骨格筋は歩行のために不可欠であり、団体「メインタンパク質店です。 C.エレガンス内の筋肉の健康の測定について説明する。筋肉の構造と機能の将来の変更は、ローカライズされたGFPおよびカチオン染料を使用して評価される。
筋肉は栄養、運動、および疾患状態の変化に応答する動的な組織である。病気や加齢に伴う筋肉量および機能の喪失は、重大な公衆衛生上の負担です。我々は現在、病気や加齢に伴う筋肉の健康の遺伝的調節についてはほとんど理解しています。線虫C.エレガンスは、関心のある生物学的プロセスのゲノム調節を理解するための確立されたモデルである。このワームの体壁の筋肉は、より高い後生動物種の筋肉との相同性の程度が大きい表示。 C.エレガンスは 、透明有機体であるため、ミトコンドリアおよびサルコメアのGFPの局在は、in vivoでのこれらの構造の可視化を可能にする。同様に、動物のミトコンドリア膜電位の有無に基づいて、蓄積するカチオン染料を送り、in vivoでのミトコンドリア機能の評価を可能にする。筋肉タンパク質homeostaこれらの方法、ならびに評価sisの、筋肉の性能の機能的尺度を持つ細胞内の欠陥の相関を可能にするために、移動アッセイの形式で、全動物の筋肉機能の評価と組み合わされる。したがって、C.エレガンスは、筋肉の構造と機能に、変異の影響を評価するための強力なプラットフォームを提供し、遺伝子ノックダウン、および/ または化学的化合物である。最後に、GFP、カチオン染料、および移動アッセイとして評価されている非侵襲的に、筋肉の構造および機能の前向き研究は、全ライフコース全体で行うことができ、現在では、これは容易に他の生物においてインビボで調査することができない。
筋肉はよく歩行、姿勢サポートや代謝におけるその役割のために認め多機能組織である。健全な筋肉の開発と保守には、複数の細胞プロセスとコンポーネントの調整を必要とします。どちら損傷または疾患を通じて、調節不全は、変更された筋肉構造および/または機能で、その結果、発生する可能性があります。筋機能における加齢に伴う筋肉量の減少1,2、特に筋力と持久3-5は負の死亡率と相関していることから、西側世界におけるヘルスケア予算に大きな負担を提示します。そのような改変されたミトコンドリア機能またはサルコメア混乱などの筋機能の悪化に関連した側面の測定は、全体的な筋肉の発達と健康を支えるメカニズムのより深い理解を可能にすることができる。
C aenorhabditis虫(C.エレガンス )微視的線虫BESですそれは、その全ゲノムを持つ最初の多細胞生物は、6の配列を決定したRNAi 7を使用して沈黙する遺伝子を持って最初の、そしてその全体の細胞系譜8および神経解剖学9に決定。 線虫を持っている唯一の後生動物が最初として提案されただったので知らトンシドニー·ブレナー10と、このことの重要性とそれに続く作品による1974年の行動の遺伝的制御の研究のためのモデルは、 線虫の研究者に授与さ3ノーベル賞の最初に認識された。 C.の約35%が、遺伝子がC.エレガンスは、筋肉の発達11の遺伝子制御を理解するために使用されるキーである生物を、ヒトにおいてオルソログを同定したエレガンス 。ほとんどのC. elegansのゲノムにおける全ての遺伝子は、RNAi 7,12を通じてノックダウンすることができます。このように、完全に開発筋肉中の遺伝子をノックダウンすることにより、遺伝的コンポーネントは再に貢献筋肉の健康のgulationは相対的なシンプルさ13を用いて調査することができます。
組み合わせたRNAiを使用する能力、変異体、および化学化合物がCで 16歳と疾患モデルにおける17の筋肉の構造と機能の遺伝的調節7,14,15を探索するのに最高のシステムを虫になります。遺伝子ノックダウン、突然変異、および/または筋肉の構造および/または機能に対する化学物質への暴露の影響は、複数の側面を介して測定することができる。ここでは、簡単に筋肉の健康の前向き研究において使用され得る多くはC. elegansの筋肉の構造および機能を評価するための簡単な技術を記載している。
緑色蛍光タンパク質(GFP)18の開発は、特定のタンパク質の局所性およびC.エレガンスにおける細胞小器官の一般的な構造の両方の可視化を可能にした。ここでは、GFPがspeciを表明方法について説明しますこれらのサブ細胞構造のジストロフィーが存在する場合fically体壁筋のミトコンドリア、核、またはサルコメア内で決定することができる。構造が常に機能するための信頼できるサロゲートはないので、我々はまた、in vivoでのカチオン染料の使用は、筋肉内の障害のあるミトコンドリア膜電位の評価を可能にする方法を説明します。染料がGFPと組み合わせて使用される場合、それらは、寿命全体を通じて、時間的な方法でアーキテクチャおよび機能の研究を可能にする。最後に、我々はまた、これらの手段の全ての移動アッセイの使用を介して、全動物の筋肉の健康の変化を相関させるために使用することができるか、筋肉内のタンパク質恒常性を評価することができると方法について説明します。遺伝子ノックダウン、突然変異、および/ または化学的化合物と組み合わせたこれらの技術は、特定の遺伝子または化合物がインビボでの筋肉の健康にどのように影響するかを研究するための強力な武器を提供する。 C. elegansのと間の構造、代謝と筋肉の総機能の類似点哺乳類は、線虫を意味するヒトを含む高等生物、筋肉の調節を理解するための、優れたモデル生物である。
