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Medicine

चूहा मन्या धमनी में संवहनी गुब्बारा चोट और Intraluminal प्रशासन

Published: December 23, 2014 doi: 10.3791/52045
Automatic Translation
1, 1
1Nanobioscience, State University of New York College of Nanoscale Science and Engineering (SUNY CNSE)

Summary

इस प्रोटोकॉल चूहे मन्या धमनी पर एक intraluminal चोट के कारण और आगे से neointimal हाइपरप्लासिया प्रकाश में लाना करने के लिए एक बैलून कैथेटर का उपयोग करता है। इस चोट के जवाब में संवहनी remodeling के तंत्र के अध्ययन के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल है। यह भी व्यापक रूप से संभावित चिकित्सकीय दृष्टिकोण की वैधता निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

Abstract

चूहों में मन्या धमनी बैलून चोट मॉडल अच्छी तरह से दो दशक से अधिक के लिए स्थापित किया गया है। यह संवहनी चिकनी पेशी dedifferentiation, neointima गठन और संवहनी remodeling में शामिल आणविक और सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण विधि बनी हुई है। पुरुष Sprague-Dawley चूहों इस मॉडल के लिए सबसे अक्सर कार्यरत जानवर हैं। महिला हार्मोन वाहिका रोगों के खिलाफ सुरक्षा कर रहे हैं और इस तरह इस प्रक्रिया में एक बदलाव के रूप में परिचय मादा चूहों पसंद नहीं कर रहे हैं। छोड़ दिया मन्या आम तौर पर सही मन्या एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवारत के साथ घायल है। वाम मन्या चोट अन्तःचूचुक denudes और एस पोत दीवार तान देना कि फुलाया गुब्बारे के कारण होता है। चोट के बाद, इस तरह के औषधीय यौगिकों और जीन या shRNA के हस्तांतरण या तो के उपयोग के रूप में संभावित चिकित्सीय रणनीतियों का मूल्यांकन किया जा सकता है। आमतौर पर जीन या shRNA के हस्तांतरण के लिए, पोत लुमेन के घायल अनुभाग स्थानीय स्तर पर वी के साथ 30 मिनट के लिए transduced हैघायल पोत दीवार में वितरण और अभिव्यक्ति के लिए एक प्रोटीन या shRNA या तो एन्कोडिंग iral कणों। प्रफलन संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व Neointimal उमड़ना आमतौर पर चोट के बाद दो सप्ताह में चोटियों। वेसल्स ज्यादातर सेलुलर और आणविक सेल संकेत दे रास्ते के विश्लेषण के साथ ही जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए इस समय बिंदु पर काटा जाता है। वेसल्स भी इरादा प्रयोगात्मक उद्देश्य पर निर्भर करता है, एक विशिष्ट प्रोटीन या मार्ग की अभिव्यक्ति और / या सक्रियण की शुरुआत निर्धारित करने के लिए पहले के समय बिंदुओं पर काटा जा सकता है। वेसल्स ऊतकीय धुंधला, immunohistochemistry, प्रोटीन / mRNA के assays के, और गतिविधि assays का उपयोग विशेषता है और मूल्यांकन किया जा सकता है। एक ही जानवर से बरकरार सही मन्या धमनी एक आदर्श आंतरिक नियंत्रण है। आणविक और सेलुलर मापदंडों में चोट प्रेरित परिवर्तन आंतरिक सही नियंत्रण धमनी को घायल धमनी की तुलना द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। इसी तरह, चिकित्सकीय रूपरेखा घायल की तुलना द्वारा मूल्यांकन किया जा सकतानियंत्रण करने के लिए डी और इलाज धमनी केवल धमनी घायल हो गए।

Introduction

बैलून कैथेटर एक रक्त वाहिका में मेदार्बुद या थक्का के बाधित साइट (ओं) को चौड़ा करने के उद्देश्य के लिए, एंजियोप्लास्टी की प्रक्रिया में इस्तेमाल किया चिकित्सा उपकरणों रहे हैं। संकुचित पोत लुमेन फुलाया गुब्बारे से खोलने के लिए मजबूर किया जाता है और रक्त की आपूर्ति ऐसे एनजाइना, रोधगलन, और पैर में दर्द के रूप में नीचे की ओर ischemia के लक्षण, राहत देने के लिए क्रमिक रूप से बहाल कर दिया जाएगा। फिर भी, एंजियोप्लास्टी की बड़ी सफलता के ऐसे पोत लुमेन (restenosis) 1 के फिर से संकुचन संवहनी barotrauma (गुब्बारा चोट), अर्थात् पोत दीवार remodeling के कारण बल से परिणाम के रूप में है और कई मामलों में पोस्ट ऑपरेटिव जटिलताओं से कम किया गया है।

पशु मॉडलों के एक नंबर जांचकर्ताओं गुब्बारा चोट से संबंधित पोत दीवार remodeling के दो अंतर्निहित तंत्र को समझने में मदद करने के लिए एंजियोप्लास्टी प्रक्रिया नकल उतार विकसित किया गया है। मॉडलिंग के लिए उपयोग सभी जानवरों की प्रजातियों के अलावा, चूहे सबसे अक्सर इस्तेमाल किया जाता है। सीखरगोश, कुत्तों और सूअर को ompared, चूहों के फायदे उनके कम लागत, उपयोग की उनके रिश्तेदार आसानी और चूहे के शरीर क्रिया विज्ञान की वर्तमान ज्ञान हैं। चूहों आनुवंशिक रूप से चालाकी से उपभेदों की एक विस्तृत श्रृंखला में एक अतिरिक्त लाभ है हालांकि, चूहों पोत एक बैलून कैथेटर डालने के लिए बहुत छोटा है। पिछले तीन दशकों में, प्रयोगात्मक चूहों शोधकर्ताओं 3-6 remodeling neointima गठन और संवहनी underpinning आणविक और सेलुलर तंत्र की बेहतर समझ हासिल करने के लिए अनुमति दी है। गुब्बारा चोट के अलावा, संवहनी remodeling के भी ऐसे atherosclerosis के 7,8, उच्च रक्तचाप 9, और धमनीविस्फार के रूप में 10 सबसे प्रमुख वाहिका रोगों, में शामिल कर रहे हैं। इस प्रकार, ज्ञान गुब्बारा चोट मॉडल के माध्यम से प्राप्त की सामान्य में समग्र संवहनी दीवार रोग के अध्ययन के लिए फायदेमंद है।

