Abstract
骨格筋の修復および再生は、常駐筋肉幹細胞である、衛星細胞の作用を必要とする。これらは、酵素消化を用いてヒト筋肉生検試料から単離することができ、それらの筋原性性質は、培養で研究。定量的には、酵素消化から得られた二つの主要な接着細胞型がある：CD56 +として最初に同定された（i）の衛星細胞は、（筋原細胞又は筋前駆細胞とも呼ばれる）、およびそれ以降のCD56 + /デスミン+細胞など、および（ii）muscle-とTE-7 + - CD56として識別由来の線維芽細胞、。線維芽細胞は培養液中で非常に効率的に増殖し、混合細胞集団においてこれらの細胞は、培養を支配する筋原細胞をオーバーランすることができる。培養中の細胞型のいずれかの生来の挙動を調査しようとしたときに、人間の筋肉とは異なる細胞型の単離および精製は、このように重要な方法論的な考慮事項である。ここでは、非難される両方の高純度（> 95％筋原細胞）および良好な収率（〜を与えるコラゲナーゼを用いて細胞の穏やかな酵素消化に基づいて並べ替えや磁気活性化細胞選別（MACS）が続くディスパーゼのシステムをIBE 2.8×10 6±8.87培養での実験のためのin vitroでの 7日後に×10 5細胞/ g組織）。このアプローチは、CD56に対する抗体にコンジュゲートした磁気ビーズのビーズと混合筋肉由来細胞集団をインキュベートした後、磁場も細胞を通過させるに基づいている。細胞カラムを通過妨げられずに通過する- CD56が、一方、マイクロビーズに結合されたCD56 +細胞は、フィールドによって保持されている。選別プロセスの任意の段階からの細胞懸濁液を播種し、培養することができる。所与の介入、細胞の形態以下、核転写因子を含むタンパク質の発現および局在を免疫特異的な抗体で標識し、画像のpを用いて定量することができるrocessingと解析パッケージ。
Introduction
骨格筋の修復および再生は2,3筋原幹細胞、衛星細胞1の作用を必要とする。 インビボでこれらの細胞はあらゆるmyofibreの筋細胞膜と基底膜の間に位置して可逆的に静止状態で存在するが、増殖するように活性化され、ヒューズ及び筋肉組織として分化するが、損傷を受けた修理および3を再生する。衛星細胞は、酵素消化4を用いて、若年および高齢のヒト筋肉生検試料から単離することができ、それらの筋形成特性は、その後、初代培養5に研究することができる。細胞集団の両方の収率および純度に関して、この分離プロセスの効率は、使用される方法に依存し、サンプル間で変化し得る。酵素消化から得られた二つの主要な接着細胞型は、CD56 + /デスミン細胞、およびμとして最初に同定された衛 星細胞（現在称される筋原細胞又は筋前駆細胞）、あるCD56として識別SCLE由来線維芽細胞、 -とTE7 +細胞5。線維芽細胞は、急速な増殖率を持っており、筋原細胞のような細胞間接触の際に不可逆的な増殖停止および最終分化を受けない。したがって、混合集団に、線維芽細胞は、文化を支配する筋原細胞をオーバーランすることができる。
線維芽細胞は、多くの場合、しかし、それ自体で研究の価値がある細胞のような線維芽細胞への関心の高まりは、それらが筋肉修復6時の筋原細胞との協力的な役割を持っていることが示されている、特にとして、今そこにある、筋肉の生物学者のための刺激として見てきた。ヒト筋肉異なる細胞型の単離および精製は、このように、培養中の両方の細胞型の先天性挙動を調査しようとしている方法論の重要な考慮事項である。蛍光活性化細胞選別（FACS）は、細胞は、さらなる研究のために選別することができる方法、および/または、計数し分析した。 FACSは、確実に、ヒト筋原細胞を濃縮することが示されているが、その後の培養のための細胞の収率は、これまで7高くはなかった。そのような老化4に関連した衛星細胞由来の筋原細胞と非常に貧しい増殖や分化などの体細胞の限定された複製の可能性を考えると、より穏やかなアプローチが必要とされる。シングル筋線維培養は別のは、あまり積極的で、彼らのsublaminalニッチと文化8,9におけるそれらの活性化の後にまだ常駐マウス衛星細胞を得る手段を提供。しかし、これは、この技術がヒト筋肉由来細胞を研究することに興味の多くの研究室にアクセス可能でないかもしれないことを意味する（繊維はめったに腱の腱から得ることができないため）、ヒト筋生検材料からしばしば不可能である。また、単繊維の技術は非常に限られた細胞数を提供する。
