O músculo esquelético é essencial para a locomoção e é a principal loja de proteína dos corpos. Medidas de saúde musculares dentro de C. elegans são descritos. Mudanças potenciais na estrutura e função muscular são avaliados usando GFP localizada e corantes catiônicos.
O músculo é um tecido dinâmico que responde a mudanças na alimentação, exercício e estado de doença. A perda de massa muscular e função com a doença ea idade são encargos significativos para a saúde pública. Atualmente, entender pouco sobre a regulação genética da saúde muscular com a doença ou idade. O nemátodo C. elegans é um modelo estabelecido para a compreensão da regulação genômica dos processos biológicos de interesse. Os músculos da parede do corpo deste verme apresentar um elevado grau de homologia com os músculos de espécies de metazoários mais elevados. Desde C. elegans é um organismo transparente, a localização de GFP para mitocôndrias e sarcómeros permite a visualização de estas estruturas in vivo. Similarmente, a alimentação de animais corantes catiónicos, que se acumulam com base na existência de um potencial de membrana mitocondrial, permite a avaliação da função mitocondrial in vivo. Estes métodos, bem como a avaliação de homeosta proteína muscularsis, são combinados com avaliação da função muscular animal inteiro, sob a forma de ensaios de movimento, para permitir a correlação de defeitos sub-celulares com medidas funcionais de desempenho muscular. Assim, C. elegans fornece uma plataforma poderosa para avaliar o impacto das mutações do gene, o knockdown, e / ou compostos químicos sobre a estrutura e função musculares. Por último, como a GFP, corantes catiónicos, e ensaios de circulação são avaliadas de forma não invasiva, estudos prospectivos da estrutura e função do músculo pode ser conduzida ao longo de todo o curso da vida e, actualmente, esta não pode ser facilmente investigada in vivo em qualquer outro organismo.
O músculo é um tecido multifuncional, bem apreciado por seu papel na locomoção, sustentação postural e metabolismo. O desenvolvimento ea manutenção do músculo saudável requer a coordenação de vários processos celulares e componentes. Ou através de dano ou doença, a desregulação pode ocorrer, o que resulta na estrutura muscular alterada e / ou função. Declínio associado à idade na função muscular apresenta um encargo significativo para os orçamentos de saúde no mundo ocidental, uma vez que a massa muscular de 1,2 e, particularmente, força e resistência muscular 3-5 são negativamente correlacionados com a mortalidade. A medição de aspectos relacionados com a deterioração da função muscular, tais como a função mitocondrial alterada ou sarcômero interrupção, pode permitir uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes desenvolvimento muscular global e saúde.
Elegans C aenorhabditis (C. elegans) é uma microscópicas bes nematóidest conhecido, pois foi o primeiro organismo multicelular a ter todo o seu genoma sequenciado 6, a primeira a ter genes silenciados usando RNAi 7, eo único a ter suas metazoan toda linhagem celular 8 e 9 de neuroanatomia determinado. C. elegans foi proposto pela primeira vez como um modelo para o estudo do controle genético do comportamento em 1974 por Sydney Brenner 10 e da importância deste trabalho e posterior foi reconhecida com o primeiro dos três prêmios Nobel concedidos a C. elegans pesquisadores. Cerca de 35% dos genes de C. elegans identificaram ortólogos em seres humanos, com C. elegans ser um organismo chave usada para compreender o controle genético do desenvolvimento muscular 11. Quase todos os genes no genoma C. elegans pode ser derrubado por meio de RNAi 7,12. Assim, derrubando genes no músculo totalmente desenvolvido, componentes genéticos contribuindo para a regulamento da saúde muscular pode ser investigada com relativa simplicidade 13.
A capacidade combinada de usar RNAi, mutantes, e compostos químicos torna C. elegans um sistema premier para explorar a regulação genética 7,14,15 da estrutura e função muscular com 16 anos de idade e em modelos de doenças 17. O impacto de knockdown do gene, mutação, e / ou exposição a compostos químicos sobre a estrutura e / ou função do músculo pode ser medido através de vários aspectos. Aqui, descrevemos brevemente técnicas simples para avaliar C. elegans estrutura e função do músculo, muitos dos quais podem ser utilizados em estudos prospectivos de saúde muscular.