चूहे गुब्बारा चोट मॉडल के समग्र लक्ष्य न केवल आगे वाहिका रोगों को समझने के लिए, लेकिन यह भी के लिए उपन्यास एजेंटों की शक्ति का परीक्षण करने के लिए हैरोग नियंत्रण 11,12। Restenosis के लिए वर्तमान नैदानिक ​​दवा इलाज सही एंजियोप्लास्टी के बाद पोत लुमेन के माध्यम से रखा दवा eluting स्टंट्स से लागू किया जाता है। पशु मॉडल में, नए एजेंट के परीक्षण के लिए एक कुशल अभी तक अधिक किफायती तरीका है एक अच्छी तरह से विकसित स्थानीय intraluminal छिड़काव विधि है। इस पद्धति के माध्यम से परीक्षण किया गया है कि उम्मीदवार एजेंट छोटे अणु दवाओं 13,14, साइटोकाइन शामिल है या विकास, 15,16 कारक जीन में हेर-फेर एजेंट (सीडीएनए क्लोन, siRNA, आदि) 17-20, और उपन्यास दवा फार्मूलों 21,22।

अब तक, चूहे गुब्बारा चोट मॉडल वाहिका रोगों / विकारों के अध्ययन के लिए सबसे उपयोगी मॉडलों में से एक बना हुआ है। यह पहला कदम vivo में करने के लिए इन विट्रो में से चलती आमतौर पर के रूप में, बिस्तर के लिए बेंच से बुनियादी कदम है, लेकिन यह पिछले एक नहीं होना चाहिए। चूहे प्रयोगों के परिणाम को विचार-विमर्श किया है और आगे मानव में अनुवाद से पहले लक्षण वर्णन किया जा करने की जरूरत हैकारण संवहनी बेड और पोत शरीर रचना विज्ञान के रूप में अच्छी तरह से मानव और चूहे 23-26 के बीच आंतरिक प्रजातियों मतभेद में अंतर करने के लिए नैदानिक ​​इस्तेमाल,। फिर भी, यह अभी भी translational चिकित्सा अनुसंधान के क्षेत्र में एक अनिवार्य उपकरण है। इस तरह के अनुसंधान आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की कमी के द्वारा सीमित उपयोग किया जाता है जैसे कि जिंक उंगली के रूप में उपन्यास जीनोमिक दृष्टिकोण 29 पीटा चूहों को आसानी से सुलभ बना दिया है, 27 न्युक्लिअसिज़ TALENS 28 और CRISPR कैस के बाद से, यह कोई मुद्दा नहीं रह गया है।

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Protocol

नोट: निम्न प्रयोगों के लिए पशुओं के उपयोग की समीक्षा की और संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. Preoperative प्रक्रियाएं

  1. उपयोग करने से पहले शल्य चिकित्सा उपकरणों जीवाणुरहित।
    1. सभी सर्जिकल उपकरणों सर्जरी से पहले 24 घंटे या उससे कम आटोक्लेव। एकाधिक सर्जरी एक ही दिन पर प्रदर्शन कर रहे हैं, तो सर्जरी के बीच में एक सूखी मनका अजीवाणु द्वारा उपकरणों बाँझ।
  2. फिल्टर बाँझ उपयोग करने से पहले खारा समाधान।
  3. चूहे वजन और संवेदनाहारी दवाओं (ketamine 80 मिलीग्राम / किग्रा और xylazine 7 मिलीग्राम / किग्रा) की खुराक की गणना।
  4. इंट्रा-peritoneally (आईपी) संवेदनाहारी दवाओं प्रशासन।
    1. 5-10 मिनट में पैर की अंगुली चुटकी से बेहोश करने की पर्याप्तता की जाँच करें। बेहोश करने की क्रिया पूरा नहीं हुआ है अगर दवाओं (ketamine 7 मिलीग्राम / किग्रा और xylazine 0.6 मिलीग्राम / किग्रा) के एक अतिरिक्त छोटी खुराक प्रशासन।
    2. सुनिश्चित करें कि सुई वितरण दवाओं इंट्रा-प्रति काफी गहरे तक हैitoneally पेरिटोनियल गुहा में पूरे दवा देने के समाधान की विफलता अपर्याप्त बेहोश करने की क्रिया के कारण होगा क्योंकि।
      नोट: इंजेक्शन स्थल पर त्वचा में अल्सर और बालों के झड़ने के कारण अनजाने में चमड़े के नीचे (अनुसूचित जाति) दवा समाधान इंजेक्शन के लिए सर्जरी के बाद दिखाई कई दिनों, हो जाएगा।
  5. 3 मिलीलीटर बाँझ खारा समाधान subcutaneously (सुप्रीम कोर्ट) इंजेक्षन। एक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करना, बाहर सुखाने से कॉर्निया को रोकने के लिए दोनों आंखों को नेत्र मरहम की एक छोटी राशि लागू होते हैं।
  6. हीटिंग उपकरण तैयार करें। माइक्रोवेव या पानी के स्नान से पूर्व गर्म गर्मी पैड।
  7. शल्य मंच पर supinely पशु रखो।
    1. उदर गर्दन के क्षेत्र में बाल निकालें। एक कपास झाड़ू के साथ बाल पदच्युत लागू करें 30 सेकंड प्रतीक्षा करें और धुंध के साथ पूरी तरह से मिटा।
    2. Povidone आयोडीन साफ़ और 70% इथेनॉल के साथ गर्दन झाड़ू।
  8. गाउन, बाल कवर, सर्जिकल मास्क, और चश्मा सहित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण, पर रखो। Ster पर रखोबाँझ शल्य चिकित्सा उपकरण और आपूर्ति को संभालने से पहले अंत में सर्जिकल दस्ताने इले।
  9. उजागर केवल गर्दन क्षेत्र के साथ एक बाँझ शल्य चादर के साथ चूहे कपड़ा।