ここでは、GENに基づいて並べ替えのシステムを説明TLEの酵素コラゲナーゼを用いて細胞の消化と高純度（> 95％筋原細胞）および収率（〜2.8×10 6±8.87×10 5細胞/両方を与えソーティング（MACS）、磁気活性化細胞の2連続ラウンドが続くディスパーゼ培養での実験のためのg組織）。 CD56は、in situ 10 およびインビトロ 11 におけるヒト衛星細胞の同定のためのゴールドスタンダード表面マーカーとみなされ、ビーズ結合のための理想的な表面マーカー候補を提供している。このアプローチのCD56に酸化鉄および多糖を含む超常磁性ビーズに結合した抗体を細胞に結合され、強磁場12,13に配置された高勾配磁気細胞分離カラムに通した。分離カラムは、強い磁場勾配を生成するそれらの表面に向かって磁力線を集中させる役割を果たす強磁性スチールウールや鉄球の行列（〜4tesla）14が充填されている。これらの列では、少しでも磁気細胞は、その表面14に引きつけられ吸着される。結合していない（CD56 - ）は、磁気マイクロビーズで標識されたCD56 +細胞は、磁界12,15から除去されるまで保持されているのに対し、細胞がカラムを通過する。
選別プロセスの任意の段階からの細胞懸濁液は、さらなる実験のために所望の密度で播種することができる。細胞成分は免疫細胞化学を用いて同定することができる特定の介入後、広視野または共焦点蛍光顕微鏡を用いて画像化し、任意の画像内のすべての標識細胞の急速な客観的測定を可能にする画像解析手法を用いて定量的に分析した。筋原細胞一方で、ヒト線維芽細胞は容易に脂肪細胞への分化転換-私たちの研究室では、そのCD56を実証するために、画像解析16に続いて、この二重の免疫磁気ソーティングアプローチを使用していた衛星由来のsがこの脂肪生成変換5に対して非常に耐性がある。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：私たちの研究室で行われた研究では、すべての被験者が参加する彼らの書かれた、インフォームドコンセントを与え、すべての実験は、英国国民保健サービス倫理委員会の承認を得て実施した（ロンドン研究倫理委員会;参照：10 / H0718 / 10）とに従い、ヒト組織法およびヘルシンキ宣言。
1.初期準備筋生検の前に（15分）
- ヒト骨格筋成長培地を行います。メス、滅菌50mlコニカルチューブに次に骨格筋の基底で50mlにチューブを埋めるサプリメントミックス2.5mlを10mlの適切な最終濃度のウシ胎児血清、抗生物質（ペニシリン/ストレプトマイシン）およびグルタミン（ 表1）を追加メディア。
- 無菌の20ミリリットルコニカルチューブに骨格筋基礎培地の15ミリリットルを入れて、それの重量を量る。一度このチューブは氷の上で行われ、秤量。ヒト筋肉サンプルを受け取るために使用します。
- 別の20ミリリットルチューブでは10メートルを準備骨格筋基礎培地中でこれらの酵素のストックのアリコートを溶解して2mg / mlのそれぞれの最終濃度をコラゲナーゼDおよびディスパーゼII酵素溶液のリットル。 0.22μmのフィルターを通すことにより、このソリューションを濾過滅菌する。ウォームアップする15分間37℃のインキュベーターや水水浴中でこの無菌の酵素ミックスを置きます。
注：この酵素の混合物は、トリプシンよりもわずかに緩やかであり、より良いセルが17を生存能力維持する。 - ペトリ皿及び滅菌メスのペアを脇に置きます。
2.筋生検手順（45分〜1時間）
- 参加者を募集する前に、（ 例えば、倫理的、制度的、行政など ）、関連するすべての自治体、委員会や医療サービス提供者から（実験者に関連する予防接種を含む）完全な倫理的なクリアランスと手続きの承認を得る。
- 脚の周りに（ 例えば 、無菌の外科シート付き）AN無菌のフィールドを作成します防腐抗菌剤（クロルヘキシジン）で十分に生検部位の周囲をきれいにdが。
- 外側広筋の筋の筋膜の上に位置する皮下領域では2％のリドカインの局所注射によるボランティアの脚に提案された生検部位を麻酔し。
- 皮膚や筋膜を通して無菌の外科用メスを使用して〜5mm幅の切開を作成し、追加の吸引によりベルイストロームの針生検手順18を実行する。
- 滅菌ピンセットを使用すると、針の内腔から筋肉を除去し、氷上で基本培地に浸す。実行可能な筋原細胞は期間24時間以上後に得られるが、できるだけ早くさらなる処理のための実験室に組織を輸送する。
- 外側の防水カバーで複数の無菌の接着剤皮膚閉鎖ストリップと無菌的にドレスで切開部位を清潔にし、密封、件名を結果報告。
3.筋肉由来前駆Ceとの分離LLS（1時間、30分）
- 筋肉のサンプルを含むチューブを取り外し、（管がティッシュで拭いて乾燥していることを確認してください）、それを量る。培地のみを含むチューブから培地およびサンプルを含むチューブの重量を減算することにより、筋肉試料の重量を計算します。
