Abstract
התיקון וההתחדשות של שריר שלד דורש הפעולה של תאי לווין, שהם תאי גזע שריר התושב. אלה יכולים להיות מבודדים מדגימות שריר אנושי ביופסיה באמצעות עיכול אנזימטי ומאפייני myogenic למדו בתרבות. כמותית, שני סוגי התאים חסיד העיקריים המתקבלים מעיכול אנזימטי הם: (i) תאי הלווין (המכונים תאי myogenic או תאי מבשר שריר), שזוהו בתחילה כCD56 + ובהמשך כCD56 + / desmin ותאים + (ii) שריר fibroblasts נגזר, שזוהה כCD56 - וTE-7 +. Fibroblasts להתרבות ביעילות רבה בתרבות ובאוכלוסיות תאים מעורבות תאים אלה עשויים מוצפים תאי myogenic להשתלט על התרבות. הבידוד וטיהור סוגי תאים שונים משריר האנושי שלו ובכך שיקול מתודולוגית חשוב כאשר מנסים לחקור את ההתנהגות המולדת של כל אחד מסוגי התאים בתרבית. כאן אנו descrIBE מערכת של מיון המבוסס על עיכול אנזימטי העדין של תאים באמצעות collagenase וdispase אחריו תא מופעל מגנטי מיון (MACS) אשר נותן שני טוהר גבוה (> תאי myogenic 95%) ותשואה טובה (~ 2.8 x 10 6 ± 8.87 x 10 5 תאים / g רקמות לאחר 7 ימים במבחנה) לניסויים בתרבות. גישה זו מבוססת על דוגרים אוכלוסיית תאים המעורבת נגזר שריר עם חרוזים microbeads מגנטיים המוצמדים לנוגדנים נגד CD56 ולאחר מכן עוברים תאים למרות ששדה מגנטי. CD56 + תאים חייבים microbeads נשמרים על ידי השדה ואילו CD56 - תאים עוברים ללא הפרעה דרך העמודה. השעיות תא מכל שלב של תהליך המיון יכולות להיות מצופים ותרבותית. בעקבות התערבות נתון, מורפולוגיה של תאים, והביטוי והלוקליזציה של חלבונים כוללים גורמי שעתוק גרעיניים ניתן לכמת באמצעות תיוג immunofluorescent עם נוגדנים ספציפיים וp תמונהrocessing וחבילת ניתוח.
Introduction
התיקון וההתחדשות של שריר שלד דורש הפעולה של תאי לווין 1, תאי גזע myogenic 2,3. בvivo תאים אלה קיימים במדינה הפיכה שקטה הממוקמת בין sarcolemma וlamina בסיס של כל myofibre, אלא הופכים להיות מופעל כדי להתרבות, פתיל ולהבדיל כרקמת שריר פגום, תיקון ומחדש 3. יכולים להיות מבודדים תאי לווין מדגימות צעירות וקשישים שריר אנושי ביופסיה באמצעות עיכול אנזימטי 4 ומאפייני myogenic לאחר מכן ניתן יהיה למד בתרבות העיקרית 5. היעילות של תהליך בידוד זה בהקשר לשתי התשואה והטוהר של אוכלוסיית תאים תלויה בשיטות ויכולה להשתנות ממדגם לדגום. שני סוגי התאים חסיד העיקריים המתקבלים מעיכול אנזימטי הם תאי הלווין (תאי myogenic עכשיו כינו או תאי מבשר שריר), שזוהו בתחילה כתאי CD56 + / desmin, וmufibroblasts הנגזר scle, זוהה כCD56 - וTE7 + תאי 5. לפיברובלסטים שיעור שגשוג מהיר ולא יעברו מעצר בלתי הפיך צמיחה ובידול מסוף במגע תאי תאים כמו תאי myogenic; כך באוכלוסיות מעורבות, fibroblasts עשוי מוצף תאי myogenic להשתלט על התרבות.
לעתים קרובות נצפה fibroblasts כגירוי לביולוגים שריר, לעומת זאת, יש כיום עניין גובר בfibroblasts כתאים ראויים למחקר בפני עצמם, במיוחד כשהם הוכחו יש להם תפקיד של שיתוף פעולה עם תאי myogenic במהלך תיקון שריר 6 . הבידוד וטיהור סוגי תאים שונים משריר האנושי שלו ובכך שיקול מתודולוגית חשוב כאשר מנסים לחקור את ההתנהגות המולדת של שני סוגי התאים בתרבית. מיון תא הקרינה המופעל (FACS) הוא שיטה שבאמצעותה ניתן למיין תאים למחקר נוסף ו / או וספרניתח. FACS הוכח להעשיר באופן מהימן תאי myogenic אנושיים, אבל התשואה של תאים לתרבות שלאחר מכן עד כה לא הייתה גבוהה 7. לאור פוטנציאל השכפול המוגבל של תאים סומטיים כגון תאים נגזרים תאי לווין myogenic ועני מאוד התפשטות ובידול הקשורים להזדקנות 4, גישות עדינות יותר נדרשות. תרבויות סיב שריר בודדות מציעות אחר, פחות אגרסיווי, אמצעי להשגת תאי לווין עכבריים עדיין תושב בנישה sublaminal ולאחר ההפעלה שלהם בתרבות 8,9. עם זאת, זה בדרך כלל לא אפשרי מחומר ביופסיה של שריר אדם (כי רק לעתים נדירות ניתן להשיג מגיד לגיד סיבים) כלומר טכניקה זו עשויה שלא להיות נגישה למעבדות מחקר רבות מעוניינים ללמוד תאים שמקורם בשרירים אנושיים. יתר על כן, טכניקת הסיב בודדת מספקת רק מספרים סלולריים מוגבלים מאוד.
כאן אנו מתארים מערכת של מיון המבוסס על genעיכול אנזימטי tle של תאים באמצעות collagenase וdispase אחרי שני סיבובים רצופים של תא מופעל מגנטי מיון (MACS) אשר נותן שני טוהר גבוה (> תאי myogenic 95%) ותשואה (~ 2.8 x 10 6 ± 8.87 x 10 5 תאים / רקמת ז) לניסויים בתרבות. CD56 נחשב סמן משטח תקן זהב לזיהוי של תאי לווין אנושיים באתר 10 ובמבחנה 11 ומספק מועמד סמן משטח האידיאלי עבור קובץ מצורף חרוז. בגישה זו נוגדני CD56 מוצמדים לתחמוצת ברזל וחרוזים פאראמגנטי המכיל פוליסכריד חייב תאים ועבר דרך עמודת הפרדת תא מגנטית גבוהה שיפוע מונחת בשדה מגנטי חזק 12,13. עמודי ההפרדה מלאים במטריצה של תחומים צמר פלדה או ברזל פרומגנטיים המשמשים להתמקד קווי שדה מגנטיים לכיוון פני השטח שלהם יצירת שיפועים חזקים שדה מגנטי (~ 4tesla) 14. בטורים אלה אפילו תאים מעט מגנטיים נמשכים ושנספחו לפני השטח שלהם 14. Unbound (CD56 -) תאים עוברים דרך הטור ואילו + תאי CD56 שכותרתו עם microbeads המגנטי נשמרים עד לסילוקו מהשדה המגנטי 12,15.
השעיות תא מכל שלב של תהליך המיון יכולות להיות מצופים בצפיפות הרצויה לניסויים נוספים. בעקבות התערבות נתון ניתן לזהות את המרכיבים התאיים באמצעות immunocytochemistry, צילם באמצעות שדה רחב או מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal ונותח כמותית באמצעות גישת ניתוח תמונה המאפשרת מדידה אובייקטיבית מהירה של כל התאים שכותרתו בכל תמונת נתונה. במעבדה שלנו יש לנו השתמשתי בגישת מיון immunomagnetic זה כפול ואחרי ניתוח תמונה 16 להפגין CD56 ש-- fibroblasts אדם transdifferentiate בקלות לתוך תאי שומן, תוך תא myogenicים ממוצא הלווין עמיד מאוד בפני המרת adipogenic זה 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: למחקרים שבוצעו במעבדה שלנו כל הנושאים נתנו את הסכמתם בכתב, הודיעה להשתתף וכל הניסויים בוצעו באישור ועדת האתיקה שירות הבריאות הלאומית בבריטניה (ועדת האתיקה מחקר לונדון; התייחסות: 10 / H0718 / 10), ובהתאם ל חוק אדם רקמות והצהרת הלסינקי.
1. הכנה ראשונית לפני ביופסיה של שריר (15 דקות)
- הפוך מדיום גידול שרירי שלד אנושי. לצינור חרוטי 50 מיליליטר סיים סטרילי להוסיף 2.5 מיליליטר של תערובת המוסף, 10 מיליליטר סרום עוברי עגל, אנטיביוטיקה (פניצילין / סטרפטומיצין) וגלוטמין לריכוזים הסופיים הנכונים (טבלת 1) ולאחר מכן למלא את הצינור 50 מיליליטר עם בסיס שרירי שלד בינוני.
- שים 15 מיליליטר של המדיום הבסיסי שרירי שלד בצינור חרוטי 20 מיליליטר סטרילי ולשקול אותו. ברגע ששקל מקום צינור זה על קרח. להשתמש בזה כדי לקבל מדגם שרירים האנושי.