2. सर्जिकल प्रक्रियाएं

  1. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान हर 15 मिनट में पैर की अंगुली चुटकी से जानवर के बेहोश करने की गहराई से जाँच करें। पशु पैर के अंगूठे चुटकी का जवाब है, तो ketamine और xylazine के अतिरिक्त छोटे खुराक (प्रारंभिक खुराक का 10%) जोड़ें।
  2. बाईं आम मन्या धमनी काटना (सीसीए)
    1. गर्दन के बीच में एक सीधे अनुदैर्ध्य चीरा बनाने के लिए एक स्केलपेल का प्रयोग करें। त्वचा चीरा की अनुमानित लंबाई धमनी की एक 1.5-2 सेमी हिस्से को अलग-थलग करने के उद्देश्य से, 1.5-2 सेमी है। भिन्न हो सकते हैं लंबाई अध्ययन के उद्देश्य पर निर्भर करता है।
    2. दो टूक त्वचा से संयोजी ऊतक काटना। संदंश सुझावों ऊपर रखें और त्वचा या अंतर्निहित ऊतक पंचर करने के लिए नहीं सुनिश्चित करें।
    3. अनुलंबीय Alon मांसपेशी परतों काटनाजी श्वासनली के बाईं ओर।
    4. पेशी परत खोलने, जब बारीकी से जुड़ी वेगस तंत्रिका के साथ छोड़ दिया सीसीए कल्पना। अत्यधिक सावधानी के साथ छोड़ दिया मन्या धमनी न्यूनतम खींचने के साथ वेगस तंत्रिका को अलग करने के साथ-साथ दो टूक काटना।
    5. विभाजन तक distally सीसीए काटना। आंतरिक मन्या धमनी (आईसीए) और बाह्य मन्या धमनी (ईसीए) - ध्यान विभाजन और दो शाखाओं काटना।
    6. धमनी की 1.5-2 सेमी की लगभग एक हिस्से आसपास के ऊतकों से अलग है, जब तक सीसीए के आसपास विदारक रखें।
  3. गुब्बारा चोट
    1. स्थायी रूप से लगभग 5 मिमी दूर विभाजन से ईसीए पर एक संयुक्ताक्षर बनाते हैं। स्थायी रूप से ईसीए और आईसीए के विभाजन के करीब है जो ईसीए के पश्चकपाल शाखा ligate। इसके अलावा स्थायी रूप से विभाजन और ईसीए संयुक्ताक्षर के बीच लगाने, अन्य शाखाओं ligate यदि कोई हो - उदाहरण के लिए, बेहतर थायराइड शाखा। सभी संयुक्ताक्षर के लिए प्रयोग किया जाता है कि सिवनी 4-0 काला हैरेशम। सीसीए के समीपस्थ अंत और आईसीए के बाहर का अंत पर क्लिप।
      नोट: अब, रक्त के प्रवाह को रोक दिया गया है या तो स्थायी रूप से बंधाव के माध्यम से (ईसीए) पर या अस्थायी रूप से (सीसीए और आईसीए) पर कतरन के माध्यम से। विभाजन के क्षेत्र में luminal सामग्री प्रणालीगत संचलन से पृथक किया गया है।
    2. छोटे-सूक्ष्म कैंची से ईसीए पर एक arteriotomy चीरा बनाओ। चीरा बाहर का सिवनी गाँठ के करीब है कि सुनिश्चित करें। खारा और कपास swabs के साथ स्वच्छ रक्त।
    3. ईसीए लुमेन में uninflated 2 एफ बैलून कैथेटर डालें। सीसीए लुमेन को proximally बैलून कैथेटर अग्रिम। क्लिप रहता है, जहां इसकी टिप तक पहुँच जाता है जब तक proximally कैथेटर को आगे बढ़ाने रखें।
    4. एक 3 तरह पानी निकलने की टोंटी पर एक महिला luer ताला गुब्बारा मुद्रास्फीति डिवाइस कनेक्ट और बैलून कैथेटर के लिए 3 तरह पानी निकलने की टोंटी के पुरुष luer ताला कनेक्ट।
    5. धीरे धीरे व्यास का 1.5 गुना करने के लिए मन्या धमनी फुलाना के क्रम में, लगभग 1.5 एटीएम दबाव के साथ गुब्बारा फुलाना। धीरे rotationally वापस विभाजन करने के लिए गुब्बारा खींच।
    6. गुब्बारा खंडन करना और समीपस्थ अंत करने के लिए इसे वापस अग्रिम। इसे फिर से फुलाना और खींच-बैक प्रक्रिया दो बार दोहराएँ।
    7. धमनी लुमेन से बैलून कैथेटर वापस ले लें।
  4. अभिकर्मकों के intraluminal प्रशासन (जैसे, siRNA, ड्रग्स)
    नोट: यहाँ, इस्तेमाल किया अभिकर्मक या तो shRNA Stromal इंटरेक्शन अणु 1 (STIM1) या गैर लक्षित कर shRNA के नियंत्रण को लक्षित एन्कोडिंग lentiviral कणों से युक्त एक समाधान किया गया। STIM1 प्लाज्मा झिल्ली सीए 2 + चैनलों की सक्रियता को नियंत्रित करने के लिए एक ईआर Ca 2 सेंसर है और एक proliferative प्रवासी फेनोटाइप 12,30-33 में संवहनी चिकनी पेशी dedifferentiation दौरान विनियमित निर्भर है कि एक एकल ट्रांसमेम्ब्रेन endoplasmic जालिका (ईआर) प्रोटीन होता है।
    1. एक सिरिंज (24 जी, 1.6 सेमी) करने के लिए एक intravascular अधिक-सुई कैथेटर संलग्न। परीक्षण reag की महाप्राण 30 μl समाधानपिता। ईसीए पर एक ही चीरा में कैथेटर डालें।
    2. सीसीए में कैथेटर टिप अग्रिम और कैथेटर को ठीक करने और अस्थायी रूप से चीरा बंद करने के लिए ईसीए पर एक भी गाँठ के साथ सिवनी का एक टुकड़ा टाई।
    3. सीसीए के लुमेन में परीक्षण अभिकर्मक समाधान इंजेक्षन। 30 मिनट के लिए पोत लुमेन में समाधान रखें। नमक के साथ नम उजागर ऊतक रखें और गीला धुंध के एक टुकड़े के साथ कवर।
    4. ऊष्मायन के बाद, शेष समाधान aspirate। कि एक गाँठ ढीला और कैथेटर वापस ले लें।
    5. Arteriotomy चीरा को proximally सीवन के एक टुकड़े के साथ ईसीए बाँधो। विभाजन के लिए संभव के रूप में बंद गाँठ बनाओ।
  5. घाव ऊपर बंद करें।
    1. गुब्बारा चोट और कैथेटर परिचय रक्त वाहिनियों के रिसाव या पंचर कारण हो सकता है के बाद से, आईसीए पर क्लिप हटाने के लिए और किसी भी रिसाव अगर वहाँ की जाँच करें। खून बह रहा है मनाया जाता है, धुंध का एक टुकड़ा लागू करते हैं और रक्तस्राव को रोकने के लिए कोमल दबाव लागू होते हैं।
    2. हटासीसीए पर अन्य क्लिप।
    3. रक्तस्राव के कोई संकेत नहीं हैं सुनिश्चित करें, और उसके बाद सभी clamps और अन्य शल्य चिकित्सा उपकरणों को हटा दें। अतिरिक्त टांके काट दिया।
    4. बंद घाव का उपयोग कर त्वचा टांके (4-0 काले रेशम)। Povidon-आयोडीन या अन्य विरोधी सेप्टिक / जीवाणुनाशक / virucide एजेंट के साथ बंद घाव के सभी पक्षों पर झाड़ू। बाँझ खारा अनुसूचित जाति के 3 मिलीलीटर इंजेक्षन

