhet med rörelseanalys som beskrivits ovan, är en viktig fördel med att använda GFP märkta sarkomerer att bedöma sarcomere struktur att metoden är relativt icke-invasiv och kan därför användas för att prospektivt följa sarcomere struktur i enskilda djur under hela livet. Den största svårigheten med denna metod är att de maskar som är avbildade är fortfarande vid liv och därför flytta, vilket gör det svårt att få väl fokuserade bilder. Flera metoder kan användas för att reducera rörelse och gör avbildning enklare; dessa inkluderar anesthetizing eller förlamande maskar och immobilisering via tryck, sug, eller användning av en lösning med hög viskositet. Var och en av dessa metoder för immobiliztion har den nackdelen att den själv kan förändra neuromuskulär funktion. Därför är det viktigt att inkludera lämpliga obehandlade kontroller i analysen. Det kan också vara klokt att använda minst två oberoende metoder för immobilisering för att bekräfta resultaten inte beror på problem med immobilisering metoden, beroende på hur flitigt immobilisering valda metoden för den fråga som studeras. Här har vi använt enkla tryck från täckglas på masken att medföra försämrad rörlighet. Efter att ha placerat täck kommer vätskan under täck avdunsta och täckglas kommer följaktligen att börja producera mer press på de maskar, vanligtvis det tar 2-5 minuter att producera tillräckligt nedsatt rörlighet för att möjliggöra enkel avbildning.Det är nödvändigt att övervaka maskarna noggrant efter att täck har införts som trycket kommer så småningom att öka tillräckligt för att orsaka maskarna att spricka från överdrivet tryck, vanligen 10-15 min efter samtidigverslip tillsats. Ytterligare buffert kan införas med hjälp av en pipettspets runt kanterna på täckglaset för att undvika krosskada till maskar. Nagellack kan användas för att täta kanterna på täckglas och förhindra avdunstning, även om detta förhindrar hämtning av djur från under täckglas, om så önskas. På liknande sätt kan användningen av silikonpärlor i lösning bidrar till att minska den mängd tryck täck platser på maskar.
Precis som med att bedöma om en rörelse fel, är det viktigt att beakta penetrans av effekten. Penetrans kan betraktas som hög, om 80 till 100% djur uppvisar en fenotyp på NGM tallrik, delvis om 21-79%, och låg om ≤20% av befolkningen displayen en inverka. För mycket penetrerings effekter, kan mindre provstorlekar användas för att ge betydande kvantitativa uppgifter om sarcomere defekter. I de fall där effekten har låg penetrans, urval av djur som visar en tydlig rörelse defekt i svar på läkemedelseller RNAi behandling kan vara användbara vid analys sarcomere defekter hos djur som drabbats hårdast av behandlingen. Emellertid är det inte nödvändigtvis så att omfattningen av behandlingseffekten på rörelse och subcellulära strukturen är densamma. Sålunda kan det vara önskvärt att undersöka omfattningen av defekter som föreligger i en stor population, t ex 100 djur. Detta möjliggör förståelsen av fördelningen av defekter genom en population. Det kan också vara önskvärt att undersöka omfattningen av fel i de värst drabbade djur och / eller undersöka sambandet mellan graden av sarcomere fel och omfattning rörelsedefekt. Potentiella problem åt sidan, är denna metod snabbare och enklare än andra metoder för beräkning sarcomere struktur. Denna snabbhet och enkelhet är dock föremål för en nyckel begränsning, sarkomerer innehåller GFP fusionsproteiner är inte helt normal 37 och därmed bedömningen av störda sarkomerer bör bekräftas med hjälp av ytterligare mer arbetsintensiva metoder.Dessa metoder inkluderar användning av polariserat ljus 38, phalloidin färgning 39, och indirekt immunofluorescens 40. Av dessa metoder är endast polariserat ljus relativt icke-invasiv; de andra metoderna kräver fixering och kan därför inte användas i prospektiva studier av enskilda djur, utan de kan bara användas för att bekräfta, korsa sektion och resultat från sådana studier.
Imaging av mitokondrie-nätverk
Masken stam som används för de mitokondriella imaging experiment var CB5600 7 som uttrycker en GFP-fusionsprotein lokaliseras till mitokondrierna och en GFP-β-galaktosidas fusionsprotein lokaliserat till kärnorna, både i kroppsväggen muskler. Som med användning av PJ727 för avbildning sarkomerer, användning av denna stam möjliggör visualisering av mitokondriell nätverksstruktur i levande djur. Sålunda kan denna stam användas för att bedöma dynamiska förändringar som sker, till exempel reducerad mitochondrial fusion och / eller ökad mitokondrie fission 41. Också som för avbildnings sarkomerer, är den största svårigheten med denna metod att maskarna som avbildas fortfarande lever och rör sig, vilket gör det svårt att få väl fokuserade bilder. Medan flera metoder, såsom diskuteras mer i detalj ovan, kan utnyttjas för att reducera rörelse, mitokondrier verkar särskilt känsliga för interventioner som inducerar nedsatt rörlighet. Till exempel, de flesta vanligen använda bedövningsmedel målkomponenter av den mitokondriella andningskedjan och är därför måste användas med försiktighet i studier av normal mitokondriell struktur och funktion. På samma sätt måste de flesta paralytisk medel användas med försiktighet till studier av normal mitokondrie struktur och funktion, eftersom de flesta paralytisk medel orsakar mindre signal att passera genom den neuromuskulära förbindelsen och funktionell denervation av muskeln är tillräcklig för att framkalla mitokondriella fragmentering. Experimenten i denna studie användes tryck för att immobilisera djurets men andra har framgångsrikt använt levamisol 42, även om det är viktigt att bilddjur omedelbart.