- בעוד צינור 20 מיליליטר להכין 10 מ 'l של פתרון אנזים Collagenase D וDispase השני לריכוז סופי של 2 מ"ג / מיליליטר כל אחד על ידי המסת aliquots מניות של אנזימים אלה במדיום בסיסי שרירי שלד. מסנן לעקר את הפתרון הזה על ידי העברתו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. מניחים תערובת אנזים סטרילי זה באמבטיה החממה או מים על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי להתחמם.
הערה: תערובת זו של אנזימים היא מעט עדינה יותר טריפסין וטוב יותר שומרת על תא כדאיות 17. - מניח בצד צלחת פטרי וזוג אזמלים סטריליים.
2. שריר הביופסיה נוהל (45 דקות -1 שעה)
- לפני גיוס משתתפים, להשיג אישור מלא אתי ואישור נהלים (כוללים חיסונים רלוונטיים לנסיינים) מכל הגופים הרלוונטיים השלטון, הוועדות וספקי שירותי בריאות (לדוגמא, אתי, מוסדי, וכו 'ממשלתית).
- יצירת שדה סטרילי סביב הרגל (למשל, עם גיליונות ניתוח סטרילי)ד לנקות ביסודיות סביב אתר ביופסית האזור עם סוכן חיטוי אנטיבקטריאלי (chlorhexidine).
- לטשטש אתר הביופסיה המוצעת על הרגל של המתנדב על ידי הזרקה המקומית של לידוקאין 2% באזור תת עורי מעל fascia של vastus lateralis שריר.
- לעשות חתך רחב ~ 5 מ"מ באמצעות סכין כירורגית סטרילית דרך העור וfascia ולבצע את הליך ביופסית מחט Bergstrom 18 עם שאיבה נוספת.
- בעזרת מלקחיים סטריליות להסיר את השריר מלומן המחט ולטבול במדיום בסיסי על קרח. להעביר את הרקמה למעבדה לעיבוד נוסף בהקדם האפשרי אם כי ניתן להשיג תאי myogenic קיימא לאחר תקופות 24 שעות או יותר.
- לתחקר את הנושא, לטהר ולאטום את אתר החתך עם רצועות מרובות סטרילי דבק עור-סגר ושמלת הסביבה נקיה מחיידקים עמיד למים עם כיסוי חיצוני.
3. בידוד Ce המבשר-נגזר שרירLLS (1 שעה, 30 דקות)
- הסר את הצינור המכיל מדגם השרירים ולשקול אותו (להפוך את הצינור בטוח הוא יבש על ידי מנגב עם רקמה). לחשב את המשקל של מדגם השרירים על ידי הפחתת המשקל של הצינור המכיל בינוני ומדגם מהצינור המכיל בינוני בלבד.
- לערבל את הפתרון כמה פעמים כדי לשטוף את מדגם השרירים של דם. בואו משקעי השריר בטמפרטורת חדר למשך 30-60 שניות.
- הסר כמעט כל נפח בינוני מהצינור, באמצעות סיוע pipetting אלקטרוני או aspirator הראשון אבל להשאיר כ 2-3 מיליליטר בצינור.
- להפוך את הצינור לצלחת פטרי סטרילית המאפשרת נוזל שנותר לביצוע מדגם השריר למנה; להשתמש באזמל סטרילי כדי לחלץ כל שריר שנותר fragments.Rotate הצלחת לגייס את הנוזל הנותר ולהסיר אותו עם pipette.Remove כל חלקים גלויים של שומן או רקמת חיבור.
- לביופסיות במשקל 100-400 מ"ג, להוסיף 3 מיליליטר של חםפתרון אנזים ואזמלים סטריליים באמצעות לחתוך את מדגם השריר לחתיכות קטנות מאוד (<1-2 מ"מ 3).
- בעזרת פיפטה מיליליטר רחבה נשא 25 לצייר את פתרון שברי שרירים ואנזימים והעברת צינור חרוטי 10 מיליליטר סטרילי. לשטוף את צלחת פטרי עם 3-5 מיליליטר נוסף של collagenase ופתרון אנזים dispase ובעזרת פיפטה 10 מיליליטר קטנה לאסוף את כל שברים שנותרו שריר ומקום בצינור. הנפח המדויק אינו קריטי.
- מניחים את הצנצנת ב37 ° C חממה (או אמבט מים) במשך דקות 60 עם טחינה דקה (10 פיפטה מיליליטר) כל 15 דקות.
- אחרי שעה 1 לסיים דיסוציאציה האנזימטית על ידי תוספת של נפח שווה של מדיום גידול מראש חימם טרי ולהעביר את ההשעיה התא דרך מסנן 100 מיקרומטר כדי להסיר כל פסולת myofibre גדולה. צנטריפוגה פתרון התא המסונן ב657 XG במשך 6 דקות בטמפרטורת חדר (20-25 ג).
- Resuspend התא גלולה 5-7 מיליליטר של מדיום גידול וצלחת בציפוי T-25בקבוק בתרבית רקמה. העבר את הצלחת זה לחממה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך 7 ימים. לשנות את המדיום כל שעה 48. בשלב זה תאי myogenic מאוד קטנים ומעוגלים וקשים להבחין מהתאים שאינם myogenic.
- על שינוי המדיום הראשון, צנטריפוגה supernatant לגלולה כל תאים שאינם חסיד. להשעות מחדש אלה במדיום חדש ומחודש צלחת.
- לאחר 7 ימים בתרבות, להבטיח שרוב תאי myogenic (ופיברובלסטים) צירפו אבל התאים עדיין לא הגיעו למפגש. לטהר את מבשרי myogenic ולבצע MACS פי פרוטוקול שפותח במקור על ידי במעבדות של Gherardi וChazaud 19,20 ועוד שונה על ידי אותנו 5.
4. immunomagnetic חרוז מיון של תאים בהתבסס על ביטוי CD56 (1.5 שעות)
- לאחר 7 ימי שטיפת monolayer התא (אשר בדרך כלל יכילו תאי myogenic 50-60% 5) עם שלושה חילופיםשל פתרון חיץ פוספט טמפרטורת חדר (PBS) כדי להסיר את כל תאים שאינם חסיד שנותרו ופסולת מבידוד.
- Trypinize התאים (0.04% טריפסין בCa 2 + -חינם PBS עם 0.73 mM EDTA) במשך 3 דקות. ברגע שתאים יש מנותקים, להוסיף 5-10 מיליליטר של מדיום גידול שרירי שלד כדי למנוע יתר מערכת העיכול. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב657 XG במשך 6 דקות בטמפרטורת חדר (20-25 ג) וגלול בנפח מתאים של מדיום מלא לספירה.
- רוזן מדגם קטן של ההשעיה התא בשיטה הרצויה (למשל, באמצעות hemocytometer או מכשיר ספירה אוטומטית) ולחשב החל מספר תאים ואת הכדאיות.
- פלייט כמה בארות ב( כלי שיט או גדול יותר במידת צורך) 96 צלחת גם לimmunocytochemical או לזרום אפיון של האוכלוסייה מבוססת cytometry לפני המיון (fibroblasts ותאי myogenic יהיו סוגים הנפוצים ביותר תאים הנוכחיים).
- למודעה ההשעיה התא15 מיליליטר ד של PBS סטרילית לדלל תאים ובינוניים. צנטריפוגה התאים שוב וresuspend אותם 170 μl של טמפרטורת חדר מיון החיץ (BSA 1% בפתרון שטיפת MACS, מעוקר באמצעות עובר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר).
- להוסיף 35 μl של microbeads המגנטי גם המעורב מוצמד לנוגדן ראשוני CD56 (שיבוט AF12-7H3, 130-050-401) לפתרון התא, פיפטה לערבב ולהשאיר לדגירה במשך 15 דקות ב 4 C עם תסיסה עדינה ב נקודת אמצע הדרך.
- לאחר דגירה, לדלל את פתרון התא וחרוז עם 10 מיליליטר של MACS מיון חיץ צנטריפוגות ב 657 XG במשך 6 דקות. Resuspend תאי 1 מיליליטר של חיץ מיון.
- הוסף את מפריד MACs (מגנט) לMACS מחזיק מעמד. היזהר בעת הוספת מגנט לדוכן עקב השדה המגנטי החזק. חריץ בעמודה ולהתאים את המסנן לפני ההפרדה. פיפטה 1 מיליליטר של חיץ מיון דרך המסנן מראש הפרדה ועמודה לשימון.
- Immediatאיליי אחרי זה, לערבב בעדינות את ההשעיה התא ולטפטף כל 1 מיליליטר דרך מסנן Pre-הפרדה ולטור.
- לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם 1 מיליליטר (או 500 μl) של מיון חיץ. לאסוף את התאים-שמר שאינו שעוברים בעמודה על הסוג הראשון בצינור חרוטי סטרילי 50 מיליליטר המכיל כמות קטנה של מדיום גידול. תאים אלה הם CD56 הסוג הראשון - חלק ויהיה מועשרים לfibroblasts רקמת חיבור. אל תתנו לעמודה להתייבש בין שוטף.