3. पश्चात की प्रक्रियाएं

  1. सर्जरी के बाद गर्मी पैड पर चूहा रखें। चूहे को इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन (आईएम) के माध्यम से 0.05 मिलीग्राम / किग्रा buprenorphine की एक खुराक प्रशासन। वसूली प्रक्रिया के दौरान, नम जानवरों की आँखों और मुँह में रहते हैं। यह जाग और सफ़ाई-संबंधी है जब तक पशु मॉनिटर।
  2. यह पूरी तरह से ठीक है जब तक किसी भी बिस्तर के बिना एक साफ पिंजरे में पशु रखें। वसूली के बाद, पशु पशु कमरे में लौट आए और व्यक्तिगत रूप से स्थित हो जाएगा।

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Representative Results

दो हफ्ते चोट के बाद, मन्या धमनियों, काटा sectioned और रूपात्मक विश्लेषण के अधीन हैं। धमनियों-पार sectioned और एच एंड ई के साथ दाग रहे हैं (आंकड़े 1, 2 बी, सी और 3)। चूहा मन्या धमनी दीवार गुलाबी लाइनों के रूप में दिखाई देते हैं जो लोचदार लामिना के चार परतों, शामिल हैं। सबसे बाहरी लामिना, बाहरी लोचदार लामिना (मछली) और अंतरतम लामिना के बीच के क्षेत्र, आंतरिक लोचदार लामिना (IEL) मीडिया चिकनी पेशी परत (चित्रा 1) है। IEL के अंदर क्षेत्र intima बरकरार वाहिकाओं में endothelial कोशिकाओं की एक monolayer है; घायल के बर्तन में या neointimal हाइपरप्लासिया। घायल मन्या धमनी में, मीडिया चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के प्रसार के कारण नियंत्रण जहाजों में से मोटा है। neointima की मोटाई एक ही धमनी में मीडिया की मोटाई से करने के लिए समान या अधिक से अधिक है। बाह्यकंचुक भी मजबूत कोलेजन बयान (चित्रा 1 बी, डी) के साथ thickened है। इसकी वजह के साथ इलाज धमनी के लिएसज्जन neointima गठन को बाधित करने की क्षमता के लिए परीक्षण (इस मामले में, STIM1 shRNA), क्रॉस सेक्शन की neointimal क्षेत्र छोटे नियंत्रण घायल धमनी (चित्रा 2) की तुलना में है। STIM1 अभिव्यक्ति के स्तर को काफी हद तक नियंत्रण घायल पोत की तुलना में घायल पोत neointima और मीडिया में कमी आई है के रूप में shRNA के साथ STIM1 पछाड़ना की वैधता स्पष्ट हो गया था।