これらの方法は、運動欠陥を生じさせるのに十分である細胞内の欠陥を特定する移動macrophysiologyから筋肉の探査を可能にする。組み合わせると、これらの方法は、筋肉の詳細な分析を可能にする。洞察力は、一般的な生理学、病態生理学、老化に関係する筋肉指向の仮説の更なるテストを行うことができました。
運動アッセイ
運動欠陥が正常な神経筋機能の破壊を示している。これは、神経または筋肉に特異的であってもよいし、いくつかの組織との間で共通であってもよい。完成運動アッセイの最も困難な段階は、人口および/または治療の代表的なものであるワームを選択し、また、実験者はM9への転送の際に動物を傷つけるていないことを保証されている。それは、運動の代表的かつ正確な評価を得るために大きなサンプルサイズを有することが重要である。高度にペンを検定するときetrant効果は、頻繁に見られる変異体で、例えば、移動のための10回評価した10匹のサンプルサイズは、野生型に対して統計的に有意な違いを見つけるのに十分である。しかし、移動アッセイおよびC.エレガンスの培養の容易さの単純ワーム数百迅速定量ロバストな結果を保証するために評価することができることを意味する。人口の一部のみに存在現れる効果を検定するとき、それは最も影響を受けた動物での欠陥の重症度だけでなく、影響を受けたように思われる人口の割合はどのように決定することが重要である。そのような状況では、動物のより多くの影響を受ける人口の割合のための最小限のデータを提供するために評価されるべきである。しばしば、薬物およびRNAi治療の両方が、人口の少ない割合で深刻な運動欠陥を生成する。場合によっては、治療の用量を増加させ、または送達の方法は、AFFの割合を増加させる精製カートリッジ動物および用量反応曲線を実行して、薬物またはRNAiの最適濃度を決定するのに有用であり得る。この移動アッセイの第二の制限は、ワームが運動を評価するために操作されることである。したがって、ワームの両方で刺激し、液体中に取り上げたとき、浸透圧ストレス、ある程度のに供される。水とは対照的に、浸透圧ストレスの度合いは、M9またはBUバッファ19を使用することによって制限することができる。これらの制限のいくつかは、ImageJの35のために、市販の追跡システム34またはフリーのプラグインを使用して、プレート上に習慣的な運動を測定することによって緩和される。動物の移動速度を測定することは、寿命全体にわたって測定することができる機能の変化及びこの方法の非侵襲性の筋機能の将来の生涯の研究のための鍵であるなど、全体的な筋肉の健康状態に関する重要な情報を提供することができる。
収縮装置のイメージング
<Pクラス= "jove_content">画像収縮装置の構造に、ここで使用されるワームの株は体壁の筋肉内サルコメアに局在しているミオシンGFP融合タンパク質を発現するPJ727 36だった。この株の使用は、生きた動物でサルコメア構造の可視化を可能にします。上述の移動アッセイと同様に、サルコメア構造を評価するために、GFP標識した筋節を使用することの主な利点は、この方法は、比較的非侵襲性であり、したがって、前向きに生涯を通じて個々の動物における筋節構造に従うために使用することができることである。この方法の最大の困難は、それが困難な、よく焦点画像を取得することができ、これ撮像されているワームはまだ生きているので、移動しているということです。いくつかの方法が動きを低減し、より簡単な画像化するために使用することができる。これらは、圧力、吸引、または高粘度溶液を使用することにより、ワームや固定麻酔または麻痺が含まれる。 immobilizのこれらの方法の各々ationが、それ自体が神経筋機能を変えることができるという欠点を有する。したがって、分析に適切な未処理の対照を含むことが必須である。また、結果は広く選択された固定化方法は、調査中の問題のためである使用方法に依存して、固定化方法の問題によるものではない確認するために、固定化のうちの少なくとも2つの独立した方法を利用することが賢明であろう。ここでは、減少した運動を誘導するためにワームにカバースリップから簡単な圧力を使用している。カバーガラスを配置した後、カバースリップの下に液体が蒸発すると、カバースリップは、結果的に一般的に、これは容易なイメージングを可能にするために十分な縮小の動きを生成するために2-5分かかり、ワームの際に多くの圧力を生成し始めます。なお、共後10〜15分、典型的には、圧力が最終的にワームが過度の圧力から破裂させるのに十分に増加させるようにカバースリップを導入した後に密接にワームを監視することが不可欠であるさらにverslip。追加バッファは、ワームに挫滅損傷を避けるために、カバースリップのエッジの周りピペットチップを用いて導入することができる。所望であれば、これは、カバースリップの下からの動物の取得を防止するが、マニキュアは、カバースリップの端をシールして蒸発を防ぐために使用することができる。同様に、溶液中のシリコーンビーズの使用は、ワームにカバースリップの場所圧力の量を減らすことができます。