- 血液の筋肉サンプルを洗浄する溶液を数回旋回。 30〜60秒間、室温で筋肉の堆積物をしましょう。
- 第一の電子ペッティング援助や吸引器を使用して、チューブからメディアのほぼボリューム全体を削除しますが、チューブ内に約2〜3ミリリットルのまま。
- 皿の上に筋肉のサンプルを運ぶために残りの流体を可能に滅菌ペトリ皿に上にチューブを反転。残りの筋肉が脂肪または結合組織の目に見える部分を残りの液体を動員し、pipette.Removeでそれを除去するために料理をfragments.Rotate抽出するために滅菌メスを使用しています。
- 100〜400 mgの計量生検のために、暖かいの3ミリリットルを追加酵素液との無菌メスを使用して、非常に小さな断片（<1-2 mm 3の）に筋肉のサンプルを切断する。
- 無菌の10ミリリットルコニカルチューブに筋肉フラグメントおよび酵素液と転送を描く広い口径25ミリリットルピペットを用いて。コラゲナーゼとディスパーゼ酵素液をさらに3〜5ミリリットルをペトリ皿を洗って、より小さな10ミリリットルピペットを用いてチューブ内に残っている筋肉の断片と場所を集める。正確な体積は重要ではない。
- チュレーションとの60分（10ミリリットルピペット）毎に15分間37℃のインキュベーター（または水浴）でバイアルを置きます。
- 1時間後、予め温めておいた新たな増殖培地の等量を添加することによって酵素的解離を終了し、任意の大きなmyofibre破片を除去するために100ミクロンのフィルターを通して細胞懸濁液を渡す。室温（20〜25℃）で6分間657×gで濾過した細胞液を遠心します。
- コーティングされていないT-25増殖培地プレート5-7溶液に細胞ペレットを再懸濁組織培養フラスコ。 7日間、5％CO 2で37℃のインキュベーターにこのプレートを転送します。メディアごとに48時間を変更します。この段階で、筋原細胞は、非筋原細胞から識別することは非常に小さく、丸みが困難である。
- 第1の媒体の変化に、非接着細胞をペレット化し、上清を遠心する。新鮮な培地と再プレートにこれらを再懸濁。
- 培養7日後、筋原性（および線維芽細胞）のほとんどの細胞が付いていますが、細胞がまだ合流に達していないことを確認してください。筋原性前駆体を浄化し、もともとゲラルディとChazaud 19,20の研究室でによって開発され、さらに、私たち5により修正プロトコルに従ってMACSを行う。
CD56の発現に基づいて細胞の4免疫磁気ビーズ選別（1.5時間）
- 3取引所で（通常は百分の50から60筋原細胞5が含まれます）細胞単層リンス7日後分離から残りの非接着細胞および破片を除去するために室温のリン酸緩衝液（PBS）である。
- 細胞をTrypinize（0.04％トリプシンのCa 0.73 mMのEDTAを2+フリーPBS）で3分間。細胞が剥離した後、過剰消化防ぐために、骨格筋成長培地5〜10mlのを追加します。カウント用の完全培地の適切な容量の室温（20〜25℃）に再懸濁で6分間657×gでの遠心分離により細胞をペレット。
- 所望の方法を使用して、細胞懸濁液の少量のサンプルをカウントする（ 例えば、血球計または自動計数装置を用いて）し、細胞数および生存率を計算開始。
- 免疫細胞化学のためのプレート（必要に応じて以上の容器）を96ウェルプレート内のいくつかのウェルまたは選別前に人口のフローサイトメトリーベースの特徴づけをフロー（線維芽細胞および筋原細胞が種類存在する最も豊富な細胞になります）。
- 細胞懸濁液広告に細胞および培地を希釈するD滅菌PBSの15ミリリットル。遠心して細胞を再び、バッファ仕分け室温の170μlの再懸濁（MACSすすぎ溶液中の1％BSAを、0.22μmのフィルターを通過により滅菌）。
- 細胞液にCD56一次抗体（クローンAF12-7H3、130-050-401）にコンジュゲートしよく混合磁性マイクロビーズの35μl加え、で穏やかに撹拌しながら4℃で15分間インキュベートするミックスして残すためにピペット中間点。
- インキュベーション後、6分間657×gでバッファと遠心をソートするMACS 10mlの細胞およびビーズ溶液を希釈。バッファソート1mlに細胞を再懸濁。
- スタンドを保持MACSへのMACセパレータ（磁石）を追加します。強い磁場によるスタンドに磁石を追加するときには注意してください。列内のスロットおよびプレ分離フィルタを取り付けます。ピペット潤滑分離前フィルタ及びカラムを通して緩衝液を選別を1ml。
- Immediatエリーこの後に、静かに細胞懸濁液を混合しプリ分離フィルタを通して、カラムに全体の1ミリリットルを滴下する。