चर्चा अनुभाग में उल्लेख किया जाएगा के रूप में, सर्जन गुब्बारा फुलाना पर और जरूरत से ज्यादा पोत को घायल करने के लिए सतर्क नहीं होना चाहिए। इस पोत दीवार में 3 चित्र में दिखाया गया है, लुमेन में और धमनी की बाहरी सतह पर दोनों रक्त रिसाव और मजबूत thrombus गठन का कारण होगा, जो टूटना करने के लिए कारण होगा।

चित्रा 1
चित्रा 1: चूहा मन्या धमनी पार वर्गों Hematoxylin के साथ दाग सामान्य चूहे मन्या की और eosin (एच एंड ई)। (ए) घायल (बाएं) सीसीए के सामान्य / बरकरार (दाएं) सीसीए। (बी) आकृति विज्ञान की आकृति विज्ञान, neointima गठन और बाह्यकंचुक / मीडिया उमड़ना दिखा। (सी) संरचना धमनी की दीवार। intima आंतरिक लोचदार लामिना (IEL) पर अस्तर endothelial कोशिकाओं की एक monolayer है। मीडिया चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और IEL और बाहरी लोचदार लामिना (मछली) के बीच लोचदार ऊतकों है। बाह्यकंचुक बाहरी परत है। (डी) चूहा मन्या धमनी की दीवार मजबूत उमड़ना चोट के बाद दो हफ्तों। चिकनी पेशी सेल प्रसार और प्रवास neointima गठन और मीडिया मोटा होना करने के लिए नेतृत्व। ठेठ गाढ़ा neointima स्वरूपित और मीडिया / बाह्यकंचुक गुब्बारा चोट phenotype के सफल पीढ़ी दिखा, thickened। लाल (eosin) धुंधला होने के कारण मजबूत कोलेजन संश्लेषण के लिए, बाह्यकंचुक में बढ़ाया है। स्केल सलाखों 100 माइक्रोन हैं।

एस "> चित्रा 2
चित्रा 2: shRNA-STIM1 या shRNA के नियंत्रण के उपचार के साथ चूहे मन्या धमनियों के पार वर्गों, दो सप्ताह चोट पोस्ट (ए) के दोनों समूहों से पार वर्गों पर नाभिक STIM1 और DAPI धुंधला की Immunofluorescent धुंधला।। shRNA-STIM1 इलाज किया धमनी खंड में STIM1 और neointima गठन प्रदर्शनी का तनु अभिव्यक्ति। (बी) shRNA-STIM1 धमनी खंड के एच एंड ई धुंधला। neointima सीमा, IEL और मछली की सी डिजिटल ट्रेसिंग, मापने के क्षेत्रों के प्रयोजन के लिए लुमेन, neointima और मीडिया की। स्केल बार 100 माइक्रोन हैं।

चित्रा 3
चित्रा 3: उप इष्टतम या neointimal मॉडलिंग उत्पन्न करने के लिए विफलता का उदाहरण (ए) के बजाय गाढ़ा neointima के विलक्षण का गठन किया।अनुचित गुब्बारों की वजह से। (बी) (एक से अधिक फुलाया गुब्बारे से) अत्यधिक चोट गंभीर पोत को होने वाले नुकसान और असंतत लोचदार laminas से स्पष्ट है जो पोत दीवार का टूटना का कारण बना। गंभीर चोट पूरे पोत लुमेन अवरुद्ध है और बाह्यकंचुक में बाहर का विस्तार किया गया है, जो थक्का, कारण होता है। इसके अलावा, बढ़ाया आसंजन बाह्यकंचुक और आसपास वसा ऊतकों के बीच हुई। स्केल बार 100 माइक्रोन हैं।

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Discussion

चूहे मन्या गुब्बारा चोट अच्छी तरह से। 2007 34 में Tulis द्वारा वर्णित किया गया है यह व्यापक डॉ Tulis द्वारा इस प्रक्रिया के सभी विवरण पर चर्चा की गई है। इस प्रक्रिया के प्रदर्शन में रुचि रखते हैं, जो पाठकों को अत्यधिक Tulis 'प्रोटोकॉल को पढ़ने के लिए सिफारिश कर रहे हैं। हालांकि, हम डॉ Tulis के साथ सहमत नहीं कर रहे हैं वहाँ एक बात है: इसके बजाय खारा या तरल के किसी भी प्रकार के साथ गुब्बारे inflating की, हम हवा के साथ यह फुलाना करने का सुझाव दिया। हमारे व्यक्तिगत अनुभव के अनुसार, तरल के साथ inflating शायद ही हवा के बुलबुले से बच सकते हैं। इसके अलावा, यह लचीले ढंग चोट प्रक्रिया के दौरान दबाव को समायोजित करने और धमनी के लिए अतिरिक्त तनाव और चोट के कारण हो सकता है और अधिक कठिन है। एक अन्य तकनीकी टिप सर्जरी के दौरान जानवर की गर्दन का समर्थन करने के लिए (कागज तौलिया या धुंध से बना) एक छोटे "तकिया" का उपयोग करने के लिए है।