ちょうど運動欠陥を評価と同様に、効果の浸透度を考慮することが重要である。人口ディスプレイの≤20%が影響を与える場合に80〜100%の動物が、百分の21から79までであれば、低部分、NGMプレート上の表現型を示す場合には浸透度が高いと考えることができる。浸透率の高い効果のために、小さなサンプルサイズは、サルコメア欠陥に重大な定量的データを生成するために使用され得る。効果が低い浸透度を有する場合、薬剤に反応して明確な運動欠陥を表示する動物の選択においてまたはRNAi治療は、ほとんどの治療の影響を受けた動物において筋節の欠陥をアッセイするのに有用であり得る。しかし、移動および細胞内構造に対する治療効果の程度が同じであることは必ずしも当てはまらない。従って、例えば、100動物大集団に存在する欠陥の程度を調べることが望ましい場合がある。これは、人口全体に欠陥の分布の理解を可能にします。また、最も深刻な影響を受けた動物では欠陥の程度を調べるため、および/またはサルコメア欠陥の程度および運動欠陥の程度との相関を調べることが望ましい場合がある。脇には困難、この方法は、サルコメア構造を評価する他の方法よりも迅速かつ容易である。この速度と使いやすさは、しかし、重要な制限が適用され、破壊されたサルコメアのGFP融合タンパク質を含有する筋節は完全に正常ではないので、37の評価は、追加の、より労働集約的な方法を用いて確認されるべきである。これらのメソッドは、39を染色ファロイジン偏光38の使用、および間接免疫蛍光40が含まれています。これらの方法のうち、偏光のみでは比較的非侵襲的である。他の方法は、固定を必要とし、したがって、個々の動物の前向き研究で使用することはできず、むしろ、それらは、そのような研究の結果を確認する断面と交差するために使用することができる。
ミトコンドリアネットワークスのイメージング
ミトコンドリアのイメージング実験のために使用ウォーム株は、体壁の筋肉の両方において、ミトコンドリアおよび核に局在化GFPβガラクトシダーゼ融合タンパク質に局在GFP融合タンパク質を発現するCB5600 7であった。イメージングサルコメアためPJ727の使用と同様に、この株の使用は、生きている動物におけるミトコンドリアのネットワーク構造の視覚化を可能にする。したがって、この菌株は、例えば減少mitochoために、発生する動的な変化を評価するために使用することができndrial融合および/ または増加したミトコンドリアの分裂41。また、撮像サルコメアに関しては、この方法の最大の難点は、それが困難なだけでなく、合焦画像を取得すること、画像化されるワームがまだ生きて動いているということである。いくつかの方法は、上記でより詳細に論じるように、運動を減少させるために用いることができるが、ミトコンドリアは、縮小の動きを誘導介入に特に敏感で現れる。例えば、最も一般的には、ミトコンドリア呼吸鎖の麻酔薬の標的成分を使用し、したがって、正常なミトコンドリアの構造および機能の研究において、慎重に使用しなければならないれている。ほとんど麻痺エージェントが神経筋接合部や筋肉の機能的除神経を通過するより少ない信号がミトコンドリアの断片化を誘導するのに十分である原因と同様に、ほとんど麻痺剤には、正常なミトコンドリアの構造と機能の研究に注意して使用する必要があります。本研究における実験は、動物を固定する圧力を採用それはすぐに画像の動物に不可欠ですが、Sが、他は正常に、レバミゾール42を使用している。
最後に、培養物中の種々の細菌の汚染物質は、例えば、 枯草菌(B. subtilis)のため、ミトコンドリアの断片化を誘導することができる。従って、分析に適切な未処理の対照を含むことが必須である。浸透率の高い効果のために、小さなサンプルサイズは、ミトコンドリアのネットワークの欠陥に大きな定量的データを生成するために使用され得る。しかし、ミトコンドリアのネットワークの軽微な欠陥の有病率に起因して、動物のこの少数のサルコメア構造の評価のために必要とされる数が2倍になる可能性が高い。効果は低い浸透度を有する場合には、明らかに、薬剤またはRNAi治療に応答して運動欠損を示した動物の選択は、ほとんどの治療の影響を受けた動物におけるミトコンドリアの欠陥をアッセイするのに有用であり得る。しかしながら、上述したように、必ずしもそうではない運動および細胞内構造に対する治療効果の程度は同じである。