O desenvolvimento da proteína verde fluorescente (GFP) 18 permitiu a visualização de ambos a localização de proteínas específicas e a estrutura geral de organelos em C. elegans. Aqui explicamos como GFP expressa especicamente dentro do corpo da parede muscular mitocôndrias, núcleos, ou sarcómeros pode ser utilizado para determinar se a distrofia destas estruturas sub-celular está presente. Como a estrutura não é sempre um substituto confiável para a função, nós também explicar como o uso de corantes catiônicos in vivo permite a avaliação do potencial de membrana mitocondrial prejudicada dentro do músculo. Quando os corantes são usados em combinação com GFP, eles permitem o estudo da estrutura e funcionamento de uma forma temporal, durante toda a vida. Por último, nós também explicar como homeostase proteínas dentro do músculo pode ser avaliado e como todas essas medidas pode ser usado para correlacionar as mudanças na saúde músculo animal inteiro através da utilização de ensaios de movimento. Estas técnicas, combinadas com knockdown gene, mutações, e / ou compostos químicos proporcionam um poderoso arsenal para o estudo de como os genes ou compostos específicos influenciar a saúde do músculo in vivo. Os paralelos na estrutura, metabolismo e função do músculo bruta entre C. elegans emamíferos significa C. elegans é um organismo modelo excelente para a compreensão da regulação do músculo em organismos superiores, incluindo os seres humanos.
Estes métodos permitem a exploração do músculo do macrophysiology de movimento para identificação de defeitos subcelulares que são suficientes para causar um defeito movimento. Quando combinados estes métodos permitem a análise detalhada do músculo. O conhecimento adquirido permite que mais testes de hipóteses orientada para o músculo que pertencem a fisiologia geral, fisiopatologia e envelhecimento.
Movimento Ensaios
Um defeito movimento indica uma perturbação da função neuromuscular normal. Isto pode ser específico para nervos ou músculos ou que pode ser comum entre os vários tecidos. As fases mais difíceis de completar ensaios movimento está selecionando vermes que são representativas da população e / ou o tratamento, e também garantir que o experimentador não ferir o animal em cima de transferência para M9. É importante ter um tamanho de amostra grande para se obter uma avaliação representativa e precisa do movimento. Quando o ensaio altamente canetaefeitos etrant, por exemplo, como freqüentemente visto em mutantes, uma amostra de dez animais cada avaliado para o movimento dez vezes é suficiente para encontrar diferenças estatisticamente significativas contra o tipo selvagem. No entanto, a simplicidade dos ensaios de circulação e facilidade de cultura de C. elegans significa que centenas de vermes podem ser rapidamente avaliado, a fim de garantir resultados quantitativamente robustos. Ao ensaiar os efeitos que aparecem presente em apenas uma parte de uma população que é importante para determinar qual a proporção da população parece ser afectada, bem como a gravidade dos defeitos nos animais mais afectados. Em tais situações, um maior número de animais deve ser avaliada, a fim de fornecer os dados mínimos para a proporção da população afetada. Frequentemente tanto de drogas e tratamentos de RNAi irá produzir defeitos graves movimento em uma pequena proporção da população. Em alguns casos, o aumento da dose do tratamento e ou o método de entrega irá aumentar a proporção de affected animais e curvas de resposta de dose de corrida pode ser útil para determinar a concentração óptima de um fármaco ou de RNAi. Uma segunda limitação de movimento neste ensaio é que os vermes são manipuladas para avaliar o movimento. Assim, os vermes são ambas estimuladas e submetido a algum grau de stress osmótico quando apanhado em líquido. O grau de stress osmótico pode ser limitada por meio M9 ou BU tampão 19, em oposição à água. Algumas dessas limitações são atenuadas medindo movimento habitual em placas utilizando sistemas de rastreamento disponíveis no mercado 34 ou plug-ins gratuitos para ImageJ 35. Medir a taxa de movimento de um animal pode fornecer informações importantes sobre a saúde geral do músculo, incluindo alterações na função que podem ser medidos ao longo da vida ea não-invasivo deste método é fundamental para futuros estudos da função muscular ao longo da vida.
