Abstract
Reparation och förnyelse av skelettmuskulatur kräver verkan av satellitceller, som är de bosatta muskelstamceller. Dessa kan isoleras från mänsklig muskelbiopsiprover med enzymatisk nedbrytning och deras myogena egenskaper som studerats i kulturen. Kvantitativt de två huvud vidhäftande celltyper som erhållits från enzymatisk nedbrytning är: (i) satellitceller (benämnda myogena celler eller muskel prekursorceller), identifierade ursprungligen som CD56 + och senare som CD56 + / desmin + celler och (ii) muskel- härledda fibroblaster, som identifierats som CD56 - och TE-7 +. Fibroblaster föröka mycket effektivt i kulturen och i blandade cellpopulationer dessa celler kan överskridande myogena celler att dominera kulturen. Isoleringen och reningen av olika celltyper från människans muskler är därför en viktig metodologisk övervägande när man försöker utreda medfödda beteende antingen celltyp i kultur. Här Descr viIbe ett system för sortering baserad på den milda enzymatisk nedbrytning av celler med användning av kollagenas och dispas följt av magnetisk aktiverad cellsortering (MACS) som ger både en hög renhet (> 95% myogena celler) och gott utbyte (~ 2,8 x 10 6 ± 8,87 x 10 5 celler / g vävnad efter 7 dagar in vitro) för försök i odling. Detta synsätt bygger på inkubering av blandade muskel-härledda cellpopulation med magnetiska mikrokulor kulor konjugerade till en antikropp mot CD56 och därefter passerar celler men ett magnetfält. CD56 + celler bundna till mikropärlor behålls av området medan CD56 - celler passerar obehindrat genom kolonnen. Cellsuspensioner från något skede av sorteringsprocessen kan pläteras och odlas. Efter en given ingripande, cellmorfologin, och uttrycket och lokalisering av proteiner, inklusive kärntranskriptionsfaktorer kan kvantifieras med hjälp av immunofluorescens märkning med specifika antikroppar och en bild processing och analyspaketet.
Introduction
Reparation och förnyelse av skelettmuskulatur kräver åtgärd av satellit celler 1, de myogena stamceller 2,3. In vivo dessa celler finns i ett reversibelt vilotillstånd belägen mellan sarcolemma och basala lamina varje myofibre, men att aktiveras för att föröka sig, säkring och differentiera som muskelvävnad är skadad, repareras och regener 3. Satellit celler kan isoleras från unga och äldre människans muskelbiopsiprover med enzymatisk spjälkning 4 och deras myogena egenskaper kan därefter studeras i primär kultur 5. Effektiviteten i denna isolering process när det gäller både utbytet och renheten av cellpopulationen beror på vilka metoder som används och kan variera från prov till prov. De två viktigaste vidhäftande celltyper som erhållits från enzymatisk nedbrytning är satellitceller (numera benämnda myogena celler eller muskel prekursorceller), identifierade ursprungligen som CD56 + / desmin celler och muscle-härledda fibroblaster, som identifierats som CD56 - och TE7 + celler 5. Fibroblaster har en snabb proliferativ takt och inte genomgår irreversibel tillväxt gripande och terminal differentiering vid cell-cellkontakt som myogena celler; alltså i blandade populationer, kan fibroblaster överskridande myogena celler att dominera kulturen.
Fibroblaster har ofta setts som en irritation för muskel biologer, men det finns nu ett växande intresse för fibroblaster som celler värdig studien i sin egen rätt, särskilt som de har visat sig ha en samarbetsvillig roll med myogena celler under muskel reparation 6 . Isoleringen och reningen av olika celltyper från människans muskler är därför en viktig metodologisk övervägande när man försöker utreda medfödda beteende båda celltyperna i kultur. Fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS) är en metod genom vilken celler kan sorteras för vidare studier och / eller räknas ochanalyseras. FACS har visat sig tillförlitligt berika mänskliga myogena celler, men utbytet av celler för efterföljande kultur har hittills inte varit hög 7. Med tanke på den begränsade efterföljare av somatiska celler som satellit cell härledda myogena celler och de mycket fattiga proliferation och differentiering i samband med åldrande 4, är mer skonsam metoder krävs. Enstaka muskelfiberkulturer erbjuder en annan, mindre aggressiv, innebär att erhålla murina satellitceller fortfarande bosatt i deras sublaminal nisch och efter deras aktivering i kultur 8,9. Detta är emellertid ofta inte möjligt från human muskelbiopsimaterial (eftersom fibrer kan sällan erhållas från senan till senan) vilket innebär att denna teknik inte kan vara tillgänglig för många forskningslaboratorier intresserade av att studera humana muskelhärledda celler. Dessutom ger den enda fiber tekniken endast mycket begränsat antal cell.
Här beskriver vi ett system för sortering baserad på gentle enzymatisk nedbrytning av celler med användning av kollagenas och dispas följt av två på varandra följande rundor av magnetisk aktiverad cellsortering (MACS) som ger både en hög renhet (> 95% myogena celler) och utbytet (~ 2,8 x 10 6 ± 8,87 x 10 5 celler / g vävnad) för experiment i kultur. CD56 anses vara den gyllene standarden ytan markör för identifiering av mänskliga satellitceller in situ 10 och in vitro 11 och erbjuder en idealisk ytmarkör kandidat för pärla fastsättning. I detta tillvägagångssätt CD56-antikroppar konjugerade till järnoxid och polysackarid-innehållande superparamagnetiska pärlor är bundna till celler och fick passera genom en höggradient magnetisk cellseparation kolonn placeras i ett starkt magnetfält 12,13. De separationskolonner är fyllda med en matris av ferromagnetiska stålull eller järnsfärer som tjänar till att fokusera magnetiska fältlinjer mot deras yta genererar starka magnetfält gradienter (~ 4tesla) 14. I dessa kolumner ens något magnetiska celler attraheras och adsorberas till ytan 14. Obundet (CD56 -) celler passerar genom kolonnen, medan CD56 + celler märkta med magnetiska mikropärlor behålls tills avlägsnande från magnetfältet 12,15.
Cellsuspensioner från något skede av sorteringsprocessen kan pläteras på den önskade densiteten för ytterligare experimentering. Efter en given ingripande de cellbeståndsdelar kan identifieras med hjälp av immuncytokemi, avbildas med brett fält eller konfokal fluorescensmikroskopi och analyseras kvantitativt med hjälp av en bildanalys strategi som tillåter snabb objektiv mätning av alla märkta celler i varje given bild. I vårt laboratorium har vi använt denna dubbla immunomagnetisk sorterings inflygning följd av bildanalys 16 för att visa att CD56 - mänskliga fibroblaster lätt transdifferentiera till adipocyter, medan myogena cells av satellit ursprung är mycket resistenta mot denna adipogena omvandling 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: För de studier som utförts i vårt labb alla ämnen gav sitt skriftliga informerade samtycke att delta och alla experiment utfördes med brittiska National Health Service etikkommitté godkännande (London Forskningsetiska kommittén, referens: 10 / H0718 / 10) och i enlighet med Human Tissue lagen och Helsingforsdeklarationen.
1. Inledande Förberedelser Före muskelbiopsi (15 min)
- Gör human skelettmuskel tillväxtmedium. Till en graderad steril 50 ml koniska rör till 2,5 ml av tillägget mix, 10 ml fetalt kalvserum, antibiotika (penicillin / streptomycin) och glutamin till rätt slutkoncentrationer (Tabell 1) sedan fylla röret till 50 ml med skelettmuskulaturen basal medium.
- Sätt 15 ml av skelettmuskeln basmedium i ett sterilt 20 ml koniskt rör och väga den. När vägde rum detta rör på is. Använd detta för att få muskelprovet människa.