पिछली रिपोर्टों और चूहे गुब्बारा चोट प्रक्रिया के साथ अनुभव के कई वर्षों के आधार पर, लेखकों एक थोड़ा संशोधित और simplifie उत्पन्न किया हैडी प्रोटोकॉल 35। इसके अलावा, सही चोट के बाद चिकित्सा विज्ञान की intraluminal अर्क प्रदर्शन किया गया है। यह मोटे तौर पर इस अस्तित्व सर्जरी प्रक्रिया के समय दोगुनी है और इस तरह अतिरिक्त अनुभव पर हाथ की आवश्यकता है। लंबे समय अवधि के दौरान प्रमुख चिंता का विषय संवेदनाहारी विमान है। संवेदनाहारी दवा का प्रारंभिक खुराक 30-45 मिनट के लिए चूहे के बेहोश करने की क्रिया बनाए रख सकते हैं और इसलिए पशु अक्सर विशेष रूप से 30 मिनट के अर्क समय के दौरान, पैर के अंगूठे चुटकी द्वारा जाँच की जानी चाहिए। इस विशिष्ट सर्जरी के लिए बजाय inhalant संज्ञाहरण का इंजेक्शन संवेदनाहारी दवाओं का उपयोग करने के कारण चूहे के सिर के उन्मुखीकरण के कारण एक किराए पर है। लेखक 'अनुभव के अनुसार, मन्या धमनी में गुब्बारा प्रविष्टि चूहे के सर्जन की ओर अपने सिर के साथ झूठ बोल रही है जब प्रदर्शन करने के लिए बहुत आसान है। सर्जरी प्रदर्शन है, यह अत्यधिक के लिए एक धूआं हुड के तहत ऐसा करने की सिफारिश की है या एक जैव सुरक्षा कैबिनेट जब lentivirus प्रस्तुत (संभावित एलर्जी से बचने के लिए)। इस मामले में, भारी मैंnhalation शंकु और ट्यूबिंग हुड के airflow परेशान है, और भी उपयोग करने के लिए शल्य चिकित्सा के क्षेत्र में कठिन होगा। हालांकि, यह अभी भी अत्यधिक सर्जन अच्छी तरह से 'जानवरों के सिर के विपरीत उन्मुखीकरण के साथ सर्जरी प्रदर्शन कर सकते हैं अगर inhalant संज्ञाहरण का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है।

निषेचन के दौरान पोत लुमेन में हवा के बुलबुले से बचने के लिए, कृपया ध्यान दें।

किसी भी अन्य कृंतक सर्जरी की तरह, हाइपोथर्मिया पूरी प्रक्रिया के दौरान प्रमुख चिंता का विषय है। मौत का कारण हो सकता है, जो हाइपोथर्मिया से पशु पीड़ा से बचने के लिए उचित हीटिंग उपकरण का प्रयोग करें। इस बीच, ओवर-हीटिंग / अतिताप भी बचा जाना चाहिए। गर्मी-पैड का उपयोग करते समय, तौलिए अधिक हीटिंग से जानवर को रोकने के लिए गर्मी-पैड और पशुओं के शरीर के बीच रखा जा करने के लिए सिफारिश की है।

दो समाधान है, खारा और lidocaine के हाइड्रोक्लोराइड (1%), अत्यधिक शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान जब आवश्यक उजागर ऊतकों पर लागू करने के लिए सिफारिश की है। कर रहे हैं कि ऊतकोंसर्जरी के दौरान उजागर निष्फल खारा ने नम रखा जाना चाहिए। सर्जिकल खिंचाव अक्सर पेशी ऐंठन और मन्या धमनी के पोत संकुचन का कारण बनता है। एक अनुबंधित धमनी में बैलून कैथेटर की निवेशन असफल होने का खतरा है; गुब्बारा प्रविष्टि इन परिस्थितियों में सफल होता है, जब वह गंभीर खींच या धमनी पर नुकसान का कारण बन जाएगा। एक सामयिक संवेदनाहारी दवा के रूप में lidocaine आराम करने और पोत को फैलाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

गुब्बारा लगभग 1.5 एटीएम दबाव के साथ फुलाया जाता है और उचित समायोजन के कारण (reused अगर) आयु वर्ग के गुब्बारे के plasticity में परिवर्तन और सीसीए व्यास की भिन्नता के लिए, प्रत्येक सर्जरी के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, के कारण कुछ धमनियों की कठोरता को गुब्बारा फुलाया पर- लेकिन नहीं देखा जा सकता हो सकता है। इस मामले में, गुब्बारा फुलाया जाता है, जब सर्जन थोड़ा धमनी के प्रतिरोध की जाँच करें और तदनुसार गुब्बारा दबाव को समायोजित करने के लिए कैथेटर खींच चाहिए। मजबूत एक की गंभीर क्षति या टूटना कारण होगा खींचrtery, रक्त रिसाव, और प्रयोगात्मक मॉडल की विफलता। बैलून कैथेटर के रूप में लंबे समय के गुब्बारे को अभी भी अच्छी तरह से काम करता है के रूप में कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है। Reusing का उद्देश्य के लिए Cidex का उपयोग कर बैलून कैथेटर कीटाणुरहित। बैलून कैथेटर, प्राकृतिक रबर लेटेक्स और पॉलीथीन से बना है कि सामग्री, Cidex के साथ संगत होना करने के लिए मंजूरी दी गई है। Cidex का उपयोग कर चिकित्सा उपकरणों disinfecting के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल 37 में वर्णित किया गया है। सर्जन उपयोग करने से पहले गुब्बारे का रिसाव हर बार की जाँच करने के लिए यह महत्वपूर्ण है।