Imagens do aparato contrátil
<p class = "jove_content"> A tensão verme usado aqui para estrutura aparato contrátil imagem foi PJ727 36 que expressa uma proteína de fusão GFP miosina que está localizada a sarcômeros dentro dos músculos da parede do corpo. O uso deste esforço permite a visualização da estrutura do sarcômero em animais vivos. Semelhante ao ensaio de movimento descrito acima, uma das principais vantagens da utilização de GFP marcada sarcómeros para avaliar estrutura sarcómero é que o método é relativamente não-invasiva e, portanto, pode ser usado para seguir prospectivamente estrutura sarcómero em animais individuais ao longo do tempo de vida. A maior dificuldade com este método é que os vermes que está sendo fotografada ainda estão vivos e, portanto, em movimento, o que torna difícil obter imagens bem focadas. Vários métodos podem ser empregues para reduzir o movimento e fazer imagiologia mais simples; estes incluem anestesiar ou paralisar os vermes e imobilização através de pressão, sucção, ou o uso de uma solução de alta viscosidade. Cada um destes métodos de immobilizção tem a desvantagem de que ele pode-se alterar a função neuromuscular. Portanto, é essencial incluir controlos não tratados na análise apropriados. Também pode ser prudente utilizar, pelo menos, dois métodos independentes de imobilização para confirmar os resultados não são devido a problemas com o método de imobilização, dependendo de como amplamente utilizado o método de imobilização é escolhido para a questão em estudo. Aqui nós usamos simples pressão da lamela sobre o worm para induzir movimento reduzida. Depois de colocar a lamela, o líquido sob a lamela irá evaporar ea lamela, consequentemente, começar a produzir mais pressão sobre os vermes, normalmente isso leva 2-5 min para produzir o suficiente movimento reduzido para permitir a fácil criação de imagens.É essencial para monitorar estreitamente os vermes após a lamela foi introduzida como a pressão irá, eventualmente, aumentar o suficiente para fazer com que os vermes para rebentar a partir de uma pressão excessiva, tipicamente 10-15 minutos após a coAlém verslip. Tampão adicional pode ser introduzido com o auxílio de uma pipeta de ponta em torno das bordas da lamela para evitar lesão por esmagamento para os vermes. Verniz de unhas pode ser usado para selar as arestas da lamela de cobertura e impedir a evaporação, embora isto evita a recuperação de animais de sob a lamela de cobertura, se desejado. Da mesma forma, a utilização de grânulos de silicone na solução pode ajudar a reduzir a quantidade de pressão que os locais de lamelas sobre os vermes.