- I en annan 20 ml tub förbereda 10 mliter av en kollagenas D och Dispase II enzymlösning till en slutkoncentration av 2 mg / ml vardera genom upplösning stock alikvoter av dessa enzymer i skelettmuskel basalt medium. Filter-sterilisera denna lösning genom att passera den genom ett 0,22 pm filter. Placera denna steril enzymblandning i inkubator eller vattenbad vid 37 ° C under 15 min för att värma upp.
OBS: Denna blandning av enzymer är något mildare än trypsin och bättre bibehåller cellernas livskraft 17. - Avsätt en petriskål och ett par sterila skalp.
2. muskelbiopsi förfarande (45 min-1 timme)
- Innan rekrytera deltagare, få full etiskt godkännande och processrätt godkännande (inklusive relevanta vaccinationer för praktiker) från alla berörda styrande organ, kommittéer och vårdgivare (t.ex. etiska, institutionella, statliga osv).
- Skapa ett sterilt område den runt benet (t.ex. med sterila kirurgiska blad) end Rengör noggrant området runt biopsi med en desinficerad antibakteriellt medel (klorhexidin).
- Söva den föreslagna biopsi plats på volontären ben genom lokal injektion av 2% lidokain i den subkutana regionen ligger över fascia av musculus vastus lateralis.
- Gör en ~ 5 mm bred snitt med en steril kirurgisk kniv genom huden och fascia och genomfört Bergström nålbiopsi förfarande 18 med extra sug.
- Använda steril tång bort muskler från nålen lumen och fördjupa sig i basalmedium på is. Transportera vävnaden till laboratoriet för vidare behandling så snart som möjligt, även om livskraftiga myogena celler kan erhållas efter perioderna 24 tim eller mer.
- Debriefing ämnet, rengöra och försegla snittet platsen med flera sterila självhäftande hud stängning remsor och aseptiskt klänning med en yttre vattentät beklädnad.
3. Isolera Muskel härledda Prekursor Cells (1 tim, 30 min)
- Ta bort röret med muskelprovet och väga det (se till att röret är torrt genom att torka med vävnad). Beräkna vikten av muskeln genom att subtrahera vikten på röret innehållande medium och provet från rör innehållande enbart medium.
- Virvla lösningen flera gånger för att tvätta muskeln blodprov. Låt muskeln sediment vid rumstemperatur under 30 till 60 sek.
- Ta nästan hela volymen av medium från tuben, först med hjälp av en elektronisk pipettering stöd eller sug men lämna ca 2-3 ml i röret.
- Vänd röret till en steril petriskål som tillåter den återstående fluiden att bära muskelprov på till skålen; Använd steril skalpell för att extrahera eventuellt kvar muskler fragments.Rotate skålen att mobilisera den återstående vätskan och ta bort den med en pipette.Remove några synliga bitar av fett eller bindväv.
- För biopsier väger 100-400 mg, tillsätt 3 ml varmenzymlösning och använder sterila skalp skär muskelprovet i mycket små bitar (<1-2 mm 3).
- Med hjälp av en bred borrning 25 ml pipett upprätta muskelfragment och enzymlösning och överföring till en steril 10 ml koniska rör. Tvätta petriskål med ytterligare 3-5 ml kollagenas och dispas enzymlösning och använda en mindre 10 ml pipett samla eventuella återstående muskelfragment och plats i röret. Den exakta volym är inte kritisk.
- Placera flaskan i en 37 ° C inkubator (eller vattenbad) i 60 min med triturering (10 ml pipett) varje 15 min.
- Efter 1 h avsluta enzymatisk dissociation genom tillsats av en ekvivalent volym av färskt förvärmda tillväxtmedium och passera cellsuspensionen genom ett 100 pm filter för att avlägsna eventuella stora myofibre skräp. Centrifugera den filtrerade celllösningen vid 657 xg under 6 min vid rumstemperatur (20-25 ° C).
- Resuspendera cellpelleten i 5-7 ml tillväxtmedium och plattan i en obelagd T-25vävnadsodlingskolv. Överför denna platta till inkubatorn vid 37 ° C med 5% CO2 under 7 dagar. Ändra mediet varje 48 timmar. I detta skede myogena celler är mycket små och rundade och svåra att urskilja från icke-myogena celler.
- På den första mediumbyte, centrifugera supernatanten för att pelletera eventuella icke-vidhäftande celler. Återuppslamma dessa i färskt medium och åter plattan.
- Efter 7 dagar i kultur, se till att de flesta av de myogena (och fibroblast) celler har fäst men cellerna har ännu inte nått sammanflödet. Rena de myogena prekursorer och utföra MACS enligt ett protokoll som ursprungligen utvecklades av i laboratorier Gherardi och Chazaud 19,20 och ytterligare modifieras av oss fem.
4. immunomagnetiska Bead Sortering av celler baserat på CD56 Expression (1,5 tim)
- Efter 7 dagar skölj encellsskiktet (som vanligtvis kommer att innehålla 50-60% myogena celler 5) med tre börserav rumstemperatur fosfatbuffertlösning (PBS) för att avlägsna eventuella kvarvarande icke-adherenta celler och skräp från isolering.
- Trypinize cellerna (0,04% trypsin i Ca 2 + -fri PBS med 0,73 mM EDTA) under 3 minuter. När cellerna har lossnat, till 5-10 ml skelettmuskeltillväxten medium för att förhindra över matsmältningen. Pellets cellerna genom centrifugering vid 657 xg under 6 min vid rumstemperatur (20-25 C) och återsuspendera i en lämplig volym av fullständigt medium för räkning.
- Räkna ett litet prov av cellsuspensionen med användning av önskad metod (t.ex., med användning av en hemocytometer eller en automatiserad räkneanordning) och beräkna startcellantal och viabilitet.
- Plate några brunnar i en 96-brunnsplatta (eller större fartyg om så krävs) för immunocytokemisk eller flödescytometri baserad karakterisering av populationen innan sortering (fibroblaster och myogena celler kommer att vara den mest förekommande celltyper närvarande).
- Till cellsuspensionen add 15 ml steril PBS att späda celler och medium. Centrifugera cellerna igen och återsuspendera dem i 170 ul av rumstemperatur sorteringsbuffert (1% BSA i en MACS sköljlösning, steriliserades genom passage genom ett 0,22 ^ m filter).
- Lägg 35 pl av väl blandade magnetiska mikropärlor konjugerade till en CD56 primär antikropp (klon AF12-7H3, 130-050-401) in i cellen lösningen, till pipett blanda och låt inkubera under 15 minuter vid 4 C under försiktig omrörning vid halvvägs.
- Efter inkubation, späd cellen och pärla lösning med 10 ml MACS sorterings buffert och centrifugera vid 657 xg under 6 min. Resuspendera cellerna i 1 ml av sorteringsbuffert.
- Till MACs separator (magnet) till MACS innehar monter. Var försiktig när du lägger magnet till montern på grund av den starka magnetfält. Slot i kolonnen och montera pre-separationsfilter. Pipettera 1 ml sorteringsbuffert genom pre-separationsfilter och kolumnen för smörjning.
- Immediately efter detta, blanda försiktigt cellsuspensionen och droppa hela 1 ml genom för-separationsfilter och in i kolonnen.
- Tvätta kolonnen tre gånger med 1 ml (eller 500 | il) av sorteringsbuffert. Samla de icke kvarhållna celler som passerar genom kolonnen på det första slaget i en steril 50 ml koniskt rör innehållande en liten mängd av tillväxtmedium. Dessa celler är den första sorterings CD56 - fraktion och kommer att höganrikat för bindvävs fibroblaster. Låt inte kolumnen torka ut mellan tvättar.