- לאחר שטיפות להסיר את מסנן קדם-ההפרדה ולהוסיף 2.5 מיליליטר של חיץ MACS לעמודה. לאחר מכן להסיר באופן מיידי את העמודה מהמגנט ולאסוף את CD56 הסוג הראשון + חלק בצינור 50 מיליליטר חרוטי נפרד על ידי לחיצה על הבוכנה לתוך החלק העליון של העמודה.
הערה: הבוכנה מתאימה מאוד הדוקה לחלק העליון של העמודה ויכולה להיות די מסובך לתפעול; עם זאת, זה חייב להיעשות תוך הטור הוא עדיין full של חיץ, כך נדרשת מהירות. הימנע מדכא על הבוכנה חזקה ומהר מדי. - לפני ציפוי להעריך את הכדאיות של התאים באמצעות, למשל, assay trypan הכחול. לקבוע את אחוז תאי קיימא מתחומים 8 מ"מ x 1 2 ספירה (שני בתי hemocytometer).
הערה: התאים יכולים להיות יחיד או כפול מסודרים בהתאם לטוהר הנדרש. אם נעשה בזהירות תאים אלה לסבול את הליך המיון הכפול היטב וכדאיות היא מאוד גבוהה> 95%. למיון כפול, להגדיר עמודה נוספת, לשמן עם 1 מיליליטר של חיץ מיון ולהמשיך משלב 4.6.- אם הדמיה היא שיש לבצע, תאי צלחת ישירות על coverslips זכוכית ממוקם ב 24 מנות גם 21 ומצופה עם הבחירה שלך של מולקולת ECM עבור קובץ מצורף תא (למשל קולגן או laminin). כאן, להשתמש .1-0.5 מ"ג / מיליליטר קולגן אני (לוח 3).
5. מיון של HumFibroblasts-נגזר שריר מייד לאחר הבידוד.
- כדי לטהר אבות פיברובלסטים מייד לאחר בידוד, להעסיק את הפרוטוקול כאמור בשינויים הבאים:
- מייד לאחר תאי resuspend הבידוד בינוניים מלא ומסנן פעם אחת אף מסננת מיקרומטר תא 100 ולאחר מכן שוב למרות מסננת 40 מיקרומטר. הוסף 5 מיליליטר של PBS וספין ב657 XG במשך 6 דקות.
- Resuspend תאי MACS מיון חיץ דגירה בmicrobeads פיברובלסטים Anti-אדם במשך 15-30 דקות בטמפרטורת חדר.
- השתמש בעמודת LS ומפריד Midi-MACS (לוח 3) ולהתקין המסנן לפני ההפרדה 40 מיקרומטר.
- בצע מיני אחד או שניים בהתאם לטוהר הנדרש, להעביר את התאים בהקדם האפשרי למדיום המכיל סרום, לבצע ספירה, וצלחת החוצה בצפיפות הרצויה
6. Immunocytochemical מכתים (יום 1 ולילה).
- תקןתאים בבארות שלהם על ידי התוספת של נפח שווה של paraformaldehyde 8% בPBS קר כקרח במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה. לאחר מקבע לשאוב 10 דקות ולשטוף פעמיים עם PBS.
- לimmunostain אנטיגנים פני תא, תאי גוש במשך שעה לפחות 1 ב 1% אלבומין בסרום שור (BSA) בPBS ולאחר מכן לבדוק עם הנוגדנים הרלוונטיים העיקריים (לוח 4).
- לאנטיגנים תאיים, permeabilize תאים לאחר קיבוע על ידי תוספת של 0.2% Triton-X 100 ב- PBS עם BSA 1% ונאן 3 (0.01%) במשך 10 דקות, ואז לחסום דגירה עם נוגדנים ראשוניים. לבצע את כל incubations הנוגדן הראשוני לילה בטמפרטורת חדר (או ב 4 מעלות צלזיוס) עם תסיסה עדינה על פלטפורמת נדנדה.
- הסר נוגדן ראשוני מאוגד ולשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS הקר. דגירה של הדגירה שעה 1 עם נוגדנים משני שכותרתו fluorescently מינים ספציפיים (לוח 4) בטמפרטורת חדר.
- לאחר הסרתנוגדנים משני מאוגד, לשטוף תאים עם שלושה חילופים של PBS ולאחר מכן counterstain עם צבע ניאון DNA Hoechst 33342 (1 מיקרוגרם / מיליליטר) פתרון עבור 10 דקות על פלטפורמת נדנדה.
- להדמיה בו זמנית של שני אנטיגנים פני התא ואנטיגנים תאיים, תאי הבדיקה ראשון עם נוגדנים ראשוניים ועד לתא אנטיגנים משטח ואחריו הנוגדנים משני המתאימים שלהם. בשלב הבא, מחדש לתקן את התאים בקור PFA, Permeabilize, בלוק ולדגור עם נוגדנים עיקריים נגד אנטיגנים cytoplasmic או גרעיניים ואחריו הנוגדנים משני המתאימים שלהם.
- לאחר צביעה, להסיר coverslips מהבארות שלהם באמצעות מלקחיים מעוקלים ולשטוף האחורי של coverslip שימוש במים מזוקקים. הנח את תא coverslip להחליק על ירידה של אנטי לדעוך הרכבה סט 22 בינוני בשקופית מיקרוסקופ זכוכית.
7. מכתים השמן האדום O בשילוב עם Immunofluorescent צביעת תאים (2 שעות)
- לחשוףתוכן השומנים של תאים מצופים ב 24 מנות גם על ידי צביעה עם השמן האדום O (1 - ([4 (Xylylazo) xylyl] אזו) -2-naphthol) 5,23. ראשית להכין פתרון מניות של 0.5% (w / v) שמן האדום O על ידי המסת 500 מ"ג של השמן האדום O ב 60 מיליליטר של 99% triethyl-פוספט ו -40 מיליליטר של מים מזוקקים. שמור פתרון זה בטמפרטורת חדר בחושך עד לשימוש.
- ביום של שימוש, להפוך את 36% (w / v) פתרון triethyl-פוספט עבודה, המכיל 12 מיליליטר של פתרון מניות הנפט האדום O ו -8 מיליליטר של מים מזוקקים. סנן את הפתרון הזה באמצעות מספר נייר סינון 42 כדי להסיר את כל המגובש השמן האדום O (שפוגע באיכות תמונה).
- בעדינות לחמם פתרון עובד זה באמבט מים במשך שעה 1 לאחר שהפתרון הוא הסתובב ב1,200 XG במשך 6 דקות. הסר את supernatant ולסנן שוב דרך נייר סינון (מספר 42) ולהעביר צינור 20 מיליליטר טרי.
- לאחר תאים תוקנו, permeabilised וimmunostained, להסיר את PBS ולהוסיף 500 μl של השמן האדום O / Triethyl-phosפתרון phate לבארות במשך 60 דקות. Triton-X בריכוז המשמש כאן לpermeabilisation קרום תא אינו משפיע על תוכן שומנים סלולריים 23.
הערה: השמן האדום O היא נרגשת אורכי גל שבין 540 ו580 ננומטר, ולכן המסנן טקסס-האדום יכול לשמש כדי לזהות פליטת השמן האדום O במיקרוסקופ פלואורסצנטי 23. שים לב כי פליטת הקרינה משמן האדום O לעתים יכולה לדלוף לתוך התעלה הרחוקה אדומה אם תאים מאוד מאוד מוכתמים (תכולת שומן כלומר, גבוהה מאוד). - לאחר דגירה, להסיר עודפי שמן האדום O ולשטוף את התאים חמש פעמים עם 500 μl של PBS. הר coverslips כלimmunostaining כאמור בסעיף 6. זיהוי צבע השמן האדום O על ידי שני brightfield / מיקרוסקופ לעומת השלב או על ידי מיקרוסקופ epifluorescence באמצעות המסנן האדום טקסס (משמרת חופשית, EX BP 560/40, BS FT 585, EM BP 630 / 75, Carl Zeiss).
8. קבלת micrographs ממיקרוסקופ פלואורסצנטי לעוקביםalysis
הערה: ודא שמחליק להשוואת כמותית מגואלות באותו הפתרונות, צולמה בתנאים זהים (לדוגמא, חשיפה, מצלמה והגדרות רכישה וכו ') וכבשו באותה ההפעלה מיקרוסקופ. כל העיצוב שלאחר הרכישה צריך גם להיות זהה ויהיה בהתאם להנחיות קפדניות הציעו לתמונות דיגיטליות 24.
- לרכישת תמונה (מיקרוסקופיה widefield), להפעיל את מקור אור מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולצאת לכמות המומלצת של זמן כדי לאפשר את מקור הקרינה האור להתחמם ולייצב.
- הגדר את הזרם האפל למצלמה על ידי חסימת נתיב האור למצלמה; לרכוש תמונה ברזולוציה מקסימלית ולהשתמש בזה כדי לתקן תמונות שנרכשו לאחר מכן.