Assim como com a avaliação de movimento de um defeito, é importante considerar a penetrância do efeito. Penetrância pode ser considerado alto se 80-100% dos animais apresentam um fenótipo na placa NGM, parcial se 21-79% e de baixo se ≤20% do visor população um afeto. Para efeitos altamente penetrantes, tamanhos de amostra menores podem ser usados para produzir dados quantitativos significativos sobre defeitos sarcômero. Nos casos em que o efeito tem uma penetrância baixa, selecção de animais que exibem um defeito claro movimento em resposta a drogaou tratamento de RNAi pode ser útil no ensaio de defeitos sarcômero na maioria dos animais afectados pelo tratamento. No entanto, não é necessariamente o caso em que a extensão do efeito do tratamento em circulação e da estrutura subcelular é o mesmo. Assim, pode ser desejável para examinar a extensão dos defeitos presentes numa grande população, por exemplo, 100 animais. Isto permite a compreensão da distribuição de defeitos ao longo de uma população. Também pode ser desejável para examinar a extensão do defeito nos animais mais severamente afectados e / ou examinar a correlação entre a extensão da defeito sarcómero e extensão de defeito movimento. As dificuldades potenciais de lado, este método é mais rápido e mais fácil do que outros métodos de avaliação da estrutura do sarcômero. Esta velocidade e facilidade, no entanto, sujeita a uma limitação fundamental, sarcômeros contêm proteínas de fusão GFP não são inteiramente normal 37 e, portanto, a avaliação de sarcômeros interrompido deve ser confirmado utilizando métodos mais intensivos em trabalho adicionais.Estes métodos incluem o uso de luz polarizada 38, phalloidin coloração 39 e 40 de imunofluorescência indireta. Destes métodos, apenas a luz polarizada é relativamente não invasiva; os outros métodos requerem fixação e, por conseguinte, não pode ser utilizado em estudos prospectivos de animais individuais, e elas só podem ser usadas para confirmar, atravessar seccionalmente, os resultados de tais estudos.
Imagens de mitocondriais Networks
A estirpe sem-fim utilizado para as experiências de imagiologia mitocondriais foi CB5600 7 que expressa uma proteína de fusão de GFP localizada na mitocôndria e uma GFP β-galactosidase proteína de fusão localizada para os núcleos, tanto nos músculos da parede do corpo. Tal como acontece com o uso de PJ727 para sarcômeros de imagem, o uso desta estirpe permite a visualização da estrutura de rede mitocondrial em animais vivos. Assim, esta estirpe pode ser utilizada para avaliar alterações dinâmicas que ocorrem, por exemplo, reduzida mitochondrial fusão e / ou aumento de fissão mitocondrial 41. Além disso, como para sarcômeros de imagem, a maior dificuldade com este método é que os vermes sendo fotografada ainda estão vivas e em movimento, o que torna difícil obter imagens bem focadas. Embora vários métodos, como discutido em maior detalhe acima, pode ser empregue para reduzir o movimento, as mitocôndrias parecem ser particularmente sensíveis a intervenções que induzem a circulação reduzida. Por exemplo, o mais geralmente usado anestésicos componentes alvo da cadeia respiratória mitocondrial e são, por conseguinte, deve ser utilizada com precaução em estudos de estrutura normal e função mitocondrial. Do mesmo modo, a maioria dos agentes paralisantes deve ser utilizada com precaução em estudos de estrutura normal e função mitocondrial, tal como a maioria dos agentes paralisantes causar menos sinal para passar através da junção neuromuscular e desnervação funcional do músculo é suficiente para induzir a fragmentação mitocondrial. Os experimentos deste estudo utilizou pressão para imobilizar animaiss, mas outros têm usado com sucesso levamisol 42, embora seja essencial para os animais imagem imediatamente.
Por último, vários contaminantes bacterianos em culturas, por exemplo B. subtilis, pode induzir a fragmentação mitocondrial; Por conseguinte, é essencial incluir controlos não tratados na análise apropriados. Para efeitos altamente penetrantes, tamanhos de amostras menores podem ser utilizados para produzir os dados quantitativos sobre os defeitos significativos de rede mitocondriais. No entanto, devido à prevalência de pequenos defeitos na rede mitocondrial, este pequeno número de animais é provável que seja o dobro do número necessário para a avaliação da estrutura sarcómero. Nos casos em que o efeito tem uma penetrância baixa, a selecção de animais que apresentam claramente um defeito de movimento em resposta a tratamento medicamentoso ou ARNi podem ser úteis no ensaio de defeitos mitocondriais na maioria dos animais afectados pelo tratamento. No entanto, como mencionado acima, não é necessariamente o caso em que omedida do efeito do tratamento em circulação e da estrutura subcelular é o mesmo. Assim, pode ser desejável para examinar a extensão dos defeitos presentes numa grande população, por exemplo 150-200 animais, bem como a extensão da perturbação nos animais mais severamente afectados e da presença ou ausência de extensão da perturbação com a extensão da defeito movimento. Outras estirpes com mitocôndrias marcado por fluorescência pode ser utilizada para confirmar os resultados obtidos em CB5600, contudo, o uso de diferentes proteínas fluorescentes podem influenciar a rede de linha de base das mitocôndrias. Por exemplo, a utilização de uma proteína RFP TOMM-20 de fusão de visualizar as mitocôndrias parece provocar um aumento de fragmentação mitocondrial da linha de base versus a utilização de GFP localizada 17 para as mitocôndrias. Enquanto outros métodos tais como microscopia electrónica de imunofluorescência e pode ser utilizado para avaliar a estrutura mitocondrial, eles não permitem a avaliação in vivo da dinâmica mitocondrial, porque um passo de fixação é exigird. Outros métodos, tais como a utilização de corantes para as mitocôndrias localizadas podem ser utilizados sem fixação e, por conseguinte, também pode ser usado no lugar de utilização de GFP localizada para as mitocôndrias. Como discutido na próxima seção, o uso de tais corantes também permite a avaliação in vivo bruto da função mitocondrial.