したがって、例えば、150~200動物、ならびに最も深刻な影響を受けた動物での混乱の程度および程度と破壊の程度の有無を大集団に存在する欠陥の程度を調べることが望ましい場合がある運動欠陥。蛍光標識されたミトコンドリアを有する他の株はCB5600で得られた結果を確認するために使用することができるが、異なる蛍光タンパク質の使用は、ミトコンドリアのベースラインネットワークに影響を与えることができる。例えば、ミトコンドリアを可視化するTOMM-20 RFP融合タンパク質の使用は、ミトコンドリアに局在し、GFP 17の使用に対する増加ベースラインミトコンドリアの断片化を引き起こす原因であると思われる。そのような免疫蛍光および電子顕微鏡などの他の方法は、ミトコンドリアの構造を評価するために使用することができるが、固定工程が必要とされているので、それらは、ミトコンドリア動力学のin vivo評価を許可しないD。このようなミトコンドリア局在する色素の使用などの他の方法は、固定せずに使用することができ、従って、ミトコンドリア局在するGFPの使用の代わりに使用することができる。次のセクションで説明したように、このような色素の使用はまた、インビボでミトコンドリア機能の粗評価を可能にする。
線虫の生体内でミトコンドリア膜電位を評価する
染料の様々なミトコンドリア28を標識するための利用可能です。これらの色素は、生きた線虫ミトコンドリアネットワーク構造を視覚化する別の方法を提供する。これらは、ミトコンドリア膜電位に基づいて、ミトコンドリアに蓄積するので、これらの色素の多くは、in vivoでのミトコンドリア機能の粗評価を可能にする。ここでは、通って摂取されるC 32 H 32 Cl 2の N 2 Oを使用していたいくつかの追加的理由0.5%DMSOに溶解して得た透過性のクチクラを介してワームに入ると消化管。セルC 32に次のエントリH 32 Cl 2の N 2 Oは、それがアミノ酸( 例えば 、メチオニンおよびシステイン)を含む硫黄と結合するミトコンドリアによって酸化され、隔離される。これらの色素-ペプチド複合体の形成は、C 32 H 32 Cl 2の N 2 Oは、一度28をラベルミトコンドリア内に残っていることを意味します。ミトコンドリア染料の使用でキー難点は、それらが動物のすべてのミトコンドリアを標識することである。そこで我々はCB5600、筋肉ミトコンドリアネットワーク構造を評価するために、上記と同じ株で、標識を行った。赤ミトコンドリア染料、筋肉ミトコンドリアでGFPを発現しているワームの株、トリプルパスフィルターを用いることにより、Oであり、ミトコンドリアを見つけることによって、筋肉内の画像のみミトコンドリアに比較的簡単である赤色染料とGFPラベルミトコンドリアの共局在によって範囲。色素は光退色高輝度蛍光灯の下で数秒以内であるため、この共局在のアプローチを実行する際に最も困難なステップがイメージングである。この効果は、実験者は、画像の準備ができるまで低電力での蛍光を保持し、それに応じて蛍光強度を調整することによって制限することができる。一つは色素の使用経験されると、別のアプローチは、右組織の画像のみミトコンドリアへのZ-スタックとの共焦点顕微鏡法を利用することである。筋肉中のミトコンドリアのネットワークは、他の組織に比べてかなり異なっている。残念ながら、ミトコンドリア28を残すC 32 H 32 Cl 2を N 2 Oのできないことはない限り、C 32 H 32上述サルコメアとミトコンドリアのイメージング技術とは異なり、それは、将来に向かって時間とともにミトコンドリア機能の喪失を追跡するために使用することができないことを意味Cl 2をN 2 O動物集団を分離するために、離散時間点で加えられる。この制限は、膜電位43の崩壊の際にミトコンドリアを残すないようJC-10などの染料を使用することによって克服することができる。ミトコンドリアはまた、C.から単離することができるその後の生化学的解析のためのエレガンス 30。このような抽出は、フローサイトメトリーまたは蛍光プレートリーダー44を使用して、親油性カチオン性色素の取り込みの割合を定量することにより、ミトコンドリア膜電位の定量化を可能にする。損なわれたミトコンドリア膜電位を確立し、それがプロトン勾配の損失が敏感な生物発光ルシフェラーゼベースの方法45を用いて、ATP産生の喪失につながるかどうかを判断することも可能である。
Cでタンパク質分解を評価するエレガンス