- להאיר בדיקות immunofluorescent ידי epifluorescence מועבר על ידי מדריכי אור נוזליים (צינור גמיש של fluoroplastic מלא בשמן סיליקון phenylmethyl)nd אותות דמיינו דרך אדום (מסנן להגדיר 45 HQ טקסס משמרת אדומה חופשי ירוק (מסנן, נקבע 44 משמרת FITC מיוחדת חינם) וכחול (מסנן להגדיר מסננים לעבור להקה חינם) 49 משמרת DAPI על מיקרוסקופ פלואורסצנטי העלית הפוך (10X, 20X, 40X, מתכנן יעדי apochromatic עם 0.25, 0.75, 0.95 פתחים מספריים בהתאמה).
- כדי למנוע הרוויה פיקסל למצוא את החשיפה האופטימלית בטווח ליניארי של הגלאי לכל סמן ניאון באמצעות התכונה 'חשיפת היתר' של תוכנת רכישת תמונה. רשום את החשיפה הסטנדרטית לכל תווית ניאון.
- ללכוד ערוצים בודדים ולשמור בגווני אפור או TIFF pseudocolored (פורמט קובץ תמונה מתויג) קבצי תמונות בעומק סיבית הגבוהה ביותר (רצוי 16 ביט - 65,536 ערכים אפורים) המסופק על ידי מכשיר ההקלטה (למשל מקורר CCD (טעון מכשיר בשילוב) מצויד למיקרוסקופ) . הגדר את רזולוציית התמונה ל1,388 x 1,040 או גבוה יותר. הקפד לכלול סרגל קנה מידה או אובייקט של di הידועmensions בתמונה.
- איפה אפשר לשמור את הקבצים בפורמט 16 ביט מתויג קובץ תמונה (.tiff) ולא בתבנית jpeg כדי למנוע אובדן של מידע 25.
- אם קיים חשש כלשהו על השוויון של תאורה (תוכנה יחד עם מיקרוסקופ יכול להיות תיקון אוטומטי לזה) לקחת תמונה "שטוח שדה 'של coverslip ללא תאים אך מוכתם ורכוב באותו אופן ניסיוני שקופיות כ; זה יכול לשמש גם כדי לתקן את הפגמים תאורת פוסט-רכישה בתוכנת ניתוח תמונה.
- לרכישת תמונה (מיקרוסקופיה confocal), לייעל רווח גלאי וכוח הלייזר עבור כל ניסוי הדמיה (למנוע הרוויה). באופן כללי, את הקרינה שנמדדה היא פרופורציונלית לרמת כוח הלייזר. גודל חריר מוגדר 'אוורירי 1' כדי להשיג יחס אות לרעש הטוב ביותר (רזולוציה משופרת עשוי להיות מושגת על 0.5 אוורירי לאותות חזקים במיוחד). קח חלקים אופטיים ברמות שונות לאורך ציר z דרך הנמליםibody שכותרתו תאים ולשמור הקרנה מקסימלי 16 ביט לכל ערוץ לניתוח תמונה.
9. מדידות ביצוע של שכותרתו fluorescently גורמי שעתוק גרעיניים באמצעות עיבוד תמונה וניתוח תוכנה (מינימום 5 לכל שדה ראיה).
- גישה לקבצי TIFF פרט תמונה וערוצי כיסוי המתאימה על ידי לחיצה וגרירת תמונה אחת לאחרת. אז כל ערוץ יופיע כשכבת נפרדת בלוח השכבות.
- בחר להאיר מתפריט המסנן כדי לאפשר שכבות מתחת להיות דמיינו במקביל. לחלופין, להתאים את האטימות של השכבות העליונים ל -50%.
ניתן לשמור תמונות TIFF עם-זיו-וולש למפל הדחיסה 'lossless' (LZW) נתונים להורדת גודל קובץ ללא אובדן המידע: הערה. - בחלון הניתוח (ניתוח> בחר נתונים נקודות> מותאם אישית), בחר ניתוח ולבחור את המדידות נדרשת (צפיפות משולבת לדוגמא,, אומר density, מעגלי, היסטוגרמה וכו '). לבטל את כל מדידות מיותרות על ידי ביטול סימון בתיבה שלידם. אם מדידות שטח נדרשות בלחיצת מיקרומטר על ניתוח> סט המדידה Scale. כלי השליט באופן אוטומטי יופיע - עקבות אורכו של סרגל קנה המידה ולהיכנס אורכו הידוע במיקרומטרים. לאחר מכן התוכנה תהיה להמיר מדידות שטח למיקרון מרובע.
הערה: אם ניתוח ההיסטוגרמה נבחר, כאשר מדידות נרשמו תיקייה נוספת תופיע (המיקום של מה שיכול להיות שנבחר) עם 8 היסטוגרמות קצת לכל תחום פרט בחירה במיקרוסקופ, כמו גם הסיכום של כל בחירות הפרט (זה תמיד מופיע כהיסטוגרמה-1 אם בחירות מרובות שנעשו). ניתוח זה לא יכול להתבצע על ידי התוכנה בפורמט 16 ביט, אבל הוא שימושי מאוד לבחינת חלוקת עוצמות פיקסל בכל אובייקט של עניין. - לניתוח של עוצמת הקרינה הגרעינית הראשון לבנות representative 'צבע טווח מסכת הבחירה' (CRSM) לHoechst או DNA המוכתם DAPI להגדיר אזור גרעיני. ברגע שתמונות הערוץ הרצוי הם כיסו, רק את שכבת ערוץ Hoechst יש להשאיר לאור על ידי הבטחה של סמל העין 'הסמוך לו בכרטיסיית השכבות נבחרה ולאחר מכן שכבה מסומנת (הופך לכחול), ואילו כל השכבות האחרות צריכה להיות לבטל את הבחירה. ודא נפתחת המיזוג מוגדר חזרה ל'רגיל 'בכרטיסיית השכבות.
- פתח את תיבת הדו-שיח טווח הצבע (בחר> טווח צבע) ולהגדיר את נפתחת אפשרות בחירה ל'צבעי נדגמה '. עם התצוגה המקדימה הבחירה מוגדרת 'מסכה מהירה' (רקע אדום) בחר את כל גווני הצבע הכחולים בתוך הגרעינים על ידי החזקת המקש Shift (סימן '+' מופיע) ולחיצה בתוך הגרעינים באמצעות הכלי טפטפת העין שמופיע.
- אם צלילים לא רצויים נבחרים, להסיר אותם על ידי לחיצה על מקש Alt ('─'sign מופיע) ולחיצהעליהם. לשמור על קנה המידה הטשטוש באפס, כך שגווני צבע רק נבחרו באופן ידני כלולים במדידה ו'אשכולות צבע מותאמים למקום "צריכים להיות נותרו מסומנים.
- להציל CRSM זה לדיסק הקשיח של המחשב כ- ספציפית לתכנית לחלץ קובץ (קובץ .AXT). עם עוד שדה אקראי של גרעינים, עומס, עדכון, ולשמור את CRSM (בחר, טווח צבע, טען). לעשות את זה לפחות חמישה שדות אקראיים כדי להבטיח שבחירות גרעיניות הן נציג.
- השתמש בגרסה צבעונית של תמונה בגווני אפור ליצירת מסכה לבודד את התכונות כי העין האנושית היא יכולת טובה יותר להבחין בין גוונים השונים של צבע מאשר בין גוונים שונים של אפור 26.
- השתמש בCRSM הגרעיני לאזורים גרעיניים מגזר לצביעה. ברגע שהגרעינים שנבחרו לחצו על תמונה> התאמה> סף והזיזו את המחוון כל הדרך לימין, כך שהגרעינים ישחירו. לחלופין,לחץ לחיצה ימנית ובחר 'מלא' ולאחר מכן בחר 'מלא ל: שחור'. לאחר מכן לחץ על בחר> הפוך ועכשיו לחץ על Delete כדי להסיר את כל הרקע (אם האפשרות מופיעה לבחור "למלא ל: לבן '). זה בעצם binarizes התמונה המבוססת על הבחירה שלך. לאחר מכן טען את תוסף קו פרשת מים מכרטיסיית המסננים להפריד גרעינים חופפים (Filter> תמונה בינארי> הפרדת תכונת פרשת מים).
- אם גרעינים רבים חופפים במידה רבה, להסיר את הגרעינים מניתוח על ידי ביטול בחירתם (החזק את מקש Alt ועל רפיון לצייר סביבם עם הכלי לאסו).
- על השכבה הגרעינית עכשיו בינארי, ללכת לבחרו> טווח צבע ו> צללים, כדי לבחור גרעינים בודדים. משמרת אלטרנטיבית אחיזה ולחץ בתוך כל גרעין אחד שחור. כל הגרעינים באופן מיידי שנבחרו. לאחר מכן להעביר את הבחירה לשכבה המכילה צביעת גורם שעתוק גרעיני (למשל myogenin) על ידי בחירת שכבה ושביטול בחירה כלשכבות אחרות. קווים צועדים כעת יציגו את העמדה של גרעינים בערוץ myogenin.
- אם עובד עם תמונות pseudocolored לחץ רק על פלטת הערוצים (מימין לכרטיסיית שכבות) ובחר את הערוץ הירוק בלבד (התמונה תופיע כעת אפורה). לאחר מכן לחץ על תמונה> מצב> Grayscale. אזהרה תופיע "שיטוח שכבות גלויות וזורקי שכבות נסתרות 'אישור לחץ, אז אזהרה נוספת תגיד' להשליך ערוצים אחרים" לחץ על אישור שוב. רק שכבה אחת של גרעינים בגווני אפור שנבחרו עכשיו תהיה נוכחת בלוח השכבות.