- バッファをソートする1ミリリットル（または500μL）を用いてカラムを3回洗浄します。成長培地の少量を含む滅菌50mlコニカルチューブ中の最初のソートカラムを通過し、非保持された細胞を収集する。これらの細胞は、最初のソートCD56である-留分と非常に結合組織の線維芽細胞について濃縮されます。カラムは洗浄の間に乾燥させてはいけない。
- 洗浄した後、プリ分離フィルタを削除し、カラムにMACSバッファーの2.5ミリリットルを追加します。その後すぐに磁石から列を削除し、カラムの頂部にプランジャーを押し下げることにより独立した50ミリリットルコニカルチューブ内の最初のソートCD56 +画分を収集します。
注：プランジャーがカラムの頂部に非常に緊密にフィットし、操作も非常に注意が必要です。列がまだfとしながらしかし、これがなされなければならないバッファのULLので、スピードが要求される。あまりにもハードと高速プランジャーを押し下げることは避けてください。 - 例えば、トリパンブルーアッセイを用いて細胞の生存率を評価するめっきの前に。 8×1ミリメートル2カウントフィールド（血球計数器の両方の室）からの生存細胞の割合を決定します。
注：細胞は、単一のまたは必要な純度に依存してソート二重のいずれかであり得る。注意深く行われた場合、これらの細胞は非常によく、二重選別手順を許容し、生存率は> 95％で非常に高い。ダブルソートするため、バッファのソート1ミリリットルで潤滑し、ステップ4.6から進んで、別の列を設定する。- イメージングは、24ウェルディッシュ21内に位置し、細胞接着（ 例えば、コラーゲンまたはラミニン）がECM分子の選択で被覆されたガラスカバースリップ上に直接、板細胞を行う場合。ここでは、0.1〜0.5 mg / mlのコラーゲンI（ 表3）を使用します。
ハム5.ソート単離直後筋由来線維芽細胞。
- すぐに分離した後に、線維芽細胞前駆細胞を精製するために、以下の変更を加えて上記のようなプロトコルを採用する：
- すぐに一度100μmのセルストレーナーしかし、その後、再び40μmのストレーナーも完全培地とフィルターで分離細胞を再懸濁した。 6分間657×gでPBSとスピンの5ミリリットルを追加します。
- バッファをソートするMACSで細胞を再懸濁し、室温で15〜30分間抗ヒト線維芽細胞のマイクロビーズでインキュベートする。
- LSカラムとミディMACSセパレータ（ 表3）を使用し、40μmのプレ分離フィルタをインストールします。
- 必要な純度に依存して、1つまたは2つのソートを実行し、血清含有培地中にできるだけ早く細胞を転送し、カウントを行い、所望の密度でプレートアウト
6.免疫細胞化学染色（1日、一晩）。
- フィックス穏やかに攪拌しながら、10分間氷冷したPBSで8％パラホルムアルデヒドの等容量を添加することにより、それらのウェル中の細胞。 10分間吸引固定液後、PBSで2回洗浄する。
- PBS中の1％ウシ血清アルブミン（BSA）中に少なくとも1時間、細胞表面抗原、ブロック細胞を免疫染色した後、関連する一次抗体（ 表4）でプローブする。
- 細胞内抗原は、次にブロックし、一次抗体でインキュベートし、1％BSAと10分間のNaN 3（0.01％）を含むPBS中0.2％トリトンX-100の添加により固定した後に細胞を透過。ロッキングプラットフォーム上で穏やかに撹拌しながら、すべての一次抗体のインキュベーションを室温で一晩（または4℃で）実行します。
- 未結合の一次抗体を除去し、冷PBSで細胞を3回洗浄する。室温での種特異的蛍光標識二次抗体と1時間インキュベートした（ 表4）インキュベートする。
- 除去後に未結合の二次抗体を、PBSを3回交換して細胞をリンスした後、蛍光DNA色素ヘキスト33342（1μg/ ml）をロッキングプラットフォーム上で10分間この溶液で対比染色。
- 細胞表面抗原および細胞内抗原の両方を同時に可視化するために、第一の一次抗体とプローブセルは、それらの適切な二次抗体、続いて細胞表面抗原である。次に、冷たいPFA、透過性に、ブロック内のセルを再修正し、それらの適切な二次抗体が続く細胞質や核抗原に対する一次抗体とインキュベートする。
- 染色後、湾曲鉗子を使用してウェルからカバースリップを除去し、蒸留水を用いてカバースリップの背面をすすぐ。カバースリップセルはガラス顕微鏡スライド上に退色防止封入剤22セットのドロップを下にスライドさせて置きます。
細胞の免疫蛍光染色と組み合わせた7。オイルレッドO染色（2時間）
- 明らかにする5,23 -オイルレッドO（（[4-（Xylylazo）キシリル]アゾ）-2-ナフトール1）で染色することによって、24ウェルディッシュに播種した細胞の脂質含量。最初の99％のトリエチルホスフェート及び40mlの蒸留水60ml中にオイルレッドOを500mg溶解させることにより、オイルレッドO（w / v）の0.5％の原液を調製。使用するまで暗所で室温でこの溶液を維持します。