Slutligen olika bakteriella föroreningar i kulturer, till exempel B. subtilis, kan inducera mitokondriella fragmentering; Därför är det viktigt att inkludera lämpliga obehandlade kontroller i analysen. För mycket penetrerings effekter, kan mindre provstorlekar användas för att ge betydande kvantitativa uppgifter om mitokondriella nätverksdefekter. Men på grund av förekomsten av mindre fel i den mitokondriella nätet, kommer sannolikt att vara dubbelt så många som behövs för bedömning av sarcomere struktur detta lilla antal djur. I de fall där effekten har låg penetrans, kan valet av djur uppenbarligen uppvisar en rörelsedefekt som svar på läkemedel eller RNAi behandling vara användbar vid analys mitokondriella defekter hos djur som drabbats hårdast av behandlingen. Emellertid, såsom nämnts ovan, är det inte nödvändigtvis så att denomfattningen av behandlingseffekt på rörelse och subcellulär strukturen är densamma. Således kan det vara önskvärt att undersöka omfattningen av defekter som förekommer i en stor population, till exempel 150-200 djur, liksom omfattningen av störningar i de svårast drabbade djur och närvaron eller frånvaron av omfattningen av störningar med omfattningen av rörelse defekt. Andra stammar med fluorescerande mitokondrier kan användas för att bekräfta resultat som erhållits i CB5600 kan dock användningen av olika fluorescerande proteiner påverkar baslinjen nätverk av mitokondrier. Till exempel visas användningen av en TOMM-20 RFP fusionsprotein för att visualisera mitokondrierna att orsaka ökad baslinjen mitokondrie fragmentering kontra användningen av mitokondriellt lokaliserad GFP 17. Även andra metoder såsom immunofluorescens och elektronmikroskopi kan användas för att bedöma mitokondrie struktur, de inte tillåter en bedömning av mitokondriella dynamik in vivo eftersom en fixerings steg är att krävad. Andra metoder, såsom användning av mitokondriellt lokaliserade färgämnen kan användas utan fixering och därför kan också användas i stället för användning av mitokondriellt lokaliserad GFP. Som diskuteras i nästa avsnitt, användningen av sådana färgämnen gör också rå bedömning av in vivo mitokondriefunktion.
Bedöma mitokondriell membranpotential in vivo i C. elegans
En mängd olika färger finns tillgängliga för märkning av mitokondrier 28. Dessa färgämnen ger en alternativ metod för att visualisera mitokondriell nätverksstruktur i levande C. elegans. Många av dessa färgämnen tillåter också rå bedömning av mitokondriell funktion in vivo eftersom de ansamlas i mitokondrier baserade på den mitokondriella membranpotential. Här har vi använt C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, som intas genommag-tarmkanalen, med några ytterligare in i masken via nagelbanden på grund av permeabilization ges genom att upplösas i 0,5% DMSO. Efter inträdet i cellen C 32 H 32 Cl 2 N 2 O oxideras och lagras i mitokondrierna, där den binder svavelinnehållande aminosyror (t.ex. metionin och cystein). Bildningen av dessa färgämnespeptidkomplex betyder C 32 H 32 Cl 2 N 2 O kvarstår i mitokondrierna gång märkta 28. En viktig svårighet med användningen av mitokondriella färgämnen är att de kommer att märka alla mitokondrier i djuret. Därför har vi utfört märkningen i CB5600, samma stam som beskrivits ovan för att bedöma muskel mitokondriell nätverksstruktur. Genom att använda en röd mitokondriell färgämne, en stam av maskar som uttrycker GFP i muskel mitokondrier, och en trippel passfilter, är det relativt enkelt att bilden bara mitokondrier i musklerna genom att hitta mitokondrier som är ointervall genom colocalization av rött färgämne och GFP märkta mitokondrier. Det svåraste steget i att utföra detta colocalization tillvägagångssätt är avbildning, eftersom färgämnet är fotoblekt inom några sekunder under hög intensitet fluorescerande ljus. Denna effekt kan begränsas genom att hålla den fluorescens på låg effekt tills försöksledaren är redo att bilden och sedan justering av fluorescensintensiteten i enlighet därmed. När man är erfaren med användning av färgämnen annan metod är att använda konfokalmikroskopi med Z-stackar till bild bara mitokondrier i rätt vävnad; de mitokondriella nätverk i muskeln är helt olika jämfört med andra vävnader. Tyvärr, oförmåga C 32 H 32 Cl 2 N 2 O för att lämna mitokondrierna 28 innebär att till skillnad från sarcomere och mitokondriell avbildningstekniker som diskuterats ovan, kan den inte användas för att prospektivt följa förlust av mitokondriefunktionen med tiden, om inte C 32 H 32 Cl 2 N 2 Oläggs vid diskreta tidpunkter för att separera djurpopulationer. Denna begränsning kan övervinnas genom att använda färgämnen såsom JC-10 som gör lämnar mitokondrier vid kollaps av membranpotential 43. Mitokondrier kan också isoleras från C. elegans 30 för efterföljande biokemiska analyser. Sådan extraktion medger kvantifiering av mitokondriell membranpotential genom att kvantifiera graden av lipofila katjoniska färgupptagning med hjälp av flödescytometri eller en fluorescerande plattläsare 44. Efter att ha fastställt en nedsatt mitokondriell membranpotential, är det också möjligt att fastställa om förlusten av protongradient leder till en förlust av ATP-produktion med hjälp av en känslig bioluminometric luciferas baserad metod 45.