- לחץ שיא מדידות ביומן המדידה לקבלת נתונים לגרעינים שנבחרו. אם השכבה להיות מנותחת (למשל myogenin מכתים) הוא כבר תמונת גלם 16 bit גווני אפור ואז פשוט ללחוץ שיא מדידות.
- מדידות נבחרו יצוא כקובץ txt למיקום על פי בחירתך. אז יכולים להיות מעובד אלה נוספים ונותחו בעמ תוכנת טיפול בנתונים האחרackages
הערה: Edit> פקודת צעד אחורה (כל Alt, Ctrl ומקש Z בו-זמנית לעיתונות) משחזרת את כל השכבות הקודמות במידת צורך. - נכון לקרינת רקע ספציפית שאינם 27 לתוצאות להיות כמותי וכמו להשוות מדידות של עוצמת הקרינה הם תמיד תערובת של אות ורקע.
- בחר את כלי הבחירה המרובע ולבדוק "גודל קבוע" לבחור 20 על ידי 20 פיקסלים (או גדולים יותר אם תרצה בכך ובהתאם לconfluency של תאים בתמונה). בעוד מחזיק משמרת לבחור עשרה או יותר תחומים רקע פזורים ברחבי שדה הראייה. "המדידות רשומות" העיתונות ביומן המדידה.
- לחשב את הצפיפות הממוצעת המשולבת (הסכום של כל הערכים האפורים פיקסל) לכל פיקסל של כל 10 אזורי הרקע שנבחרו (ניתן כ'הערך האפור אומר 'ביומן המדידה). להכפיל את צפיפות הרקע הממוצעת לכל פיקסל במספר הפיקסלים באובייקט היעד (
- הקרינה רקע פחת מאובייקטי צפיפות משולבת מקורית להניב הערך המתוקן רקע הסופי. גישה זו מהווה שדה פוטנציאלי לוריאצית שדה בקרינת רקע שאינו ספציפית.
הערה: הוא בעל חשיבות עליונה לבחירת אזורי רקע רק בתום לב כתיקון זה יש השפעה ניכרת על הערכים הסופיים. התקרבות באמצעות זכוכית המגדלת מומלצת בעת ביצוע בחירות.- זה יכול להיות גם שימושי לחלק את הערך הכללי רקע תוקן על ידי האזור של הגרעין בפיקסלים (כמו לקיחת רמה האפורה / עוצמת ממוצעת לגרעין) כדי למזער את השפעה פוטנציאלית של אות רקע מקומית גרעינית שתתרום יותר לצפיפות המשולבת ערך עם עלייה בגודל גרעיני (איור 3 ג).
- הקרינה רקע פחת מאובייקטי צפיפות משולבת מקורית להניב הערך המתוקן רקע הסופי. גישה זו מהווה שדה פוטנציאלי לוריאצית שדה בקרינת רקע שאינו ספציפית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תאי myogenic מטוהרים וfibroblasts יכולים להיות מתורבת במדיום בידול adipogenic במשך שלושה ימים ואחריו בינוני תזונת adipogenic מכל מקום בין 7-30 ימים כדי להעריך את הפוטנציאל שלהם לadipogenesis. שימוש באוכלוסיות התאים המטוהרים, מכתים השמן האדום O בשילוב עם immunostaining עבור סמני שושלת adipogenic וmyogenic הראה כי רק את החלק יחסי פיברובלסטים היה מסוגל בידול adipogenic (איור 2). ההצטברות המסיבית של שומן על ידי fibroblasts היא גלויה לעין בלתי מזוינת (פנל), וtransdifferentiation המלא שלהם מוצגת על ידי הביטוי חזק מאוד של γ PPAR הגרעיני (איור 2 לוחות B & C ואיור 3). על ידי טיפול בימים 15, תאים אלה משחררים את כל שנותר TE-7 (אנטיגן רקמת חיבור) על גבי המצע שלהם (D פנל). לעומת זאת, תאי myogenic לשמור על הפנוטיפ הנורמלי שלהם, כולל ביטוי של desmin ושרירן כבד שרשרת (איור 2 פנלים E & F) ולא upregulate PPARγ הגרעיני (איור 3 ג).
דוגמא לניתוח כמותי של תחום תאי myogenic (+ desmin) מוצגת באיור 3. הלוח ב 'מציג את השדה ניתח, והפנל מראה את עוצמת הקרינה לכמת (לאחר תיקון ברקע). שיטה זו מראה בבירור את הווריאציה של ביטוי myogenin בגרעינים בודדים בנקודה הספציפית צפיפות זריעה והזמן הזה. איור 3 ג ממחיש את התועלת של השיטה כדי להשוות ישירות רמות גורם שעתוק בתאים מסוגים שונים ברמה תא-ידי תאים. כאן אנו מראים כי CD56 - fibroblasts השריר להביע רמה גבוהה של PPARγ גורם שעתוק adipogenic אילו CD56 + תאים ממוינים myogenic לשמור על רמות נמוכות מאוד רק לאחר החשיפה לadipocyte התרמה בינונית.
e = "תמיד"> 
איור 1:. אוכלוסיות מטוהרות של תאי myogenic וfibroblasts מתקבלים על ידי מיון חרוז immunomagnetic (AB) לאחר שבוע אחד בתרבות מסודרים תאי myogenic להביע המולקולה פני תא הידבקות תא CD56 (N-CAM) וdesmin סיבי ביניים השרירים ספציפיים. ביטוי גרעיני קי-67 מספק ראיות לכך שהתאים אלה מתרבים. ההכתמה של קרום, cytoplasmic ומרכיבים גרעיניים מתוארת בצעד פרוטוקול 6.5. תאי myogenic (CD) אינם מבטאים את סמן פיברובלסטים TE-7. Fibroblasts (E) הנגזר משריר אדם להביע TE-7 וטסיות הדם הטרנסממברני (F) α -derived גורם גדילת קולט (PDGFRα). ברים סולם הם: (א) = 20 מיקרומטר; (B, C & E) = 200 מיקרומטר; (D & F) 50 ו# 181;. מ 'אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: CD56-נגזר שריר אדם - / TE-7 + fibroblasts וCD56 + / desmin + תאי myogenic בתרבית adipocyte התרמה בינונית (AIM). Fibroblasts () מבודד על ידי MACS להתמיין adipocytes כאשר בתרבית בadipocyte התרמה בינונית (AIM) ואת זה ניתן לראות בקלות בעין בלתי מזוינת הבא הכתמת השמן האדום O. תאי myogenic להראות שום עדות לבידול adipogenic אחרי אותו פרק זמן בAIM ולהראות הכתמת השמן האדום O מוגבל מאוד. (B & C) HPPARγ fibroblasts המופק משריר האומן המפורש ביותר וCEBPα (לא מוצג) לאחר התרבות בAIM. (ג) כfibroblasts להתמיין adipocytes הם משחררים נותרו חלבון ECM תאיים אשר מהווה רשת צפופה סביבם. (E) תא myogenic לשמור myogenic מורפולוגיה וביטוי של סמני שושלת כגון desmin ושרשרת (F) שרירן כבד (MHC), סמן של בידול myogenic מסוף, ולא מצליחים לצבור שומנים. ברים סולם הם: (B, D) = 200 מיקרומטר (E, F) = 100 מיקרומטר; (ג) = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: נתונים שהתקבלו לדוגמא fr אום immunolabelled תרבויות בשיטת ניתוח תמונה שתוארה (הגישה מורחבת Adobe Photoshop). (א) עלילת תא-ידי תאי הקרינה בעוצמה לשריר myogenin גורם שעתוק גרעיני הספציפי לאחר 24 שעות במדיום בידול חופשי בסרום. (ב) micrographs נציג desmin + / myogenin + מבשרי myogenic אנושיים. ברים סולם הם: (B) = 50 מיקרומטר (C) עוצמת הקרינה PPARγ בגרעינים בודדים מCD56 + / desmin מסודרים + אוכלוסיות myogenic (CD56 +) וCD56 - / TE-7 + / PDGFRα + / קולגן VI + תאים (CD56. -) לאחר התרבות בadipocyte התרמה בינונית למשך 15 יום. ערכי הקרינה היו מנורמלים לאזור הגרעיני כדי לפצות על סטיות בגודל גרעיני בין שני סוגי התאים. פסים שחורים אופקי ב (א) ו- (ב) מראים את הממוצע.52,049 52049fig3large.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| רכיבים בינוניים | ריכוז | קטלוג לא. | מקור מסחרי |
| בינוני שלד אנושי צמיחת שריר: | C-23,060 (מגיע "מוכן לשימוש" המכיל את כל הגורמים שצוין) | ||
| בינוני בסיסי שרירי שלד | - | PromoCell | |
| עוברי עגל בסרום | 15% | PromoCell (5%) וFCS זהב, PAA Laboratories (10%) - חתול לא. A15-151 | |
| Fetuin (שור) | 50 מיקרוגרם / מיליליטר | PromoCell | |
| גורם אפידרמיס צמיחה | 10 ng / ml | PromoCell | |
| גורם גדילה פיברובלסטים בסיסית (אדם רקומביננטי) | ng 1 / ml | PromoCell | |
| דקסמתזון | 0.4 מיקרוגרם / מיליליטר | PromoCell | |
| אינסולין (אנושי רקומביננטי) | 10 מיקרוגרם / מיליליטר | PromoCell | |
| פֵּנִיצִילִין | 100 U / ml | Sigma | |
| סטרפטומיצין | 100 מיקרוגרם / מיליליטר | Sigma | |
| L-גלוטמין | 292 מיקרוגרם / מיליליטר | Sigma | |
| בינוני בידול myogenic | C-23,260 | ||
| בינוני בסיסי שרירי שלד | - | PromoCell | |
| פֵּנִיצִילִין | 100 U / ml | Sigma | |
| סטרפטומיצין | 100 מיקרוגרם / מיליליטר </ Td> | Sigma | |
| הערה: PromoCell, היידלברג, גרמניה; סיגמא אולדריץ חברת בע"מ, דורסט, בריטניה | |||
טבלת 1: רכיבי תקשורת ותרבות תא וריכוזים.