- Efter tvättar bort den för-separationsfilter och tillsätt 2,5 ml av MACS-buffert till kolonnen. Sedan omedelbart ta bort kolumnen från magneten och samla den första sorterings CD56 + fraktionen i en separat 50 ml koniska rör genom att trycka in kolven i toppen av kolonnen.
OBS: Kolven passar mycket tätt i toppen av kolonnen och kan vara ganska knepigt att fungera; dock måste detta ske under kolumnen fortfarande full av buffert, så hastighet krävs. Undvik att trycka ned kolven för hårt och snabbt. - Före plätering bedöma viabiliteten hos cellerna med användning av, till exempel, den trypanblått-analysen. Bestäm andelen livsdugliga celler från 8 x 1 mm 2 räkningsfält (båda kamrarna i hemocytometer).
OBS: Cellerna kan vara antingen enkel eller dubbel sorteras beroende på renheten som krävs. Om det görs noggrant dessa celler tolerera dubbelsorteringsförfarandet mycket väl och livskraft är mycket hög> 95%. För dubbel sortering, skapa en annan kolumn, smörj med 1 ml sortering av buffert och fortsätta från steg 4.6.- Om avbildning skall utföras, plattceller direkt på täckglas belägna i 24 brunnar 21 och belagda med ditt val av ECM molekyl för cellbindning (t.ex. kollagen eller laminin). Här använder 0,1-0,5 mg / ml kollagen-I (tabell 3).
5. Sortering av Humen Muscle-härledda fibroblaster omedelbart efter isoleringen.
- För att rena fibroblast stamceller omedelbart efter isolering, anställa protokollet som ovan med följande ändringar:
- Omedelbart efter isolering Resuspendera cellerna i komplett medium och filter en gång om en 100 ìm cell sil och sedan igen men en 40 pm sil. Lägg 5 ml PBS och centrifugera vid 657 xg under 6 min.
- Resuspendera cellerna i MACS sorterings buffert och inkubera i Anti-humana fibroblaster mikrokulor för 15-30 minuter vid rumstemperatur.
- Använd LS kolumnen och Midi-MACS separator (tabell 3) och installera 40 pm pre-separationsfilter.
- Utför en eller två sorters beroende på renheten som krävs, överföra celler så snart som möjligt i seruminnehållande medium, utför en räkning, och plattan ut vid den önskade densiteten
6. Immuncytokemiska Färgning (1 dag och natt).
- Lagaceller i deras brunnar genom tillsats av en lika stor volym 8% paraformaldehyd i iskall PBS under 10 min med försiktig omröring. Efter 10 min aspirera fixativ och tvätta två gånger med PBS.
- Till immunostain cellyteantigener, blockceller i minst en timme i 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS och sedan sond med relevanta primära antikroppar (tabell 4).
- För intracellulära antigener, permeabilisera celler efter fixering genom tillsats av 0,2% Triton-X 100 i PBS med 1% BSA och NaN3 (0,01%) under 10 min, sedan blockera och inkubera med primära antikroppar. Utför alla primära inkubationer antikropps natt vid rumstemperatur (eller vid 4 ° C) med försiktig omrörning på en gungande plattform.
- Avlägsna obunden primär antikropp och tvätta cellerna tre gånger med kall PBS. Inkubera i 1 h inkubation med artspecifika fluorescensmärkta sekundära antikroppar (tabell 4) vid rumstemperatur.
- Efter avlägsnande avobundna sekundära antikroppar, skölj celler med tre utbyten av PBS och sedan motfärga med det fluorescerande DNA-färgämnet Hoechst 33342 (1 | ig / ml) lösning under 10 min på en gungande plattform.
- För samtidig visualisering av båda cellytantigener och intracellulära antigener, till sond celler först med primära antikroppar cell ytantigener följt av deras lämpliga sekundära antikroppar. Därefter åter fixera cellerna i kallt PFA, permeabilize, block och inkubera med primära antikroppar mot cytoplasmiska eller nukleära antigener följt av deras lämpliga sekundära antikroppar.
- Efter färgning, ta bort täck från sina brunnarna med böjda pincett och skölj baksidan av täck med destillerat vatten. Lägg täckcellen glida ner på en droppe av anti-fade monteringsmedium 22 set på en glasobjektglas.
7. Olja Red O färgning i kombination med immunofluorescerande färgning av celler (2 tim)
- Avslöjainnehållet i cellerna lipid pläterade i 24 brunnar genom färgning med Oil Red O (1 - ([4- (Xylylazo) xylyl] azo) -2-naftol) 5,23. Först förbereder en förrådslösning av 0,5% (vikt / volym) Oil Red O genom att lösa 500 mg av Oil Red O i 60 ml av 99% trietyl-fosfat och 40 ml destillerat vatten. Bibehåll denna lösning vid rumstemperatur i mörker tills användning.
- På dagen för användning, göra en 36% (vikt / volym) trietyl-fosfat arbetslösning, innehållande 12 ml av Oil Red O-stamlösning och 8 ml destillerat vatten. Filtrera lösningen genom filterpapper nummer 42 för att ta bort alla kristalliserad Oil Red O (vilket försämrar bildkvaliteten).
- Värm försiktigt denna arbetslösning i ett vattenbad under 1 h, varefter lösningen centrifugerades vid 1200 xg under 6 min. Avlägsna supernatanten och filtrera åter genom filterpapper (nummer 42) och överföring till ett färskt 20 ml rör.
- Efter celler har fastställts, permeabiliserades och immunostained, ta bort PBS och tillsätt 500 pl Oil Red O / Trietyl-phosfosfat-lösning till brunnarna för 60 min. Triton-X på koncentrationen används här för cellmembranet permeabilisering påverkar inte cellulär lipidinnehåll 23.
OBS: Oil Red O exciteras av våglängder mellan 540 och 580 nm och följaktligen Texas-rött filter kan användas för att detektera Oil Red O emission i fluorescensmikroskopi 23. Observera att fluorescensemissionen från Oil Red O ibland kan läcka in i långt röda kanalen om cellerna mycket starkt färgade (dvs mycket hög fetthalt). - Efter inkubation, avlägsna överskott Oil Red O och skölj cellerna fem gånger med 500 l PBS. Montera täck som för immunfärgning som beskrivs i avsnitt 6. Detect Oil Red O färgämne av både ljusfält / faskontrastmikroskopi eller med epifluorescensmikroskopi hjälp av Texas Red filter (skifta fritt, EX BP 560/40, BS FT 585, EM BP 630 / 75, Carl Zeiss).
8. Skaffa Micrographs från fluorescensmikroskopi för Efterföljande AnALYS
OBS: Se till att glider ska jämföras kvantitativt färgas med samma lösningar, fotograferad på samma villkor (t.ex. exponering, kamera och förvärvsinställningar etc.) och fångade i samma mikroskopi session. Allt efter förvärvet formatering bör också vara identiska och i strikt överensstämmelse med föreslagna riktlinjerna för digitala bilder 24.
- För bildtagning (widefield mikroskopi), slå på mikroskopet och fluorescens ljuskälla och lämna för den rekommenderade mängden tid att låta fluorescens ljuskälla för att värma upp och stabiliseras.
- Ställ in mörkströmmen för kameran genom att blockera ljusvägen till kameran; förvärva en bild med maximal upplösning och använda detta för att korrigera senare förvärvade bilder.
- Illuminate immunofluorescerande sonder genom epifluorescence levereras av flytande ljusledare (flexibel slang av fluorplast fylld med fenvlmetvl silikonolja) and signaler visualiseras genom rött (filtret satt 45 HQ Texas röd förskjutning fri, grön (filter satt 44 FITC speciella skift fritt) och blå (filtret satt 49 DAPI shift free) bandpassfilter på en inverterad epi-fluorescensmikroskop (10X, 20X, 40X, planera apokromatiska mål med 0.25, 0.75, 0.95 bländare respektive).