筋肉タンパク質分解を評価するためにここで使用されるウォーム株は、筋特異的βが含まPD55であった成人期に達すると、次の72〜96時間19用サイトゾル中に安定したままであるまで、そのガラクトシダーゼ連続発生を通して合成される。成人期のβガラクトシダーゼの損失は介入が増加し、細胞質ゾルのタンパク質分解19をトリガしたことを示し、一方、このように、開発中のβガラクトシダーゼレベルの測定は、主にミオシンプロモーターからの合成に及ぼす介入の影響を示している。 βガラクトシダーゼ活性を評価する上で重要なステップは、効果的な乾燥を確実にすることである。効果的に動物の体壁筋におけるX-gal基質ので、貧しい青色の貧弱な提供に動物の結果を乾燥させるに失敗しました。デシケーター上のシールがチェックする必要があり、サンプルが進捗状況を評価するために乾燥を通して5〜10分間隔でチェックする必要があり、良好な乾燥を確実にするために( すなわち 、20μlのサンプルを10分、残りの20分以内に乾燥している必要があります)総合的な乾燥を確保することである。 βガラクトシダーゼアッセイは、活性アッセイは、したがって、適切な制御が不可欠である。また、劣化が生じていることを証明しない対照と処理条件の相対的な成人の染色を減少した。むしろそれは、治療に応答して減少した酵素活性を示す。分解を確認するために、より労働集約的ウェスタンブロット分析は、βガラクトシダーゼ13に完了する必要があり、これはカウントワームの小集団において定量タンパク質分解を可能にする。ウエスタンブロットのバンド密度をImageJの46を使用して定量することができる。この方法の別の制限は、トランスジェニックタンパク質の使用は、劣化の生理的ターゲットへとしておよびプロテオミクスおよび/ または標的仮説駆動型ウェスタンブロットは、13を使用しなければならないような答えを通知しないということです。最後に、これらの研究で用いたトランスジェニックタンパク質の合成のような成人早期19で遮断する</su完全に発達C. elegansの筋肉の筋肉タンパク質合成の変化を調べることを希望する場合はP>は、他の方法を利用しなければならない。例えば、安定したまたは放射性同位方法。
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a grant from the US National Institutes of Health National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (AR-054342) to NJS. CJG was funded by a Doctoral training studentship funded by the University of Nottingham. JJB was funded by an MRC Doctoral training award (J500495). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) | Invitrogen | M-7512 | Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential |
DMSO | Thermo Scientific | 67-63-5 | |
KH2 PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
Na2HPO4 | BDH | 301584L | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
MgSO4 | Sigma | M-7506 | |
Microscopy Slides | Starfrost | K220 | |
Microscopy Cover Slips | VW2 International | 631-0124 | |
1.5ml Eppendorph Tubes | Fisher Scientific | FB74031 | |
Dessicator | Nalgene | D2672 | |
Nikon Microscope | Nikon | H600L | Nikon H600L microscope with proprietary software |
Nikon Camera | Nikon | DS-Fi1 | Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera |
Zeiss Microscope | Zeiss | Ax10 | Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter |
Plates 9cm | Starstedt | 82-1473 | |
Plates 6cm | Gosselin | BP53-01 | |
Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
Na3PO4 | Sigma-Aldrich | 7601-54-9 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside | Sigma-Aldrich | 7240-90-6 | |
N,N8-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 68-12-2 | |