निरंतर सिवनी पैटर्न आमतौर पर त्वचा को बंद करने के लिए उपयोग करने के लिए सिफारिश नहीं है। इसके बजाय, घाव क्लिप और बाधित सीवन पैटर्न आमतौर पर की सिफारिश कर रहे हैं। चीरा अत्यधिक सक्रिय और संवेदनशील शरीर के अंग पर है फिर भी, जब, गर्दन, इस मामले में नहीं हो सकता। हमारे अनुभव के अनुसार, क्लिप घाव और बाधित सीवन पैटर्न बंद करने की विफलता की उच्च दर के साथ समाप्त हो गया। पशु scratching द्वारा टूट खो क्लिप्स या टांके वी हुआकारण धातु क्लिप या एकाधिक सिवनी सिरों की वजह से अधिक खुजली के लिए सबसे अधिक संभावना थी, जो अक्सर ery। निरंतर सिवनी पैटर्न का उपयोग करते हैं, तो असफलता की दर चूहों के सैकड़ों के साथ हमारी प्रयोगशाला में केवल 1% थी। हम वीडियो में यह दिखाने के लिए सक्षम नहीं थे, हालांकि इसके अलावा, त्वचा को बंद करने का सबसे अच्छा तरीका है, शायद अंतर्त्वचीय सिवनी पैटर्न है।

ऊतक वर्गों के histological धुंधला के लिए उपलब्ध तरीकों की एक किस्म है। एच एंड ई धुंधला सबसे अधिक इस्तेमाल से एक है। पाठकों आगे पढ़ने के लिए, Tulis द्वारा एक व्यापक विचार-विमर्श किया अनुच्छेद 36 में भेजा जाता है। लामिना संरचनाओं के और अधिक सटीक जानकारी हासिल करने के लिए आदेश में, वान Gieson Counterstain (VVG धुंधला) के साथ Verhoeff लोचदार ऊतक दाग अत्यधिक की सिफारिश की है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fogarty balloon embolectomy catheters, 2 French  Edwards Lifesciences, Germany  120602F
Deltaphase Operating Board - Includes 2 Pads & 2 Insulators Braintree Scientific, Inc. 39OP
LED light source Fisher Scientific 12-563-501 
Hartmann Mosquito Forceps 4” curved Apiary Medical, Inc. San Diego, CA gS 22.1670
Crile Retractor 4” double ended Apiary Medical, Inc. gS 34.1934
Other surgical instruments Roboz Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg, MD
Peripheral Intravenous (I.V.) Cannula, 24 G BD 381312
Ketamine HCl, 100 mg/ml, 10 ml Ketaset- Patterson Vet 07-803-6637 
Xylazine (AnaSed), 20 mg/ml, 20 ml Ketaset- Patterson Vet 07-808-1947
Buprenex, 0.3 mg/1 ml (5 Ampules/Box) Ketaset- Patterson Vet 07-850-2280
Nair Baby Oil Hair Removal Lotion - 9 oz Amazon/Walmart/CVS N/A
Inflation Device Demax Medical DID30
D300 3-way Stopcock B.Braun Medical Inc. 4599543
Artificial Tears Ointment  Rugby Laboratories, Duluth, GA N/A