- För att undvika pixel mättnad hitta den optimala exponeringen inom det linjära området för detektorn för varje fluorescerande markör med hjälp av "Överexponering" inslag i bilden förvärvet programvara. Anteckna den standardiserade exponeringen för varje fluorescerande märkning.
- Fånga enskilda kanaler och spara gråskala eller pseudocolored TIFF (Tagged Image File Format) bildfiler i högsta bitdjup (helst 16 bit - 65.536 gråa värden) som tillhandahålls av inspelningsenhet (t.ex. kyld CCD (Charged Coupled Device) monterad på mikroskopet) . Ställ in bildupplösningen till 1388 x 1040 eller högre. Var noga med att inkludera en skala bar eller föremål av känd dimåtten i bilden.
- Om möjligt spara filer i 16 bit Tagged Image File Format (.tiff) och inte i JPG-format för att förhindra förlust av information 25.
- Om det finns någon oro över hur jämnt belysning (mjukvara medföljer mikroskopet kan ha automatisk korrigering för detta) tar en "platt-fältet" bild av täck utan celler men färgade och monteras på samma sätt som experimentella diabilder; Detta kan användas för att korrigera för belysnings defekter efter förvärvet inom bildanalys mjukvara.
- För bildtagning (konfokalmikroskopi), optimera detektor förstärkning och lasereffekt för varje avbildning experiment (undvik mättnad). I allmänhet, är fluorescensen mätt proportionell mot lasereffektnivå. Ställ pinhole storlek till "1 luftigt" för att uppnå bästa signal-brus-förhållande (förbättrad upplösning kan uppnås på 0,5 luftigt för särskilt starka signaler). Ta optiska sektioner på olika nivåer längs z-axeln genom myranibody-märkta celler och spara en 16 bitars maximal projektion för varje kanal för bildanalys.
9. Utföra Mätningar av fluorescerande Nuclear transkriptionsfaktorer Använda bildbehandling och Analysis Software (5 min per synfält).
- Tillgång individuella tiff-bildfiler och overlay motsvarande kanaler genom att klicka och dra en bild till en annan. Varje kanal kommer då att visas som ett separat lager på panelen Lager.
- Välj ljusare från filtermenyn för att tillåta lager under att visualiseras samtidigt. Alternativt, justera opaciteten för toppskikten till 50%.
OBS: TIFF bilder kan sparas med "förlustfri" Lempel-Ziv-Welch (LZW) datakomprimering för att sänka filstorleken utan förlust av information. - I analysen fönstret (Analys> Välj Data Points> Anpassad), välj Analys och välj mätningarna krävs (t.ex. integrerad densitet, menar density, cirkularitet, histogram mm). Släng alla onödiga mätningar genom att avmarkera rutan bredvid dem. Om mätningar i området krävs um klicka på Analys> Set Measurement Scale. Linjalen Verktyget visas automatiskt - spåra längden på skalfältet och skriv in dess känd längd i mikrometer. Programvaran kommer sedan konvertera arealmätningen i kvadratmikrometer.
OBS: Om histogramanalys väljs, när mätningarna registreras ytterligare en mapp visas (vars läge kan väljas) med 8 bitars histogram för varje enskilt urvalsområde i mikroskop samt summan av alla enskilda val (detta alltid visas som histogram-1 om flera val görs). Denna analys kan inte utföras av programvaran i 16 bitars format, men är mycket användbar för att undersöka fördelningen av pixelintensiteter hela ett föremål av intresse. - För analys av kärnfluorescensintensiteten först konstruera ett repreträdare "Färgområde Selection Mask" (CRSM) för Hoechst eller DAPI färgade DNA för att definiera kärnområde. När de önskade kanal bilderna överlagras, bör endast Hoechst kanalskiktet lämnas i syfte genom att säkerställa den "ögonikonen" intill den i fliken lager är markerat och sedan lagret markeras (blir blå), medan alla andra lager bör vara avmarkerat. Kontrollera att blandningsdropdown ställs tillbaka till "Normal" på fliken skikt.
- Öppna dialogrutan Färgområde (Välj> Färgområde) och ställa in valet alternativet dropdown till "Prov färger". Med valet förhandsgranskning inställd på "snabbmask" (röd bakgrund) Välj alla blå färgtoner inom kärnorna genom att hålla shift-tangenten ('+' tecknet visas) och klicka inom kärnorna med hjälp av pipett verktyg som visas.
- Om oönskade toner väljs, ta bort dem genom att trycka på Alt-tangenten ("─'sign visas) och klickapå dem. Bibehåll oskärpa mätområdet vid noll så att endast manuellt utvalda färgtoner ingår i mätningen och "Lokaliserade färgkluster" bör lämnas därhän.
- Spara denna CRSM till datorns hårddisk som en-programspecifika extrakt fil (.AXT fil). Med en annan slumpmässig fält kärnor, last, uppdatera och spara CRSM (Select, Färgområde, Load). Gör detta i minst fem slump fält för att se till att kärn val är representativa.
- Använd en färgad version av en gråskalebild för skapandet av en mask för att isolera funktioner eftersom det mänskliga ögat är bättre på att skilja mellan olika färgnyanser än mellan olika nyanser av grått 26.
- Använd den nukleära CRSM till segmentet kärnområden för färgning. När kärnorna har valts ut Klicka på bilden> Anpassning> Tröskel och flytta reglaget hela vägen till höger, så att kärnorna blir svart. Alternativthögerklicka och välj "fyll" välj sedan "Fill till: black". Klicka sedan på Select> Inverse och nu trycka bort för att ta bort allt bakgrunds (om alternativet visas väljer 'fyll till: White'). Detta binarizes huvudsak bilden utifrån ditt val. Lägg sedan vattendelaren plugin från fliken filter för att separera överlappande kärnor (Filter> Binary image> Watershed funktion separations).
- Om många kärnor är kraftigt överlappande, ta bort kärnorna från analys genom att avmarkera dem (Håll Alt-tangenten och löst dra runt dem med lassot).
- På nu binära nukleära lagret, gå till Välj> Färgområde och> Shadows, för att välja enskilda kärnor. Alternativa håll shift och klicka i någon svart kärna. Alla kärnor kommer omedelbart att väljas. Sedan överföra detta val till lagret som innehåller kärntranskriptionsfaktor färgning (t.ex. myogenin) genom att välja det skiktet och avmarkera allaandra skikt. Marsch linjer kommer nu visa läget för kärnorna i myogenin kanalen.
- Om du arbetar med pseudocolored bilder klicka bara på paletten Kanaler (till höger om fliken lager) och välj endast den gröna kanalen (bilden visas nu grå). Klicka sedan på Bild> Läge> Gråskala. En varning visas "Platta synliga lager och kasta dolda lager" klicka på OK, sedan en annan varning kommer att säga "kasta andra kanaler" klickar du på OK igen. Endast ett enda lager av gråskala utvalda kärnor kommer nu att finnas i lagerpaletten.
- Klicka Rekord Mätningar i måttloggen för att erhålla data för de valda kärnorna. Om lagret som skall analyseras (t.ex. myogenin färgning) är redan en rå 16 bitars gråskalebild sedan helt enkelt trycka Record Mätningar.
- Exportera valda mätningar som TXT fil till valfri plats. Dessa kan sedan bearbetas ytterligare och analyseras i andra datahanterings programvara packages
OBS: Redigera> steg bakåt kommandot (tryck hela Alt, Ctrl och Z-knappar samtidigt) återställer alla tidigare lager om det behövs. - Korrekt för icke specifik bakgrundsfluorescens 27 för resultaten att vara kvantitativa och jämförbara som mätningar av fluorescensintensitet är alltid en blandning av signal och bakgrund.