Avaliando Membrana Mitocondrial Potencial In Vivo em C. elegans
Uma variedade de corantes estão disponíveis para rotulagem mitocôndrias 28. Esses corantes proporcionam um método alternativo de visualização estrutura de rede mitocondrial em C. elegans vivos. Muitos destes corantes também permitir a avaliação em bruto de funcionalidade mitocondrial in vivo, porque eles se acumulam na mitocôndria com base no potencial de membrana mitocondrial. Aqui nós usamos C 32 H 32 Cl 2 N 2 O que é ingerido através deo tracto digestivo, com alguns adicionalmente entrar no sem-fim através da cutícula por causa da permeabilização proporcionada por ser dissolvido em 0,5% de DMSO. Após a entrada na célula C 32 H 32 Cl 2 N 2 O está oxidado e sequestrado pelas mitocôndrias, onde se liga aminoácidos contendo enxofre (por exemplo, metionina e cisteína). A formação destes complexos de corante-péptido significa C 32 H 32 Cl 2 N 2 O permanece nas mitocôndrias, uma vez marcados 28. Uma dificuldade fundamental com a utilização de corantes mitocondriais é que eles vão rotular todas as mitocôndrias no animal. Por isso temos realizado rotulagem em CB5600, da mesma estirpe acima descrita para avaliação do músculo estrutura de rede mitocondrial. Usando um corante vermelho mitocondrial, uma estirpe de vermes que expressam GFP em mitocôndrias do músculo, e um filtro de passagem de tripla, que é relativamente simples para a imagem apenas mitocôndrias no músculo, encontrando mitocôndrias que são Ogama de co-localização de corante vermelho e mitocôndrias GFP rotulados. O passo mais difícil na realização desta abordagem é co-localização de imagem porque o corante é em segundos sob luz fluorescente de alta intensidade-branqueada foto. Este efeito pode ser limitada, mantendo a fluorescência de baixa potência até que o experimentador está pronto para a imagem e, em seguida, ajustando a intensidade de fluorescência em conformidade. Uma vez que se tem experiência com o uso de corantes outra abordagem é utilizar microscopia confocal com Z-stacks a imagem apenas mitocôndrias no tecido direito; as redes mitocondriais no músculo são bastante distintos em comparação com outros tecidos. Infelizmente, a incapacidade de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O para deixar mitocôndrias 28 significa que, ao contrário das técnicas de sarcômero e imagiologia mitocondrial discutido acima, não pode ser usado para seguir prospectivamente perda da função mitocondrial com o tempo, a menos que C 32 H 32 Cl 2 N 2 Oé adicionado em pontos de tempo discretos para separar populações de animais. Esta limitação pode ser ultrapassada pela utilização de corantes, tais como JC-10 que faz sair a mitocôndria após colapso do potencial 43 de membrana. As mitocôndrias também pode ser isolado a partir de C. elegans 30 para análises bioquímicas subseqüentes. Tal extracção permite a quantificação do potencial de membrana mitocondrial por quantificação da taxa de absorção do corante catiónico lipofílico utilizando citometria de fluxo ou um leitor de placa fluorescente 44. Tendo estabelecido um potencial de membrana mitocondrial prejudicada, também é possível determinar se a perda de gradiente de protões traduz-se numa perda de produção de ATP, utilizando um método à base de luciferase bioluminometric 45 sensível.