- 使用日に、オイルレッドOストック溶液を蒸留水8mlを12mlを含む36％（w / v）のトリエチルホスフェート作業溶液を作る。 （画質を損なう）全て結晶化し、オイルレッドOを除去するためにろ紙番号42を介して、この溶液を濾過する。
- ゆっくりと溶液を6分間1200×gでスピンされ、その後1時間、水浴中でこの作業溶液を温める。上清を除去し、ろ紙（番号42）を介して再びフィルタリングし、新鮮な20ミリリットルチューブに移す。
- 細胞は、固定透過処理および免疫染色し、PBSを除去し、オイルレッドO /トリエチルPHOSの500μlを添加した後60分間ウェルにフェートソリューション。細胞膜透過処理のために、ここで使用される濃度のトリトン-Xは、細胞の脂質含量23には影響しません。
注記：オイルレッドOは540と580の間の波長によって励起され、したがって、テキサスレッドフィルタは、蛍光顕微鏡23にオイルレッドOの放出を検出するために用いることができる。細胞が非常に強く染色される場合は、オイルレッドOからの蛍光発光は、時折遠く赤チャンネルに漏れることに注意してください（ すなわち 、非常に高脂肪含量）。 - インキュベーション後、過剰オイルレッドOを除去し、500μlのPBSで細胞を5回すすいでください。セクション6に記載したように、テキサスレッドフィルター（無料シフト、EX BP 40分の560、BS FT 585、EM BP 630を使用して両方の明/位相差顕微鏡によりまたは落射蛍光顕微鏡によってオイルレッドO染料を検出し、免疫染色用としてカバースリップをマウントします/ 75、カールツァイス）。
8.その後の項のために蛍光顕微鏡から顕微鏡写真の取得alysis
注：確認し、定量的に比較することがスライドし、同一の条件（ 例えば、暴露、カメラと取得の設定など ）で撮影し、同じ顕微鏡セッションで撮影し、同ソリューションで染色する。すべての買収後のフォーマットも同一であることと、デジタル画像24の推奨ガイドラインに厳密に従うべきである。
- 画像取得（広視野顕微鏡検査）のために、顕微鏡および蛍光光源をオンにし、蛍光光源がウォームアップして安定させるために時間の推奨値に向けて出発。
- カメラへの光路を遮断することによって、カメラの暗電流を設定します。最大解像度で画像を取得し、その後に取得した画像を補正するためにこれを使用する。
- 液体ライトガイドによって送達落射蛍光（フェニルメチルシリコーンオイルが充填されたフッ素樹脂製のフレキシブルチューブ）aで免疫蛍光プローブを照らすND赤を通して可視化された信号（フィルタは、逆落射蛍光顕微鏡（10X、20X、上の帯域通過フィルタ（フィルタは49 DAPIシフト自由に設定）、緑（フィルタがフリー44 FITC特別なシフトを設定）、青、無料の45 HQテキサスレッドシフトを設定40Xは、）は、それぞれ0.25、0.75、0.95の開口数でアポクロマート目標を計画しています。
- ピクセルの飽和を回避するために、画像取得ソフトウェアの「露出オーバー」機能を使用して、各蛍光マーカーのための検出器の直線範囲内で最適な露出を見つける。各蛍光標識のための標準化された露出をメモします。
- 個々のチャネルをキャプチャし、グレースケールまたは疑似カラーTIFF（タグ付き画像ファイル形式）、最も高いビット深度の画像ファイルを保存する（好ましくは16ビット- 65536グレー値）記録装置により提供される（ 例えば 、CCD（電荷結合素子）を顕微鏡に装着冷却） 。 1388 X 1040以上に画像解像度を設定します。既知のディのスケールバーまたはオブジェクトを含めるようにしてください画像でmensions。
- 可能な場合には、情報25の損失を防ぐために.JPEG形式で16ビットタグ付き画像ファイルフォーマット（.TIFF）内のファイルとしないを保存します。
- 照明の均一性上の懸念がある場合（顕微鏡でバンドルされたソフトウェアは、このための自動補正を有していてもよい）細胞なしカバースリップの「フラットフィールド」の画像を取ることなく、染色し、実験的なスライドと同じように取り付けられた。これは、画像解析ソフトにおける照明欠陥ポスト取込みを補正するために使用することができる。