- Välj den fyrkantiga markeringsverktyget och kolla "fast storlek" väljer 20 av 20 pixlar (eller större om så önskas och beroende på confluency av celler i bilden). Håll shift välja tio eller fler bakgrundsområden spridda över hela synfältet. Tryck "Rekord Mätningar" i måttloggen.
- Beräkna den genomsnittliga integrerade densiteten (summan av alla pixel gråvärden) per pixel i samtliga tio utvalda bakgrundsregioner (givet som "medel gråvärdet 'inom mätnings- logg). Multiplicera den genomsnittliga bakgrundstäthet per bildpunkt med antalet pixlar i målobjektet (
- Subtrahera bakgrundsfluorescens från objekten ursprungliga integrerad densitet för att ge den slutliga bakgrunden korrigerade värdet. Detta tillvägagångssätt utgör potentiella fält till fält variation i ospecifik bakgrund fluorescens.
OBS: Det är av yttersta vikt för att välja endast bona fide bakgrundsregioner eftersom denna korrigering har en betydande inverkan på de slutliga värdena. Zooma in med förstoringsglas rekommenderas när du gör val.- Det kan också vara bra att dela upp den allmänna bakgrunden korrigerade värdet av den del av kärnan i pixlar (samma som att ta medelgråvärde / intensitet per kärna) för att minimera eventuella påverkan av kärn lokaliserad bakgrundssignal som skulle bidra mer till den integrerade densiteten värdet med ökande kärnstorlek (Figur 3C).
- Subtrahera bakgrundsfluorescens från objekten ursprungliga integrerad densitet för att ge den slutliga bakgrunden korrigerade värdet. Detta tillvägagångssätt utgör potentiella fält till fält variation i ospecifik bakgrund fluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Renade myogena celler och fibroblaster kan odlas i adipogena differentiering medium för tre dagar följt av adipogena näring medium från var som helst mellan 7-30 dagar att bedöma deras potential för adipogenes. Använda de renade cellpopulationer, Oil Red O färgning i kombination med immunfärgning för adipogena och myogena härstamning markörer visade att endast fibroblast fraktionen kunde adipogena differentiering (Figur 2). Den massiva ansamling av fett av fibroblaster är synlig för blotta ögat (panel A), och deras fullständiga transdifferentiering visas av den mycket starka uttryck för kärn PPAR γ (Figur 2 paneler B & C och Figur 3). Genom 15 dagars behandling, har dessa celler släppt eventuellt kvar TE-7 (en bindvävs antigen) på sin substrat (panel D). Däremot myogena celler behålla sin normala fenotyp inklusive uttryck av desmin och myosin heavykedjan (Figur 2 paneler E & F) och inte upregulate nukleära PPARy (Figur 3C).
Ett exempel på en kvantitativ analys av ett fält av myogena celler (desmin +) visas i figur 3. Panel B visar fältet analyseras, och panel A visar den kvantifierade fluorescensintensiteten (efter korrektion för bakgrunden). Denna metod visar tydligt variationen av myogenin expression i enskilda kärnor i detta specifika såddtäthet och tidpunkt. Figur 3C visar användbarheten av metoden att direkt jämföra transkriptionsfaktornivåer i olika celltyper på en cell-för-cellnivå. Här visar vi att CD56 - muskel fibroblaster uttrycker en hög nivå av de adipogena transkriptionsfaktor PPARy medan sorterade CD56 + myogena celler behålla endast mycket låga nivåer efter exponering för adipocyt Inducing Medium.
Figur 1:. Renade populationer av myogena celler och fibroblaster erhållna genom immunomagnetisk pärla sortering (AB) Efter en vecka i kultur sorterade myogena celler uttrycker cellytan celladhesionsmolekylen CD56 (N-CAM) och muskeln specifika mellanliggande glöd desmin. Kärn ki-67 uttryck visar att dessa celler förökar. Den färgning av membranet, cytoplasma och nukleära beståndsdelar beskrivs i protokollsteg 6.5. (CD) myogena celler uttrycker inte fibroblast markören TE-7. (E) Fibroblaster härrör från människans muskler uttrycker TE-7 och (F) transmembranplättar härrörande tillväxtfaktorreceptor α (PDGFRα). Skalstrecken är: (A) = 20 | am, (B, C & E) = 200 | am, (D, F) 50 &# 181;. M klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Human muskel-derived CD56 - / TE-7 + fibroblaster och CD56 + / desmin + myogena celler odlade i adipocyt Inducing Medium (AIM). (A) Fibroblaster isolerade genom MACS differentierar till adipocyter då de odlas i adipocyt inducerande medium (AIM) och detta kan ses lätt med blotta ögat efter Oil Red O färgning. Myogena celler visar inga tecken på adipogena differentiering efter samma tidsperiod i AIM och visar mycket begränsad Oil Red O färgning. (B & C) HUman muskelhärledda fibroblaster starkt uttryck PPARy och CEBPα (ej visad) efter odling i AIM. (C) Såsom fibroblasterna differentiera till adipocyter de frisätter återstående intracellulär ECM-protein som bildar ett tätt nätverk runt dem. (E) Myogenic cellen behåller sin myogena morfologi och uttryck av härstamning markörer som desmin och (F) myosin tung kedja (MHC), en markör för terminal myogenic differentiering, och misslyckas med att ackumulera lipid. Skala barer är: (B, D) = 200 nm (E, F) = 100 nm, (C) = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Exempel på uppgifter som erhållits fr about immunolabelled kulturer använder bild analysmetod som beskrivs (Adobe Photoshop Extended tillvägagångssätt). (A) En cell-för-cell-fluorescensintensitet-plot för muskel specifik nukleär transkriptionsfaktor myogenin efter 24 h i serumfritt differentieringsmedium. (B) Representativa mikrofotografier av desmin + / myogenin + humana myogena prekursorer. Skala barer är: (B) = 50 pm (C) PPARy fluorescensintensiteten i enskilda kärnor från sorterade CD56 + / Desmin + myogena populationer (CD56 +) och CD56 - / TE-7 + / PDGFRα + / Collagen VI + -celler (CD56. -) efter kultur i fettceller Inducing Medium för 15 dagar. De fluorescensvärdena normaliserades till nukleära området att ta hänsyn till variationer i kärnstorlek mellan de två celltyperna. Horisontella svarta staplar i (A) och (B) visar medelvärdet.52.049 / 52049fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Mediumkomponenter | Koncentration | Katalog nr. | Kommersiell källa |
| Mänsklig skelettmuskeltillväxt medium: | C-23060 (Comes "färdig att använda" som innehåller alla faktorer som anges) | ||
| Skelettmuskel basmedium | - | PromoCell | |
| Fetalt kalvserum | 15% | PromoCell (5%) och FCS Guld, PAA Laboratories (10%) - Cat nr. A15-151 | |
| Fetuin (bovint) | 50 | ig / ml | PromoCell | |
| Epidermal tillväxtfaktor | 10 ng / ml | PromoCell | |
| Grundläggande fibroblasttillväxtfaktor (Rekombinant humant) | 1 ng / ml | PromoCell | |
| Dexametason | 0,4 | ig / ml | PromoCell | |
| Insulin (rekombinant human) | 10 | ig / ml | PromoCell | |
| Penicillin | 100 U / ml | Sigma | |
| Streptomycin | 100 | ig / ml | Sigma | |
| L-glutamin | 292 | ig / ml | Sigma | |
| Myogenic differentieringsmedium | C-23260 | ||
| Skelettmuskel basmedium | - | PromoCell | |
| Penicillin | 100 U / ml | Sigma | |
| Streptomycin | 100 pg / ml </ Td> | Sigma | |
| Notera: PromoCell, Heidelberg, Tyskland; Sigma-Aldrich Company Ltd, Dorset, Storbritannien | |||
Tabell 1: cellodlingsmedia komponenter och koncentrationer.