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References

  1. Landzberg, B. R., Frishman, W. H., Lerrick, K. Pathophysiology and pharmacological approaches for prevention of coronary artery restenosis following coronary artery balloon angioplasty and related procedures. Progress in Cardiovascular Diseases. 39, 361-398 (1997).
  2. Muller, D. W., Ellis, S. G., Topol, E. J. Experimental models of coronary artery restenosis. J. Am. Coll. Cardiol. 19, 418-432 (1992).
  3. Clowes, A. W., Reidy, M. A., Clowes, M. M. Kinetics of cellular proliferation after arterial injury. I. Smooth muscle growth in the absence of endothelium. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 49, 327-333 (1983).
  4. Clowes, A. W., Reidy, M. A., Clowes, M. M. Mechanisms of stenosis after arterial injury. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 49, 208-215 (1983).
  5. Clowes, A. W., Clowes, M. M. Kinetics of cellular proliferation after arterial injury. IV. Heparin inhibits rat smooth muscle mitogenesis and migration. Circulation Research. 58, 839-845 (1986).
  6. Li, G., Chen, S. J., Oparil, S., Chen, Y. F., Thompson, J. A. Direct in vivo evidence demonstrating neointimal migration of adventitial fibroblasts after balloon injury of rat carotid arteries. Circulation. 101, 1362-1365 (2000).
  7. Kiechl, S., Willeit, J. The natural course of atherosclerosis. Part II: vascular remodeling. Bruneck Study Group. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19, 1491-1498 (1999).
  8. Yamamoto, S., et al. Derivation of rat embryonic stem cells and generation of protease-activated receptor-2 knockout rats. Transgenic Research. 21, 743-755 (2012).
  9. Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: roles of apoptosis, inflammation, and fibrosis. Hypertension. 38, 581-587 (2001).
  10. Meng, H., et al. Complex hemodynamics at the apex of an arterial bifurcation induces vascular remodeling resembling cerebral aneurysm initiation. Stroke. 38, 1924-1931 (2007).
  11. Sun, C. K., Shao, P. L., Wang, C. J., Yip, H. K. Study of vascular injuries using endothelial denudation model and the therapeutic application of shock wave: a review. American Journal of Rranslational Research. 3, 259-268 (2011).
  12. Zhang, W., et al. Orai1-mediated I (CRAC) is essential for neointima formation after vascular injury. Circulation Research. 109, 534-542 (2011).
  13. Ollinger, R., et al. Bilirubin: a natural inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Circulation. 112, 1030-1039 (2005).
  14. Levitzki, A. PDGF receptor kinase inhibitors for the treatment of restenosis. Cardiovascular Research. 65, 581-586 (2005).
  15. Asahara, T., et al. Local delivery of vascular endothelial growth factor accelerates reendothelialization and attenuates intimal hyperplasia in balloon-injured rat carotid artery. Circulation. 91, 2793-2801 (1995).
  16. Lee, K. M., et al. Alpha-lipoic acid inhibits fractalkine expression and prevents neointimal hyperplasia after balloon injury in rat carotid artery. Atherosclerosis. 189, 106-114 (2006).
  17. Ji, R., et al. MicroRNA expression signature and antisense-mediated depletion reveal an essential role of MicroRNA in vascular neointimal lesion formation. Circulation Research. 100, 1579-1588 (2007).
  18. Merlet, E., et al. miR-424/322 regulates vascular smooth muscle cell phenotype and neointimal formation in the rat. Cardiovascular Research. 98, 458-468 (2013).
  19. Huang, J., Niu, X. L., Pippen, A. M., Annex, B. H., Kontos, C. D. Adenovirus-mediated intraarterial delivery of PTEN inhibits neointimal hyperplasia. Arteriosclerosis, Thrombosis, And Vascular Biology. 25, 354-358 (2005).
  20. Gonzalez-Cobos, J. C., et al. Store-independent Orai1/3 channels activated by intracrine leukotriene C4: role in neointimal hyperplasia. Circulation Research. 112, 1013-1025 (2013).
  21. Guzman, L. A., et al. Local intraluminal infusion of biodegradable polymeric nanoparticles. A novel approach for prolonged drug delivery after balloon angioplasty. Circulation. 94, 1441-1448 (1996).
  22. Lipke, E. A., West, J. L. Localized delivery of nitric oxide from hydrogels inhibits neointima formation in a rat carotid balloon injury model. Acta Biomaterialia. 1, 597-606 (2005).
  23. Osterrieder, W., et al. Role of angiotensin II in injury-induced neointima formation in rats. Hypertension. 18, II60-II64 (1991).
  24. Powell, J. S., et al. Inhibitors of angiotensin-converting enzyme prevent myointimal proliferation after vascular injury. Science. 245, 186-188 (1989).
  25. Does the new angiotensin converting enzyme inhibitor cilazapril prevent restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty? Results of the MERCATOR study: a multicenter, randomized, double-blind placebo-controlled trial. Multicenter European Research Trial with Cilazapril after Angioplasty to Prevent Transluminal Coronary Obstruction and Restenosis (MERCATOR) Study Group. Circulation. 86, 100-110 (1992).
  26. Faxon, D. P. Effect of high dose angiotensin-converting enzyme inhibition on restenosis: final results of the MARCATOR Study, a multicenter, double-blind, placebo-controlled trial of cilazapril. The Multicenter American Research Trial With Cilazapril After Angioplasty to Prevent Transluminal Coronary Obstruction and Restenosis (MARCATOR) Study Group. J Am Coll Cardiol. 25, 362-369 (1995).
  27. Geurts, A. M., et al. Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases. Science. 325, 433 (2009).
  28. Tesson, L., et al. Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs. Nature Biotechnology. 29, 695-696 (2011).
  29. Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31, 681-683 (2013).
  30. Potier, M., et al. Evidence for STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium influx through ICRAC in vascular smooth muscle cells: role in proliferation and migration. FASEB Journal : Official Publication Of The Federation Of American Societies For Experimental Biology. 23, 2425-2437 (2009).
  31. Aubart, F. C., et al. RNA interference targeting STIM1 suppresses vascular smooth muscle cell proliferation and neointima formation in the rat. Molecular Therapy. The Journal Of The American Society Of Gene Therapy. 17, 455-462 (2009).
  32. Berra-Romani, R., Mazzocco-Spezzia, A., Pulina, M. V., Golovina, V. A. Ca2+ handling is altered when arterial myocytes progress from a contractile to a proliferative phenotype in culture. American journal of physiology. Cell Physiology. 295, C779-C790 (2008).
  33. Bisaillon, J. M., et al. Essential role for STIM1/Orai1-mediated calcium influx in PDGF-induced smooth muscle migration. American journal of physiology. Cell Physiology. 298, C993-C1005 (2010).
  34. Tulis, D. A. Rat carotid artery balloon injury model. Methods In Molecular Medicine. 139, 1-30 (2007).
  35. Zhang, W., Trebak, M. Balloon Injury in Rats as a Model for Studying TRP Channel Contribution to Vascular Smooth Muscle Remodeling. T TRP Channels in Drug DiscoveryMethods in Pharmacology and Toxicology. Szallasi, A., Bíró, T. , Humana Press. 101-111 (2012).
  36. Tulis, D. A. Histological and morphometric analyses for rat carotid balloon injury model). Methods In Molecular Medicine. 139, 31-66 (2007).
  37. Advanced Sterilization Products. How to use Cidex OPA solution. , Available at: http://www.hopkinsmedicine.org/hse/forms/cidexopa/OPAHowToUse.pdf (2014).

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चिकित्सा अंक 94 चूहा मन्या धमनी गुब्बारा चोट neointima रोग पशु मॉडल संवहनी चिकनी पेशी सेल हाइपरप्लासिया संवहनी दीवार remodeling
चूहा मन्या धमनी में संवहनी गुब्बारा चोट और Intraluminal प्रशासन
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Zhang, W., Trebak, M. Vascular… More

Zhang, W., Trebak, M. Vascular Balloon Injury and Intraluminal Administration in Rat Carotid Artery. J. Vis. Exp. (94), e52045, doi:10.3791/52045 (2014).

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