- 画像取得（共焦点顕微鏡）については、各撮像実験（飽和を回避する）ための検出器利得及びレーザパワーを最適化する。一般的に、測定された蛍光はレーザパワーレベルに比例する。 （改善された解像度が特に強い信号に対して0.5軽やかで達成することができる）最高の信号対雑音比を達成するために '1エアリー」にピンホールのサイズを設定する。アリを介してz軸に沿って異なるレベルで光学切片を取るibody標識細胞および画像解析のために、各チャネルの16ビット最大投影を保存します。
蛍光9.実行測定は、画像処理および解析ソフトウェア（視野あたり5分）を用いた核転写因子をラベル付き。
- クリックして別のものに1画像をドラッグしてアクセス個々のTIFF画像ファイルやオーバーレイ対応するチャンネル。各チャネルは、その後、レイヤーパネルの別の層として表示されます。
- 層が下に同時に可視化することができるように、フィルタメニューから明るく選択します。また、50％にトップ層の不透明度を調整します。
注：TIFF画像は、情報を失わずにファイルサイズを下げるために「ロスレス」のLempel-Zivの-ウェルチ（LZW）データ圧縮で保存することができます。 - 分析窓（解析>データ点を選択する>カスタム）で、分析を選択し、必要な測定を選択する（ 例えば、統合された密度、densitを意味するyは、円形、ヒストグラム等）。それらの横にあるボックスをオフにして、不要な測定を破棄します。面積の測定は、分析>設定された測定規模μmのクリックで必要な場合。定規ツールが自動的に表示されます - スケールバーの長さをトレースし、マイクロメートルでの既知の長さを入力します。ソフトウェアは、平方ミクロンに面積の測定に変換します。
注：ヒストグラム解析を選択した場合は測定が記録されている場合、追加のフォルダが表示される（の位置を選択することができる）の顕微鏡写真の個々の選択領域だけでなく、すべての個々の選択の合計8ビットヒストグラムと（この複数選択が行われた場合には常に）ヒストグラム-1として表示されます。この分析は、16ビット形式のソフトウェアによって実行されるが、関心のある対象全体にピクセル強度の分布を調べるために非常に有用であることはできない。 - 核蛍光強度を分析するために最初repreを構築ヘキストまたはDAPI染色したDNAのためのsentative「色の範囲の選択マスク」（CRSM）は、核の領域を定義します。所望のチャネルの画像が重ねられると、他のすべての層があるべきながら、唯一のヘキストチャネル層は、（青色に変わる）が選択され、その後層が強調表示されているレイヤ]タブでそれに隣接した「目のアイコン」を確保することによってビューに残されるべきである選択解除。ブレンドドロップダウンがレイヤ]タブには「標準」に設定されていることを確認してください。
- 色範囲ダイアログボックスを開きます（>カラー範囲の選択）と「サンプリング色」に選択オプションドロップダウンを設定する。 「クイックマスク」（赤の背景）に設定された選択プレビュー（ '+'記号が表示されます）Shiftキーを押し、表示されたスポイトツールを使用して核内クリックすることで、核内のすべての青の色調を選択します。
- 不要なトーンが選択されている場合は、Altキーを押して（ '─'signが表示されます）とクリックして、それらを削除それらの上に。手動でのみ選択されたカラートーンが測定に含まれており、「ローカライズされた色のクラスターは「チェックしないままにしておく必要があり、そのようにゼロにあいまいさのスケールを維持します。
- - プログラム固有の抽出ファイル（.AXTファイル）などのコンピュータのハードディスクにこのCRSMを保存します。核、ロード、更新、およびCRSM（セレクト、色範囲、ロード）を保存する別のランダムフィールドを持つ。核の選択が代表的なものであることを保証するために少なくとも5つのランダムフィールドにこれを行います。
- 人間の目はグレーの26の濃淡を変えるの間よりも、色の異なる色合いを区別するより良いことができるので機能を分離するためにマスクを作成するためのグレースケール画像の色のバージョンを使用してください。
- 染色のためにセグメントの核の領域に核CRSMを使用してください。核たら画像>調整>しきい値をクリックして選択してきたと核が黒くなるように、すべての方法スライダを右に移動。また、右クリックして、「塗りつぶし」、次に選択する」に入力します。黒」を選択します。 [選択]> [インバースをクリックして、今、すべての背景を（オプションが表示された場合は選択する」に記入：ホワイト '）削除するDelキーを押します。これは本質的にあなたの選択に基づいて画像を二値化する。その後、重複する核（フィルター>バイナリイメージ>流域機能分離）を分離するフィルター]タブから流域プラグインをロードします。
- 多くの核が重く重複している場合は、それらを選択解除して分析から核を除去（Altキーを押しながら、緩く投げ縄ツールでそれらの周りに描く）。