| Medium komposition | Koncentration | Katalog nr. | Företag |
| Preadipocyt Tillväxtmedium | C-27410 (klar att använda) | ||
| Fetalt kalvserum | 0,05 ml / ml | PromoCell | |
| Endothelial Cell Growth Supplement | 0,004 ml / ml | PromoCell | |
| Epidermal tillväxtfaktor (rekombinant humant) | 10 ng / ml | PromoCell | |
| Penicillin | 100 U / ml | Sigma | |
| Streptomycin | 100 | ig / ml | Sigma | |
| Glutamin | 292 | ig / ml | Sigma | |
| D-biotin | 8,0 ^ g / ml | PromoCell | |
| Insulin (rekombinant human) | 0,5 ^ g / ml | PromoCell | |
| Dexametason | 400 ng / ml | PromoCell | |
| IBMX | 44 | ig / ml | PromoCell | |
| L-Thyroxine | 9 ng / ml | PromoCell | |
| Ciglitazon | 3 pg / ml | PromoCell | |
| Penicillin | 100 U / ml | Sigma | |
| Streptomycin | 100 | ig / ml | Sigma | |
| Glutamin | 292 | ig / ml | Sigma | |
| Preadipocyt differentieringsmedium | C-27436 (klar att använda) | ||
| D-biotin | 8,0 ^ g / ml | PromoCell | |
| Insulin (rekombinant human) | 0,5 ^ g / ml | PromoCell | |
| Dexametason | 400 ng / ml | PromoCell | |
| IBMX | 44 | ig / ml | PromoCell | |
| L-Thyroxine | 9 ng / ml | PromoCell | |
| Ciglitazon | 3 pg / ml | PromoCell | |
| Penicillin | 100 U / ml | Sigma | |
| Streptomycin | 100 | ig / ml | Sigma | |
| Glutamin | 292 | ig / ml | Sigma | |
| Adipocyt näring mediet | C-27.438 (klar att använda) | ||
| D-biotin | 8,0 ^ g / ml | PromoCell | |
| Insulin (rekombinant human) | 0,5 ^ g / ml | PromoCell | |
| Dexametason | 400 ng / ml | PromoCell | |
| Penicillin | 100 U / ml | Sigma | |
| Streptomycin | 100 | ig / ml | Sigma | |
| Glutamin | 292 | ig / ml | Sigma | |
| Notera: PromoCell, Heidelberg, Tyskland; Sigma-Aldrich Company Ltd, Dorset, Storbritannien | |||
Tabell 2: Sammansättning av adipogena cellodlingsmedia.
| Namn av utrustning / reagens | Företag | Katalog nr. | Kommentarer / beskrivning |
| Cellodling | Kollagenas D | Roche | 11088866001 |
| Dispas II | Sigma | D4693-1G | Måste filtret steriliseras före användning |
| Trypsin / EDTA | (Gibco) Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 | im cellfilter | BD Biosciences | 352360 | |
| Kollagen-lösning (3 mg / ml i 0,1% ättiksyra) | Sigma, Dorset, UK | C8919 | |
| Minisart SRP15 sprutfilter (0,2 ^ m) | Sartorius | 17573ACK | Polytetrafluoretylen (PTFE) membran |
| CD56 mänskliga mikropärlor | Miltenyi Biotech | 130-050-401 | Magnetisk aktiverad cellsortering (MACS) Var medveten om begränsad hållbarhet av mikropärlor |
| Anti fibroblast mikropärlor, mänsklig | Miltenyi Biotech | 130-050-601 | |
| 40 nm före separationsfilter | Miltenyi Biotech | 130-041-407 | |
| Stora Cell collumns | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | Dessa kolumner kommer med en flödesmotstånd. Användning av flödesmotståndet är inte nödvändigt att erhålla de höga myogena renheter som beskrivs här. |
| LS kolonner | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | Denna separator passar den stora cellen kolumnen men inte LS kolumnen. |
| MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multi | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| BSA | Sigma | Måste filtret steriliseras före användning | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | Lipid-färgning |
| Trietylfosfat | Sigma | 538728 | |
| Whatman Paper | Sigma | Z241121-1PAK | Nr 42, askfri. För att framställa filter vika den cirkulära filterpapper för att göra en halvcirkel, fäll därefter halvcirkel på mitten igen för att bilda en konform. Montera konen i en tratt för filtrering. |
| Montering | |||
| Förlänga Guld antifad Reagens | Molecular Probes, Invitrogen | P36930 | Detta kan köpas med eller utan DAPI och inte släcka initial fluorescens. |
| AxioVision | Carl Zeiss | Kontakt Zeiss | Bildanskaffnings programvara |
| Adobe Photoshop CS5 Extended | Adobe (köpt från Pugh Computers) | ADPH16982 * | Bildanalys programvara |
Tabell 3: Utrustning och reagenser.
| Namn / antigen | Antikropps arter och isotyp | Klon namn | Utspädning för användning | Katalog nr. | |
| Myogena markörer: | |||||
| CD56 (N-CAM) | Mus mc-IgG 1 | MY-31 | (1: 100) | 347740 | BD |
| Desmin | Kanin mc-IgG 1 | D93F5 (XP) | (1: 250) | 5332S | NEB |
| Myogenin | Mus mc-IgG 1 | F5D | (1:50) | F5D | DSHB |
| Myosin tung kedja | Mus mc IgG2b, kappa lätt kedja | MF20 | (1: 200) | MF20 | DSHB |
| Fibroblast / bind | |||||
| tissue markörer: | |||||
| Anti- human fibroblast | Mus mc-IgG 1 | TE-7 | (1: 100) | CBL271 | Millipore |
| PDGFRα | Kanin mc-IgG | D13C6 | (1: 500) | 5241 | NEB |
| Proliferativa markörer: | |||||
| Ki67 | Kanin mc-IgG | SP6 | (1: 200) | MP-325-CRM1 | MD |
| Adipogena | |||||
| transkriptionsfaktorer: | |||||
| PPARy | Mus mc-IgG 1 | E8 | (1:20) | Sc-7273 | Santa Cruz Biotechnology |
| Key: mc: monoklonala,pc: polyklonala, DSHB: Develop Studies Hybridoma Bank, Iowa USA; | |||||
| NEB: New England Biolabs, Storbritannien; MD: A. Menarini Diagnostics, Storbritannien; BD: BD Bioscience, Storbritannien. | |||||
Tabell 4: Primära antikroppar.
| Antigen | Antikropps arter och isotyp | Utspädning | Katalog nr. | Företag |
| Alexafluor488 | Get-anti-mus-IgG (H + L) | 1: 1000 | A-11001 | MP |
| Alexafluor 594 | Get-anti-mus-IgG (H + L) | 1: 1000 | A-11005 | MP |
| Alexafluor 594 | Get-anti-kanin-IgG (H + L) | 1: 1000 | A-11012 | MP | </ Tr>
| Key: H + L = tunga och lätta kedjor; MP: Molecular Probes, Invitrogen Life Technologies, Paisley UK | ||||
Tabell 5: Sekundära antikroppar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrivit ett immunomagentic sorteringsförfarande för selektiv anrikning av humana muskelhärledda prekursorer från små prov av muskelbiopsimaterial. Denna teknik har varit ovärderliga i vårt labb för att övervinna förlusten av humana muskelhärledda kulturerna till fibroblaster, men också för att förstå det unika beteendet av distinkta populationer av muskelhärledda stamceller. När renade myogena celler kan undersökas för förändringar i protein och / eller genuttryck, eller användas för experiment nedströms.