Bedöma proteinnedbrytning i C. elegans
Masken stam som används här för att bedöma muskelproteinnedbrytning var PD55, som innehåller en muskel specifikt βgalaktosidas som kontinuerligt syntetiseras under utveckling till vuxen ålder har uppnåtts, och som förblir stabila i cytosolen för nästa 72-96 tim 19. Således, mätning av β-galaktosidas nivåer under utveckling tyder främst effekterna av interventioner på syntes från myosin promotorn, medan förlusten av β-galaktosidas under vuxenlivet visar en intervention har utlöst ökat cytosoliskt proteinnedbrytning 19. Nyckelsteget vid bedömningen β-galaktosidas aktivitet är att säkerställa en effektiv uttorkning. Misslyckande med att effektivt uttorka djuren resulterar i dålig avsättning av X-gal-substratet och därför dålig blå färg i kroppsväggs musklerna i djuren. För att säkerställa god uttorkning bör kontrolleras förseglingen på torkapparaten och provet bör kontrolleras med 5-10 minuters intervall under hela uttorkning att utvärdera framstegen (dvs. provet 20 ^ borde ha torkat inom 10 min och resterande 20 minär att säkerställa omfattande uttorkning). Den β-galaktosidas-analysen är en aktivitetsanalys därför en lämplig kontroll är nödvändig. Dessutom minskade färgning av vuxna i en behandlingstillstånd i förhållande till kontroll bevisar inte att markförstöring pågår; snarare indikerar minskad enzymaktivitet som svar på behandling. För att bekräfta nedbrytning, måste mer arbetsintensiv western blot-analys vara klar mot β-galaktosidas 13 och detta tillåter kvantifiering proteinnedbrytning i små populationer av räknade maskar. Western blot bandtäthet kan kvantifieras med ImageJ 46. En annan begränsning med denna metod är att användningen av transgena proteiner inte informerar om fysiologiska mål nedbrytning och för sådana svar proteomik och / eller riktade hypotesdriven western blottar måste användas 13. Slutligen, eftersom syntesen av transgena proteiner som används i dessa studier stängs av i tidig vuxen ålder 19 </sup>, måste andra metoder användas när man önskar att undersöka förändringar i muskelproteinsyntes i fullt utvecklad C. elegans muskler; till exempel stabila och radioaktiva isotopmetoder.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a grant from the US National Institutes of Health National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (AR-054342) to NJS. CJG was funded by a Doctoral training studentship funded by the University of Nottingham. JJB was funded by an MRC Doctoral training award (J500495). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) | Invitrogen | M-7512 | Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential |
DMSO | Thermo Scientific | 67-63-5 | |
KH2 PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
Na2HPO4 | BDH | 301584L | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
MgSO4 | Sigma | M-7506 | |
Microscopy Slides | Starfrost | K220 | |
Microscopy Cover Slips | VW2 International | 631-0124 | |
1.5ml Eppendorph Tubes | Fisher Scientific | FB74031 | |
Dessicator | Nalgene | D2672 | |
Nikon Microscope | Nikon | H600L | Nikon H600L microscope with proprietary software |
Nikon Camera | Nikon | DS-Fi1 | Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera |
Zeiss Microscope | Zeiss | Ax10 | Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter |
Plates 9cm | Starstedt | 82-1473 | |
Plates 6cm | Gosselin | BP53-01 | |
Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
Na3PO4 | Sigma-Aldrich | 7601-54-9 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside | Sigma-Aldrich | 7240-90-6 | |
N,N8-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 68-12-2 | |