- 今バイナリ核層の上には、個々の核を選択するには、色の範囲と>影>を選択するために行く。いずれかの黒核内の代替保留シフトとクリック。すべての核はすぐに選択されます。そして、その層を選択し、すべての選択を解除して、核内転写因子染色（例えばミオゲニン）を含む層にこの選択を転送他の層。マーチングラインは現在、ミオゲニンチャンネル内の核の位置が表示されます。
- 疑似カラー画像で作業する場合のみ（レイヤ]タブの右）チャンネルパレットをクリックして、唯一の緑のチャンネルを（画像は今グレー表示されます）を選択します。次に画像>モード>グレースケールをクリックしてください。警告は、[OK]をクリックし「目に見えるレイヤーを統合し、非表示のレイヤーを破棄」が表示されます、その後、別の警告がもう一度[OK]をクリックして「他のチャンネルを破棄」と言うだろう。グレースケール選択した核の唯一の単層は今、レイヤーパレットで存在するであろう。
- 選択した原子核のデータを取得するために計測ログに記録し測定をクリックします。層を分析する場合（ 例ミオゲニン染色）既に、単にレコードの測定を押して、生の16ビットグレースケール画像である。
- 輸出は、お好みの場所にTXTファイルとして測定を選択した。次いで、これらをさらに処理し、他のデータ処理ソフトウェアpを解析することができるackages
注：必要に応じて、[編集]> [ステップ後方コマンド（プレス同時にAltキー、CtrlキーとZキーのすべてが）以前のすべてのレイヤを復元します。 - 非特異的バックグラウンド蛍光の結果は、定量的および蛍光強度の測定結果と同程度であるためには27の正しいは、常に信号と背景の混合物である。
- 四角い選択ツールを選択し、「固定サイズ」をチェックし（必要に応じて、以上、画像内の細胞の集密度に応じて）20×20ピクセルを選択します。シフトを押さえながら、視野全体に広がる10以上の背景領域を選択します。計測ログでプレス 'レコードの測定」。
- （測定ログの「平均グレー値」として与えられた）すべての10選択した背景領域の画素当たりの平均積算密度（すべてのピクセルのグレー値の合計）を計算します。 （対象物体の画素数、画素当たりの平均バックグラウンド密度を掛け
- 最終的なバックグラウンド補正値を得るためのオブジェクト、元の統合された密度から減算バックグラウンド蛍光。このアプローチは、非特異的バックグラウンド蛍光のフィールドの変化にポテンシャル場を占める。
注：この修正は、最終的な値にかなりの影響を有するのみ真正な背景領域を選択することが最も重要である。選択を行う際に、拡大鏡を使用して拡大すると、お勧めします。- また、一般的な背景は、集積密度にもっと貢献するローカライズされた核の背景信号の任意の潜在的な影響を最小限に抑えるために（核あたりの平均グレイレベル/強度をとると同じ）をピクセル単位での核の面積で補正値を分割することが有用であり得る核の大きさ（ 図3C）を増加さを持つ値。
- 最終的なバックグラウンド補正値を得るためのオブジェクト、元の統合された密度から減算バックグラウンド蛍光。このアプローチは、非特異的バックグラウンド蛍光のフィールドの変化にポテンシャル場を占める。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
精製された筋原細胞及び線維芽細胞は、脂肪生成のためのそれらの可能性を評価するための任意の場所の間で7〜30日間の脂肪生成栄養培地、続いて三日間脂肪細胞分化培地で培養することができる。脂肪生成および筋原性系統マーカーのための免疫染色と組み合わせて、精製された細胞集団を用いて、オイルレッドO染色のみ線維芽細胞画分は、脂肪細胞への分化が可能であったことを示した（ 図2）。線維芽細胞による脂肪の大量の蓄積は、肉眼（パネルA）に表示されており、それらの完全な分化は、核PPARγ（ 図2のパネルB＆Cおよび図3）の非常に強い発現によって示されている。 15日間の処置により、これらの細胞は、それらの基質（パネルD）に残っているTE-7（結合組織抗原）をリリースしている。これとは対照的に、筋原細胞がデスミンとミオシン重の発現を含む彼らの正常な表現型を維持チェーン（ 図2のパネルE＆F）および核PPARγ（ 図3C）をアップレギュレートしないでください。
筋原細胞（デスミン+）の分野の定量分析の例を図3に示す。パネルBは、フィールドを分析示し、パネルAは、（バックグラウンド補正後）の定量化された蛍光強度を示す。この方法は、明らかにこの特定の播種密度と時間の時点で、個々の核内ミオゲニンの発現の変化を示している。 図3Cは、直接セルごとのレベルで異なる細胞型において転写因子のレベルを比較するための方法の有用性を示す。ソートされたCD56 +筋原細胞が脂肪細胞誘導培地への曝露後に非常に低いレベルを維持する一方で、筋線維芽細胞の脂肪生成転写因子PPARγの高レベルを発現する-ここではCD56があることを示している。