Förutom cellrening vi också detalj en snabb och enkel metod för att analysera specifika regioner av intresse för mikrofotografier från fluorescensmikroskopi. Digitala bilder från fluorescensmikroskopi innehåller en mängd information om cellbiologer att extrahera; faktiskt pixel håller data som inte nödvändigtvis urskiljbara för det mänskliga ögat. Med denna teknik kvantitativa data kan erhållas om ett stort antal av enskilda celler i en population. En unik egenskap hos bildanalys vid jämförelse med flödescytometri är förmågan att korrelera ändringar i proteinuttryck med förändringar i cellform orcell-cell-interaktioner. Vidare, förmågan att skapa och spara optimerade och representativa urval masker tillåter snabba, exakta och reproducerbara mätningar göras på många synfält och därigenom minska risken för användaren partiskhet.
MACS-baserad cellrening
En fördel med denna metod är att celler kan framgångsrikt renas antingen omedelbart efter isolering eller efter några dagar i kultur (när avkastningen blir högre).
Avgörande bör myogena celler inte tillåtas att bli sammanflytande innan sortering eftersom detta hindrar deras passage genom kolonnen, och kommer att minska andelen proliferativa celler erhållna för ytterligare expansion och experiment.
t "> Beroende på den ursprungliga vävnadsprov erhålls, kan det finnas ett stort antal icke-vidhäftande erytrocyter i kulturen i detta skede. Metoder finns för att selektivt lysera erytrocyter, men för att undvika onödig kemisk stress muskel celler från detta steg undviks. Vi har inte observerat någon märkbar negativ inverkan av erytrocyter på tidiga kultur av humana muskel härledda celler, och dessa erytrocyter avlägsnas genom medie förändringar när myogena celler fäster.Andra metoder för celllösgör strax före sortering (t.ex. andra milda proteaser eller EDTA-baserade metoder) kan användas för celler i vilka uttryck av cellyteantigen är låg eller särskilt känsliga för tryptisk digerering. Uttrycket av CD56 på humana myogena celler är stark och motståndskraftig mot en kort trypsinsation (vid analys med antikropparna som beskrivs här).
Det är viktigt att sorteringsbufferten innehåller EDTA för att hämma calcium-beroende cell-cell-adhesion; Detta är avgörande för att erhålla (och upprätthålla) en encelliga suspension för sortering. Beroende på antalet celler, form och storlekar som skall sorteras, det finns ett val att göras med avseende på separationskolonnen (se tabell 3).
Ta bort kolumnen från magnetfältet att frigöra balanserade celler kan vara knepigt så se till att insamling röret (även om kjolar) placeras i en hållare placerad mycket nära kolonnen för att undvika förlust av celler i transit.
Även om vi har beskrivit denna teknik för användning med humana primära celler från skelettmuskulatur, kan detta protokoll enkelt anpassas för andra celltyper för vilka en specifik / unik cellytan markör är känd. Andra fördelar är det faktum att hela förfarandet kan genomföras i den sterila arbetsmiljön av en skåp med laminärt flöde. Dessutom är MACS förfarandet mildare på cellerna jämfört med FACS-sortering på grund av lågskjuvkrafter och kan vara en särskild fördel för större celler. De magnetiska pärlorna som används är liten, icke-toxiska och bionedbrytbara i kultur. I själva verket har MACS tillämpats framgångsrikt för rening och undersökning av ett antal andra celltyper.
En begränsning med denna teknik är att MACS inte lätt kan utföras för multipla markörer samtidigt. Dessutom kan mängden markör och storlek av celler inte kan fastställas under sorteringsprocessen, först efteråt.
Överväganden för att optimera bildtagning och analys
Den bildanalys metod som visat här ger ett kraftfullt verktyg för att belysa förändringar i expressionsnivån av proteiner på en cell-för-cell-basis i stora populationer av celler. Genom att utnyttja lagren anläggning och urvals masker i ett allmänt tillgängligt programpaket, kan försöks objektivt välja olika fluorescerande signaler över flera bilder, för att möjliggörakvantifiering av enskilda funktioner, och valfritt antal komponenter inom dem. Vi har med framgång använt denna metod för att kvantifiera och direkt jämföra de olika transkriptionsfaktor-uttryck i olika cellpopulationer som utsätts för en adipogena utmaning.
Varje fluorescens kanal (som representerar en specifik markör) kan hållas åtskilda från de andra och slås på eller av efter behov, vilket är användbart för flerfärgs inmärkning experiment.
Ett antal faktorer måste beaktas när man försöker utvinna kvantitativa och halv kvantitativa data från fluorescensmikroskopi 28. Uppmärksamhet på dessa kommer att tillåta grundläggande halv kvantitativa mätningar göras. Ofta forskare vill använda ett antal fluorokromer att märka olika proteiner av intresse; av största vikt är förmågan att kunna skilja mellan de enskilda emissionsspektra. I de flesta fall uppnås detta genom selektiv excitatjon av endast en fluorokrom i taget. Men om utsläpp och / eller excitation spektra lappar betydligt eller saknar filtreras därefter genomblödning eller överhörning kan äventyra riktigheten av bilddata som erhållits. Lufta igenom är passagen av fluorescensemission på ett olämpligt detekteringskanal och orsakas av en överlappning av emissionsspektra 29,30.
Några punkter att tänka på är: att välja fluorokromer som har väl åtskilda excitation och emissionsspektra, använder mycket selektiva excitationsvåglängder (som uppnås genom lasrar i konfokalmikroskopi), se till att utsläppsfiltersatser är tillräckligt stränga för att utesluta oönskade våglängder, och utföra flerfärgsbildalstring på den längsta (dvs den "rödaste") våglängd toppvärdet för emissions färgämne först att redogöra för det faktum att absorptionsspektra generellt skev mot kortare våglängder (blått ljus) medan emissionsspektra skev mot längre Wavelengths (rött ljus). Spektra av de fluorescerande märkningar finns på "Fluorescens Spectraviewer" från Invitrogen.
Användningen av höga kvalitetsmål är avgörande för bilder som är avsedda för analys. En hög numerisk apertur (> 1,3) är bäst och förstoringar bör anpassas till kameran i widefield mikroskopi. I både widefield och konfokalmikroskopi, är NA kritisk, eftersom z-upplösning förbättras som en funktion av den numeriska aperturen i kvadrat 29. Om möjligt använder sig av plan apokromatiska linser som är korrigerade för både sfäriska och kromatisk aberration 29. Användning av flytande ljusledare rekommenderas starkt eftersom de minskar ojämn belysning genom att förvränga käll belysningen för att minska rumsliga och tidsmässiga samstämmighet innan den träder i mikroskop målet 29.
Det är viktigt att undvika mättnad av bilder, som mättade pixlar kan inte vara riktigt quantified på grund av klippning av information på den mest intensiva grånivån värden 26.
Olika "plugins" kan vara tillgängliga för att möjliggöra platt-fältkorrigeringsförfaranden till utförts med relativ lätthet; till exempel Dr John C. Russ har gjort många av dessa tillgängliga gratis online (http://www.drjohnruss.com/download.html). Genom att använda denna plugin förhållandet mellan ljusstyrkan i varje pixel i försöksmikrograf till motsvarande en i referensbilden beräknas och ersätter det ursprungliga. Resultaten sedan skalas för att fylla ljusstyrkeområdet i bilden. Alternativt är bildräknare för ImageJ annat sätt att korrigera för ojämn belysning.