| הרכב בינוני | ריכוז | קטלוג לא. | חברה |
| בינוני Preadipocyte צמיחה | C-27,410 (מוכן לשימוש) | ||
| עוברי עגל בסרום | 0.05 מיליליטר / מיליליטר | PromoCell | |
| תוספת צמיחת תאי האנדותל | 0.004 מיליליטר / מיליליטר | PromoCell | |
| אפידרמיס Growth Factor (אנושי רקומביננטי) | 10 ng / ml | PromoCell | |
| פֵּנִיצִילִין | 100 U / ml | Sigma | |
| סטרפטומיצין | 100 מיקרוגרם / מיליליטר | Sigma | |
| גלוטמין | 292 מיקרוגרם / מיליליטר | Sigma | |
| D-ביוטין | 8.0 מיקרוגרם / מיליליטר | PromoCell | |
| אינסולין (אנושי רקומביננטי) | 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר | PromoCell | |
| דקסמתזון | 400 ng / ml | PromoCell | |
| IBMX | 44 מיקרוגרם / מיליליטר | PromoCell | |
| L-Thyroxine | 9 ng / ml | PromoCell | |
| Ciglitazone | 3 מיקרוגרם / מיליליטר | PromoCell | |
| פֵּנִיצִילִין | 100 U / ml | Sigma | |
| Streptomycin | 100 מיקרוגרם / מיליליטר | Sigma | |
| גלוטמין | 292 מיקרוגרם / מיליליטר | Sigma | |
| בינוני בידול Preadipocyte | C-27436 (מוכן לשימוש) | ||
| D-ביוטין | 8.0 מיקרוגרם / מיליליטר | PromoCell | |
| אינסולין (אנושי רקומביננטי) | 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר | PromoCell | |
| דקסמתזון | 400 ng / ml | PromoCell | |
| IBMX | 44 מיקרוגרם / מיליליטר | PromoCell | |
| L-Thyroxine | 9 ng / ml | PromoCell | |
| Ciglitazone | 3 מיקרוגרם / מיליליטר | PromoCell | |
| פֵּנִיצִילִין | 100 U / ml | Sigma | |
| Streptomycin | 100 מיקרוגרם / מיליליטר | Sigma | |
| גלוטמין | 292 מיקרוגרם / מיליליטר | Sigma | |
| בינוני תזונת adipocyte | C-27,438 (מוכן לשימוש) | ||
| D-ביוטין | 8.0 מיקרוגרם / מיליליטר | PromoCell | |
| אינסולין (אנושי רקומביננטי) | 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר | PromoCell | |
| דקסמתזון | 400 ng / ml | PromoCell | |
| פֵּנִיצִילִין | 100 U / ml | Sigma | |
| סטרפטומיצין | 100 מיקרוגרם / מיליליטר | Sigma | |
| גלוטמין | 292 מיקרוגרם / מיליליטר | Sigma | |
| הערה: PromoCell, היידלברג, גרמניה; סיגמא אולדריץ חברת בע"מ, דורסט, בריטניה | |||
טבלה 2: הרכב של תקשורת בתרבות תא adipogenic.
| שם ציוד / מגיב | חברה | קטלוג לא. | תגובות / תיאור |
| תרבית תאים | Collagenase D | רוש | 11088866001 |
| Dispase השנייה | Sigma | D4693-1G | חייב להיות מעוקר מסנן לפני השימוש |
| טריפסין / EDTA | (Gibco) Invitrogen | 15400-054 | |
| מסננת תא 100 מיקרומטר | BD Biosciences | 352,360 | |
| פתרון קולגן (3 מ"ג / מיליליטר ב 0.1% חומצה אצטית) | Sigma, דורסט, בריטניה | C8919 | |
| מסנן Minisart SRP15 מזרק (0.2 מיקרומטר) | Sartorius | 17573ACK | Polytetrafluorethylene קרום (PTFE) |
| Microbeads אדם CD56 | Miltenyi ביוטק | 130-050-401 | Cell מגנטים-מיון הפעיל (MACS) להיות מודעים לחיי המדף המוגבל של microbeads |
| Microbeads פיברובלסטים אנטי, אדם | Miltenyi ביוטק | 130-050-601 | |
| 40 מיקרומטר מסנני Pre-הפרדה | Miltenyi ביוטק | 130-041-407 | |
| Collumns הסלולרי הגדול | Miltenyi ביוטק | 130-042-202 | עמודים אלו מגיעים עם זרימת נגד. שימוש בזרימת הנגד אינו הכרחית כדי להשיג את purities myogenic הגבוה שתואר כאן. |
| LS עמודות | Miltenyi ביוטק | 130-042-401 | |
| MiniMacs seperator | Miltenyi ביוטק | 130-042-102 | מפריד זה מתאים טור הגדול תא אבל לא טור LS. |
| MidiMACS | Miltenyi ביוטק | 130-042-302 | |
| multistand MACS | Miltenyi ביוטק | 130-042-303 | |
| BSA | Sigma | חייב להיות מעוקר מסנן לפני השימוש | |
| שמן האדום O | Sigma | O0625 | כתמי שומנים |
| פוספט Triethyl | Sigma | 538,728 | |
| Whatman נייר | Sigma | Z241121-1PAK | מס '42, Ashless. כדי להכין את המסנן לקפל נייר סינון העגול כדי להפוך את המעגל למחצה, ואז לקפל חצי המעגל במחצית שוב כדי ליצור צורה חרוט. התאם את החרוט לתוך משפך לסינון. |
| הרכבה | |||
| להאריך זהב Antifade מגיב | בדיקות מולקולריות, Invitrogen | P36930 | זה ניתן לרכוש עם או בלי DAPI ולא להרוות את הקרינה ראשונית. |
| AxioVision | Carl Zeiss | צור קשר עם Zeiss | תוכנת aquisition התמונה |
| Adobe Photoshop CS5 Extended | Adobe (שנרכש מPugh מחשבים) | ADPH16982 * | תוכנת ניתוח תמונה |
לוח 3: ציוד וחומרים כימיים.
| שם / אנטיגן | מינים ואלוטיפ נוגדן | שם Clone | דילול לשימוש | קטלוג לא. | |
| סמני myogenic: | |||||
| CD56 (N-CAM) | העכבר mc IgG 1 | MY-31 | (1: 100) | 347,740 | BD |
| Desmin | IgG mc ארנב 1 | D93F5 (XP) | (1: 250) | 5332S | חוד |
| Myogenin | העכבר mc IgG 1 | F5D | (01:50) | F5D | DSHB |
| שרשרת שרירן כבדה | עכבר mc IgG2b, שרשרת קאפה אור | MF20 | (1: 200) | MF20 | DSHB |
| פיברובלסטים / חיבור | |||||
| סִיסמני ssue: | |||||
| פיברובלסטים אנושיים אנטי | העכבר mc IgG 1 | TE-7 | (1: 100) | CBL271 | Millipore |
| PDGFRα | ארנב mc IgG | D13C6 | (1: 500) | 5241 | חוד |
| סמני שגשוג: | |||||
| Ki67 | ארנב mc IgG | SP6 | (1: 200) | MP-325-CRM1 | MD |
| Adipogenic | |||||
| גורמי שעתוק: | |||||
| PPARγ | העכבר mc IgG 1 | E8 | (1:20) | SC-7273 | ביוטכנולוגיה סנטה קרוז |
| מפתח: mc: חד שבטי,מחשב: polyclonal, DSHB: בנק Hybridoma התפתחותית לימודים, ארה"ב איווה; | |||||
| חוד: ניו BioLabs אנגליה, בריטניה; MD: אבחון א Menarini, בריטניה; BD: BD Bioscience, בריטניה. | |||||
לוח 4: נוגדנים ראשוניים.
| Antigen | מינים ואלוטיפ נוגדן | דילול | קטלוג לא. | חברה |
| Alexafluor488 | עיזים אנטי העכבר IgG (+ H L) | 1: 1000 | -11001 | MP |
| Alexafluor 594 | עיזים אנטי העכבר IgG (+ H L) | 1: 1000 | -11005 | MP |
| Alexafluor 594 | עז נגד הארנב IgG (L H +) | 1: 1000 | -11,012 | MP | </ Tr>
| מפתח: L H + = כבדות וקלות רשתות; MP: בדיקות מולקולריות, Life Technologies Invitrogen, פייזלי בריטניה | ||||
לוח 5: נוגדנים משניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שתארנו הליך מיון immunomagentic להעשרה סלקטיבית של מבשרים המופק משריר אנושיים מדגימות קטנות של חומר ביופסיה של שריר. טכניקה זו כבר לא יסולא בפז במעבדה שלנו להתגברות על האובדן של תרבויות המופק משריר האנושיים לfibroblasts, אלא גם להבנת ההתנהגות הייחודית של אוכלוסיות שונות של אבות-נגזר שריר. תאי myogenic ברגע מטוהרים יכולים להיחקר על שינויים בחלבון ו / או ביטוי גנים, או המשמשים לניסויים במורד הזרם.