Avaliando a degradação de proteínas em C. elegans
A cepa verme usada aqui para avaliar a degradação da proteína muscular foi PD55, que contém uma β específica muscular-galactosidase, que é continuamente ao longo do desenvolvimento sintetizados até à idade adulta é atingido e que permanece estável no citosol para o próximo 72-96 hr 19. Assim, a medição dos níveis de β-galactosidase durante o desenvolvimento predominantemente indica o impacto das intervenções sobre a síntese do promotor miosina enquanto que a perda de β-galactosidase durante a idade adulta indica uma intervenção provocou aumento da degradação da proteína citosólica 19. O passo chave na avaliação da actividade β-galactosidase é eficaz para assegurar a dessecação. Falha eficazmente para desidratar os animais resulta em mau disposição do substrato X-gal e, portanto, pobres cor azul nos músculos da parede do corpo dos animais. Para garantir uma boa dessecação o selo do secador deve ser verificado e, a amostra deve ser verificado em 10/05 minutos de intervalo durante todo dessecação para avaliar o progresso (ou seja, a amostra de 20 l deveria ter secado dentro de 10 minutos e os restantes 20 miné assegurar a dessecação abrangente). O ensaio de β-galactosidase é um ensaio de actividade, por conseguinte, um controlo apropriado é essencial. Além disso, a coloração diminuiu de adultos em uma condição de tratamento relativamente ao controlo não prova de que está a ocorrer a degradação; pelo contrário, indica diminuição da actividade enzimática em resposta ao tratamento. Para confirmar a degradação, mais western blot de trabalho intensivo deve ser concluída contra β-galactosidase 13 e isso permite a degradação de proteínas quantificação em pequenas populações de vermes contados. Densidades banda Western blot pode ser quantificado usando ImageJ 46. Uma outra limitação deste método é que o uso de proteínas transgénicas não informar como alvos para fisiológicas de degradação e para tais respostas hipótese impulsionado western blots proteomic e / ou orientadas devem ser empregues 13. Por último, como a síntese da proteína transgénica utilizada nestes estudos é desligado no início da idade adulta 19 </sup>, outros métodos deve ser utilizado quando se deseja analisar alterações na síntese de proteínas do músculo totalmente desenvolvida em C. elegans muscular; por exemplo, métodos de isótopos estáveis ou radioativos.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a grant from the US National Institutes of Health National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (AR-054342) to NJS. CJG was funded by a Doctoral training studentship funded by the University of Nottingham. JJB was funded by an MRC Doctoral training award (J500495). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) | Invitrogen | M-7512 | Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential |
DMSO | Thermo Scientific | 67-63-5 | |
KH2 PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
Na2HPO4 | BDH | 301584L | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
MgSO4 | Sigma | M-7506 | |
Microscopy Slides | Starfrost | K220 | |
Microscopy Cover Slips | VW2 International | 631-0124 | |
1.5ml Eppendorph Tubes | Fisher Scientific | FB74031 | |
Dessicator | Nalgene | D2672 | |
Nikon Microscope | Nikon | H600L | Nikon H600L microscope with proprietary software |
Nikon Camera | Nikon | DS-Fi1 | Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera |
Zeiss Microscope | Zeiss | Ax10 | Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter |
Plates 9cm | Starstedt | 82-1473 | |
Plates 6cm | Gosselin | BP53-01 | |
Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
Na3PO4 | Sigma-Aldrich | 7601-54-9 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside | Sigma-Aldrich | 7240-90-6 | |
N,N8-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 68-12-2 | |