För vissa bildanalys kan konfokalmikroskopi vara metoden för val eftersom det förhindrar out-of-fokus fluorescens från att nå detektorn 29. Emellertid, kan detta tillvägagångssätt tar betydligt längre tid än widefield fluorescensmikroskopi, vilket begränsar steler av individuella synfält som kan erhållas i en enda session.
Nyligen andra metoder har rapporterats för anrikning av myogena celler från mänskliga muskelvävnaden. Bareja 31 använde en kombination av MACS utarmning (för: CD11b, CD31, CD34 & CD45) följt av FACS för positiv selektion av CXCR4 + / CD56 + myogena celler. Men även om detta förfarande kunde generera en höganrikat myogenic befolkning, är det betydligt längre än den metod som beskrivs här, innehåller många fler på varandra följande steg och resulterar i ett lägre utbyte av renade myogena celler lägre per gram vävnad.
I en annan färsk studie, Castiglioni 32 isolerade myofibre associerade celler från mänskliga foster muskel genom FACS med hjälp av flera markörer och visade att CD34 - / CD56 + / Pax7 + celler (arketypiska satellitceller) kan uppvisa osteogen samt myogena härstamning potential, men i ramavtal med vårt arbete visar inte adipogena potential. Dessa författare visade också att CD34 + / PAX7 - celler var icke-myogenic, men kunde adipogena och osteogen differentiering. Den anrikning av CD90 uttryck (en markör för muskel fibroblaster 33) i CD34 + icke-myogenic fraktionen antyder att en stor andel av dessa celler kan ha varit fibroblaster, som har visat sig vara den största källan till adipocyter i vuxen människa skelettmuskel kulturer (referens 5 och figur 2). Oavsett om muskel härledda fibroblaster har även osteogena differentiering potentiella optioner ytterligare utredning.
Till skillnad från metoden enligt Castiglioni 32, kräver vår metod endast en antikropp (i motsats till 7) för att reproducerbart erhålla höga utbyten av rena myogenic cellkulturer och kan utföras snabbt inom de aseptiska betingelser av en huv med laminärt flöde. En ytterligare methodological skillnaden är att dessa författare isolerade celler direkt från dissocierade muskel och sedan följde dem i kultur, medan vi oftast kulturceller för 1 vecka före sortering och odla. I våra händer detta tillvägagångssätt är bättre tolerans av cellerna. Viktigt är total tid i kultur huvudsak motsvarande mellan de två synsätten. Med tanke på att fosterskelettmuskel genomgår hyperplasiska och hypertrofisk muskeltillväxt 34 är det inte förvånande att utbytet av myogena prekursorer är större från foster muskelvävnad jämfört med vuxna muskler
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | Must be filter sterilized before use |
| Trypsin/EDTA | (Gibco) Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 μm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Sigma, Dorset, UK | C8919 | |
| Minisart SRP15 syringe filter (0.2 μm) | Sartorius | 17573ACK | Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane |
| CD56 human Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-050-401 | Be aware of the limited shelf life of microbeads |
| Anti- fibroblast Microbeads, human | Miltenyi Biotech | 130-050-601 | |
| 40 μm Pre-separation filters | Miltenyi Biotech | 130-041-407 | |
| Large Cell Collumns | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here. |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MiniMacs Seperator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | This separator fits the large cell column but not the LS column. |
| MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| BSA | Sigma | Must be filter sterilized before use | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Triethyl phosphate | Sigma | 538728 | |
| Whatman Paper | Sigma | Z241121-1PAK | No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Molecular Probes, Invitrogen | P36930 | This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence. |
| AxioVision | Carl Zeiss | Contact Zeiss | |
| Adobe Photoshop CS5 Extended | Adobe (purchased from Pugh Computers) | ADPH16982* |
References
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibres. J. Cell Biol. 9, 493-495 (1961).
- Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J. Appl. Physiol. 91, 534-551 (2001).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and the Muscle Stem Cell Niche. Physiol. Rev. 93, 23-67 (2013).
- Alsharidah, M., et al. Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture. Aging Cell. 12, 333-344 (2013).
- Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. Human skeletal muscle fibroblasts, but not myogenic cells, readily undergo adipogenic differentiation. J. Cell Sci. 126, 5610-5625 (2013).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138, 3625-3637 (2011).
- Webster, C., Pavlath, G. K., Parks, D. R., Walsh, F. S., Blau, H. M. Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter. Exp. Cell Res. 174, 252-265 (1988).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. J. Vis Exp. , e50074 (2013).
- Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric Self-Renewal and Commitment of Satellite Stem Cells in Muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
- Mackey, A. L., et al. Assessment of satellite cell number and activity status in human skeletal muscle biopsies. Muscle a d Nerve. 40, 455-465 (2009).
- Stewart, J. D., et al. Characterization of proliferating human skeletal muscle-derived cells in vitro: Differential modulation of myoblast markers by TGF-β2. J. Cell. Physiol. 196, 70-78 (2003).
- Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11, 231-238 (1990).
- Clarke, C., Davies, S. Ch. 2. Methods in Molecular Medicine. Metastasis Research Protocols. Brooks, S. A., Schumacher, U. 58, Humana Press. 17-23 (2001).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
- Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).
- Agley, C. C., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. An Image Analysis Method for the Precise Selection and Quantitation of Fluorescently Labeled Cellular Constituents: Application to the Measurement of Human Muscle Cells in Culture. J. Histochem. Cytochem. 60, 428-438 (2012).
- Danoviz, M., Yablonka-Reuveni, Z. Ch. 2. Methods in Molecular Biology. Myogenesis. DiMario, J. X. 798, Humana Press. New York, NY. 21-52 (2012).
- Bergström, J. Muscle electrolytes in man. Determined by neutron activation analysis on needle biopsy specimens. A study on normal subjects, kidney patients, and patients with chronic diarrhoea. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 14, 7-100 (1962).
- Chazaud, B., et al. Satellite cells attract monocytes and use macrophages as a support to escape apoptosis and enhance muscle growth. The Journal of Cell Biology. 163, 1133-1143 (2003).
- Abou-Khalil, R., et al. Autocrine and Paracrine Angiopoietin 1/Tie-2 Signaling Promotes Muscle Satellite Cell Self-Renewal. Cell Stem Cell. 5, 298-309 (2009).
- Timpl, R., Kvonder Mark, Role of laminin and fibronectin in selecting myogenic versus fibrogenic cells from skeletal muscle cells in. 117, 628-635 (1986).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. Fluorescence microscopy. Nat Meth. 2, 910-919 (2005).
- Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem. Cell Biol. 116, 63-68 (2001).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166, 11-15 (2004).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: Focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
- Johnson, J. Not seeing is not believing: improving the visibility of your fluorescence images. Mol. Biol. Cell. 23, 754-757 (2012).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
- Pawley, J. The 39 steps: A cautionary tale of quantitative 3-D fluorescence microscopy. Biotechniques. 28, 884-887 (2000).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
- Brown, C. M. Fluorescence microscopy - avoiding the pitfalls. J. Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).
- Bareja, A., et al. Human and Mouse Skeletal Muscle Stem Cells: Convergent and Divergent Mechanisms of Myogenesis. PLoS ONE. 9, e90398 (2014).
- Castiglioni, A., et al. Isolation of Progenitors that Exhibit Myogenic/Osteogenic Bipotency In by Fluorescence-Activated Cell Sorting from Human Fetal Muscle. Stem Cell Reports. 2, 560 (2014).
- Fukada, S. -i, et al. CD90-positive cells, an additional cell population, produce laminin α2 upon transplantation to dy3k/dy3k mice. Exp. Cell Res. 314, 193-203 (2008).
- Stickland, N. Muscle development in the human fetus as exemplified by m. sartorius: a quantitative study. J. Anat. 132, 557-579 (1981).