בנוסף לטיהור תא אנחנו גם פירוט שיטה מהירה ופשוטה של ניתוח אזורים ספציפיים של העניין בmicrographs ממיקרוסקופ פלואורסצנטי. תמונות דיגיטליות ממיקרוסקופ פלואורסצנטי מכילות שפע של מידע עבור ביולוגים של תא כדי לחלץ; אכן פיקסלים להחזיק נתונים שאינו בהכרח אפשר להבחין לעין האנושית. בעזרת טכניקה זו, ניתן לקבל נתונים כמותיים על מספר גדול של תאים בודדים באוכלוסייה. תכונה ייחודית של ניתוח תמונה בהשוואה לזרימת cytometry היא היכולת לתאם שינויים בביטוי חלבונים עם שינויים באינטראקציות orcell תאי צורת תא. יתר על כן, את היכולת ליצור ולשמור מסכות בחירה מותאמות ונציג מאפשרת מדידות מהירות, מדויקות ושחזור להתבצע על פני תחומים רבים של נוף ובכך להפחית את הפוטנציאל להטית משתמש.
טיהור תא מבוסס MACS
אחד יתרונות של שיטה זו הוא שתאים יכולים להיות מטוהרים בהצלחה או מייד לאחר בידוד או אחרי כמה ימים בתרבות (כאשר התשואה תהיה גבוהה יותר).
באופן מכריע, לא צריכים להיות מותר תאי myogenic להפוך מחוברות לפני המיון כי זה פוגע במעברם דרך העמודה, ויקטינו את חלקם של תאי שגשוג שהושגו להרחבה וניסויים נוספים.
t "> בהתאם לדגימת הרקמה הראשונית שהתקבלה, ייתכן שיש מספר גבוה של אריתרוציטים שאינם חסיד בתרבות, בשלב זה. שיטות קיימות לסלקטיבי אריתרוציטים lyse, עם זאת, כדי למנוע כל מתח כימי מיותר לתאים שמקורם בשרירים זה צעד הוא נמנע. יש לנו לא נצפה כל השפעה שלילית בולטת של אריתרוציטים בתרבות המוקדמת של תאים שמקורם בשרירי אדם, ואריתרוציטים אלה יוסרו על ידי שינויים בתקשורת פעם תאי myogenic לצרף.שיטות אחרות של ניתוק תא רק לפני המיון (למשל, פרוטאזות אחרות עדינות או שיטות המבוססות EDTA) עשויות לשמש לתאים בהם הביטוי לאנטיגן השטח פני התא הוא נמוך או רגיש במיוחד לעיכול tryptic. הביטוי של CD56 על תאי myogenic אנושיים הוא חזק ועמיד בפני trypsinsation קצר (כאשר assayed עם הנוגדנים שתוארו כאן).
חשוב שחיץ המיון מכיל EDTA לעכב calcium תלוי הידבקות תא-תא; זה הנו קריטי להשגת (ושמירה) השעיה תא בודד למיון. בהתאם למספר התא, צורה וגדלים להיות מסודרים, יש בחירה שנעשתה בקשר עם העמודה המפרידה (ראה טבלה 3).
הסרת העמודה מהשדה המגנטי לשחרר תאים נשמרים יכולה להיות מסובכת כל כך להבטיח שצינור האיסוף (גם אם חצאית) ממוקם בבעל ממוקם קרוב מאוד לטור כדי למנוע אובדן של תאים במעבר.
למרות שיש לנו תארנו טכניקה זו לשימוש עם תאים ראשוניים אדם משרירי שלד, פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לסוגי תאים אחרים שסמן על פני קרום תא ספציפי / ייחודי ידוע. יתרונות נוספים כוללים את העובדה שההליך כולו יכול להתבצע בסביבת העבודה סטרילית של זרימה למינרית. כמו כן, הליך MACS הוא עדין על התאים בהשוואה לFACS מיון בגלל נמוךכוחות גזירה ויכולים להיות יתרון מסוים לתאים גדולים יותר. חרוזים המגנטיים המשמשים הם קטנים, שאינם רעילים ומתכלים בתרבות. ואכן, MACS יושם בהצלחה לטיהור והמחקר של מספר סוגי תאים אחרים.
מגבלה אחת של שיטה זו היא כי MACS לא יכול בקלות להתבצע עבור סמנים מרובים בו זמנית. כמו כן, הסכום של סמן וגודל של תאים לא ניתן הוברר במהלך תהליך המיון, רק לאחר מכן.
שיקולים לייעול רכישת תמונה וניתוח
שיטת ניתוח התמונה הפגינה כאן מספקת כלי רב עוצמה כדי להבהיר שינויים ברמת הביטוי של חלבונים על בסיס תא-ידי תאים באוכלוסיות גדולות של תאים. על ידי ניצול מסכות מתקן שכבות ובחירה בחבילת תוכנה הופצה בתפוצה רחבה, הנסיין יכול לבחור באופן אובייקטיבי אותות ניאון שונים ברחבי מספר רב של תמונות, כדי לאפשרכימות של תכונות אישיות, וכל מספר של רכיבים בתוכם. אנחנו השתמשנו בהצלחה בשיטה זו כדי לכמת ולהשוות ישירות את טווח ביטוי גורם שעתוק באוכלוסיות תאים שונים נחשפו לאתגר adipogenic.
כל ערוץ הקרינה (המייצג סמן ספציפי) יכול להיות כל הזמן נפרד מאחרים ולהפעיל או לכבות כנדרש, אשר הוא שימושי עבור ניסויי immunolabelling צבע רב.
מספר גורמים יש לקחת בחשבון בעת שניסיתי לחלץ נתונים כמותיים וחצי כמותית ממיקרוסקופ פלואורסצנטי 28. תשומת לב לאלה יאפשר מדידות חצי כמותית בסיסיות להתבצע. לעתים קרובות חוקרים רוצים להשתמש במספר fluorochromes לתייג חלבונים שונים של עניין; חשיבות עליונה הוא היכולת להיות מסוגל להבחין בין ספקטרום פליטה הבודד. ברוב המקרים זו מושגת על ידי excitat סלקטיביתיון אחד בלבד fluorochrome בכל פעם. עם זאת, אם ספקטרום פליטה ו / או עירור חפיפה משמעותי או כראוי מסונן אז לדמם דרך או הצטלבות עלול לפגוע במידת הדיוק של נתוני התמונה שהתקבלו. לדמם דרך הוא המעבר של פליטת הקרינה בערוץ גילוי בלתי הולם והיא נגרמת על ידי חפיפה של ספקטרום הפליטה 29,30.
כמה נקודות לשקול הם: בחירת fluorochromes שיש לי עירור גם נפרד וספקטרום פליטה, באמצעות אורכי גל עירור מאוד סלקטיבית (כפי שמושג על ידי לייזרים במיקרוסקופיה confocal), על מנת להבטיח שמערכות סינון פליטה מחמירות מספיק כדי לכלול אורכי גל לא רצויים, וביצוע הדמיה ססגוניות על הארוך ביותר (כלומר, "האדום ביותר") צבע פליטת שיא גל הראשון כדי להסביר את העובדה שספקטרום קליטה בדרך כלל מוטים לכיוון אורכי גל קצר יותר (אור הכחול) ואילו ספקטרום פליטה מוטה כלפי wavel עודengths (אור אדום). הספקטרום של תוויות הניאון זמין ב'הקרינה Spectraviewer 'הניתן על ידי Invitrogen.
השימוש ביעדי איכות גבוהות הוא קריטי עבור תמונות המיועדות לניתוח. צמצם מספרי גבוה (> 1.3) הוא הטוב ביותר והגדלה צריכה להיות מותאמת למצלמה במיקרוסקופיה widefield. בשני מיקרוסקופיה widefield וconfocal, NA הוא קריטי, כמו ברזולוציה z משפר כפונקציה של הצמצם המספרי בריבוע 29. איפה לעשות שימוש אפשרי של עדשות תכנית-apochromatic אשר תיקנו עבור שני סטיות כדוריות וכרומטית 29. שימוש במדריכי אור נוזליים מומלץ מאוד כפי שהם להפחית תאורה אחידה ידי ערבול תאורת המקור כדי להפחית לכידות מרחב ובזמן לפני כניסתו למיקרוסקופ מטרת 29.
זה חשוב כדי למנוע הרוויה של תמונות, כמו פיקסלים רוויים לא יכולים להיות quantifi כראויאד בשל גזיזה של מידע ברמה האפורה האינטנסיבית ביותר ערכי 26.
"תוספים" שונים עשויים להיות זמינים כדי לאפשר הליכי תיקון שטוח שדה מבוצע בקלות יחסית; לדוגמא ד"ר ג'ון ג ראס עשה רבים מאלה מקוונים הזמינים בחינם (http://www.drjohnruss.com/download.html). שימוש זה תוסף יחס הבהירות של כל פיקסל במיקרוסקופ הניסיוני למתאים אחד בתמונה להתייחסות מחושב ומחליף את המקור. אז התוצאות בקנה מידה כדי למלא את טווח הבהירות של התמונה. לחלופין, מחשבון התמונה של ImageJ הוא אמצעי נוסף לתיקון לתאורה אחידה.
עבור חלק מניתוח תמונה, מיקרוסקופיה confocal עשויה להיות השיטה של בחירה כפי שהוא מונע הקרינה מחוץ לפוקוס מלהגיע הגלאים 29. עם זאת, גישה זו יכולה לקחת באופן משמעותי יותר ממיקרוסקופ פלואורסצנטי widefield, המגבילה את התחושהאה של שדות בודדים מבט שניתן להשיג בפגישה אחת.
לאחרונה שיטות אחרות כבר דיווחו להעשרת תאי myogenic מרקמת שריר אנושית. 31 Bareja השתמש בשילוב של דלדול MACS (ל: CD11b, CD31, CD34 וCD45) ואחריו FACS לסלקציה חיובית של CXCR4 + / CD56 + תאי myogenic. עם זאת, למרות שהליך זה היה מסוגל לייצר אוכלוסיית myogenic מועשרת, זה הרבה ממושך יותר מאשר בשיטה המפורטת כאן, מכיל הרבה יותר שלבים ותוצאות בתשואה נמוכה של תאי myogenic המטוהרים נמוכים יותר לכל גרם של רקמה ברציפות.
במחקר נוסף, קסטיליוני 32 תאים הקשורים myofibre מבודדים משרירים עובריים אנושיים על ידי FACS באמצעות סמנים מרובים, והראו כי CD34 - / CD56 + / Pax7 תאים + (תאי לווין ארכיטיפי) יכולים להציג osteogenic כמו גם potenti שושלת myogenicאל, אבל באופן כללי עם העבודה שלנו לא מראה פוטנציאל adipogenic. מחברים אלה הראו גם כי CD34 + / PAX7 - התאים היו בלתי myogenic, אבל היו מסוגל בידול adipogenic ועצמות. העשרת ביטוי CD90 (סמן של fibroblasts שרירים 33) בCD34 + חלק בלתי myogenic מצביעה על כך שחלק גדול מתאים אלה יכול להיות fibroblasts היה, אשר הוכח להיות המקור העיקרי של תאי שומן בשרירי שלד אדם בוגרים תרבויות (התייחסות 5 ואיור 2). אם fibroblasts המופק משריר יש גם כתבי פוטנציאל התמיינות osteogenic חקירה נוספת.
בניגוד לשיטה של קסטיליוני 32, השיטה שלנו דורשת רק אחד נוגדן (בניגוד ל7) כדי להשיג reproducibly תשואות גבוהות של תרביות תאי myogenic טהורות וניתן לבצעו במהירות בתוך התנאים אספטיים של זרימה למינרית. Methodologica נוסףהבדל l הוא שמחברים אלה בודדו תאים ישירות משריר ניתק ולאחר מכן ואחרי אלה בתרבות, ואילו אנו לרוב תאי תרבות לשבוע 1 לפני המיון והטיפוח. בידיים שלנו גישה זו היא טוב יותר נסבלת על ידי התאים. חשוב לציין, זמן הכולל בתרבות הוא למעשה שווה ערך בין שתי הגישות. יתר על כן, בהתחשב בכך ששרירים שלד של העובר עובר hyperplasic והשרירים hypertrophic צמיחת 34 אין זה מפתיע שהתשואה של מבשרי myogenic גדולה מרקמת שריר בעובר בהשוואה לשריר מבוגר
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | Must be filter sterilized before use |
| Trypsin/EDTA | (Gibco) Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 μm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Sigma, Dorset, UK | C8919 | |
| Minisart SRP15 syringe filter (0.2 μm) | Sartorius | 17573ACK | Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane |
| CD56 human Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-050-401 | Be aware of the limited shelf life of microbeads |
| Anti- fibroblast Microbeads, human | Miltenyi Biotech | 130-050-601 | |
| 40 μm Pre-separation filters | Miltenyi Biotech | 130-041-407 | |
| Large Cell Collumns | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here. |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MiniMacs Seperator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | This separator fits the large cell column but not the LS column. |
| MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| BSA | Sigma | Must be filter sterilized before use | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Triethyl phosphate | Sigma | 538728 | |
| Whatman Paper | Sigma | Z241121-1PAK | No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Molecular Probes, Invitrogen | P36930 | This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence. |
| AxioVision | Carl Zeiss | Contact Zeiss | |
| Adobe Photoshop CS5 Extended | Adobe (purchased from Pugh Computers) | ADPH16982* |
References
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibres. J. Cell Biol. 9, 493-495 (1961).
- Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J. Appl. Physiol. 91, 534-551 (2001).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and the Muscle Stem Cell Niche. Physiol. Rev. 93, 23-67 (2013).
- Alsharidah, M., et al. Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture. Aging Cell. 12, 333-344 (2013).
- Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. Human skeletal muscle fibroblasts, but not myogenic cells, readily undergo adipogenic differentiation. J. Cell Sci. 126, 5610-5625 (2013).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138, 3625-3637 (2011).
- Webster, C., Pavlath, G. K., Parks, D. R., Walsh, F. S., Blau, H. M. Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter. Exp. Cell Res. 174, 252-265 (1988).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. J. Vis Exp. , e50074 (2013).
- Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric Self-Renewal and Commitment of Satellite Stem Cells in Muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
- Mackey, A. L., et al. Assessment of satellite cell number and activity status in human skeletal muscle biopsies. Muscle a d Nerve. 40, 455-465 (2009).
- Stewart, J. D., et al. Characterization of proliferating human skeletal muscle-derived cells in vitro: Differential modulation of myoblast markers by TGF-β2. J. Cell. Physiol. 196, 70-78 (2003).
- Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11, 231-238 (1990).
- Clarke, C., Davies, S. Ch. 2. Methods in Molecular Medicine. Metastasis Research Protocols. Brooks, S. A., Schumacher, U. 58, Humana Press. 17-23 (2001).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
- Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).
- Agley, C. C., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. An Image Analysis Method for the Precise Selection and Quantitation of Fluorescently Labeled Cellular Constituents: Application to the Measurement of Human Muscle Cells in Culture. J. Histochem. Cytochem. 60, 428-438 (2012).
- Danoviz, M., Yablonka-Reuveni, Z. Ch. 2. Methods in Molecular Biology. Myogenesis. DiMario, J. X. 798, Humana Press. New York, NY. 21-52 (2012).
- Bergström, J. Muscle electrolytes in man. Determined by neutron activation analysis on needle biopsy specimens. A study on normal subjects, kidney patients, and patients with chronic diarrhoea. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 14, 7-100 (1962).
- Chazaud, B., et al. Satellite cells attract monocytes and use macrophages as a support to escape apoptosis and enhance muscle growth. The Journal of Cell Biology. 163, 1133-1143 (2003).
- Abou-Khalil, R., et al. Autocrine and Paracrine Angiopoietin 1/Tie-2 Signaling Promotes Muscle Satellite Cell Self-Renewal. Cell Stem Cell. 5, 298-309 (2009).
- Timpl, R., Kvonder Mark, Role of laminin and fibronectin in selecting myogenic versus fibrogenic cells from skeletal muscle cells in. 117, 628-635 (1986).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. Fluorescence microscopy. Nat Meth. 2, 910-919 (2005).
- Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem. Cell Biol. 116, 63-68 (2001).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166, 11-15 (2004).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: Focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
- Johnson, J. Not seeing is not believing: improving the visibility of your fluorescence images. Mol. Biol. Cell. 23, 754-757 (2012).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
- Pawley, J. The 39 steps: A cautionary tale of quantitative 3-D fluorescence microscopy. Biotechniques. 28, 884-887 (2000).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
- Brown, C. M. Fluorescence microscopy - avoiding the pitfalls. J. Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).
- Bareja, A., et al. Human and Mouse Skeletal Muscle Stem Cells: Convergent and Divergent Mechanisms of Myogenesis. PLoS ONE. 9, e90398 (2014).
- Castiglioni, A., et al. Isolation of Progenitors that Exhibit Myogenic/Osteogenic Bipotency In by Fluorescence-Activated Cell Sorting from Human Fetal Muscle. Stem Cell Reports. 2, 560 (2014).
- Fukada, S. -i, et al. CD90-positive cells, an additional cell population, produce laminin α2 upon transplantation to dy3k/dy3k mice. Exp. Cell Res. 314, 193-203 (2008).
- Stickland, N. Muscle development in the human fetus as exemplified by m. sartorius: a quantitative study. J. Anat. 132, 557-579 (1981).