図1：免疫磁気ビーズ選別によって得られた筋原細胞及び線維芽細胞の精製集団（AB）培養1週間後には、筋原細胞が細胞表面の細胞接着分子CD56（N-CAM）、および筋特異的中間フィラメント、デスミンを発現ソート。原子力KI-67発現は、これらの細胞が増殖しているという証拠を提供する。膜、細胞質および核成分の染色プロトコルのステップ6.5に記載されている。（CD）筋原細胞が線維芽細胞マーカーTE-7を発現しない。人間の筋肉に由来し（E）、線維芽細胞が、TE-7、および（F）を発現する膜貫通血小板由来増殖因子受容体α（PDGFRα）。スケールバーは、（A）= 20ミクロン;（B、C＆E）= 200ミクロン（D＆F）50＆＃181; M この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：ヒト筋肉由来のCD56 - / TE-7 +線維芽細胞およびCD56 + /デスミン+筋原細胞脂肪細胞誘導培地（AIM）で培養した。 MACSによって単離し（A）線維芽細胞を培養したときに脂肪細胞誘導培地（AIM）で脂肪細胞に分化し、これは、オイルレッドO染色後、肉眼で容易に見ることができる。筋原細胞はAIMで同じ時間後に脂肪細胞への分化の証拠を示さず、非常に限られたオイルレッドO染色を示した。（B＆C）HUMAN筋肉由来の線維芽細胞は、非常にAIMで培養後にPPARγおよびCEBPα（図示せず）を発現する。（C）線維芽細胞は、それらがそれらの周りに密なネットワークを形成し、残りの細胞内のECMタンパク質を放出脂肪細胞に分化する。（E）筋原細胞は、筋原性を維持形態およびそのようなデスミン及び（F）ミオシン重鎖（MHC）、端末筋形成分化のマーカーとしての系統マーカーの発現、及び脂質を蓄積することができない。スケールバーは、次のとおりです。（B、D）= 200ミクロン（E、F）=100μmで、（C）=100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：サンプルデータを得FRオムに記載の画像解析方法（Adobe Photoshopの拡張手法）を用いて培養物を免疫標識。 （A）無血清分化培地中で24時間後の筋特異的核転写因子ミオゲニンためのセル単位の蛍光強度プロット。デスミン+ /ミオゲニン+ヒト筋原性前駆体（B）の代表的な顕微鏡写真。スケールバーは、以下のとおりです。ソートされたCD56 + /デスミン+筋原集団（CD56 +）とCD56から個々の核における（B）= 50ミクロン（C）のPPARγ蛍光強度- / TE-7 + /PDGFRα+ /コラーゲンVI +細胞（CD56。 - ）15日間脂肪細胞誘導培地で培養後。蛍光値は、2つの細胞型間の核の大きさの変動を考慮するために、核面積に対して正規化した。 （A）及び（B）の水平黒いバーは平均値を示す。52049 / 52049fig3large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 培地成分 | 濃度 | カタログなし。 | 商業的供給源 |
| ヒト骨格筋成長培地： | C-23060（記載されているすべての要素を含んだ「使用する準備」カムズ） | ||
| 骨格筋基礎培地 | - | Promocell社 | |
| ウシ胎児血清 | 15パーセント | Promocell社（5％）＆FCSゴールド、PAAラボラトリーズ（10％） - カタログ番号。 A15-151 | |
| フェチュイン（ウシ） | 50μg/ mlの | Promocell社 | |
| 上皮成長因子 | 10ng / mlの | Promocell社 | |
| 塩基性線維芽細胞増殖因子（組換えヒト） | を1ng / mlの | Promocell社 | |
| デキサメタゾン | 0.4 / mlの | Promocell社 | |
| インスリン（組換えヒト） | 10μg/ mlの | Promocell社 | |
| ペニシリン | 100 U / mlの | シグマ | |
| ストレプトマイシン | 100μg/ mlの | シグマ | |
| L-グルタミン | 292 / mlの | シグマ | |
| 筋形成分化培地 | C-23260 | ||
| 骨格筋基礎培地 | - | Promocell社 | |
| ペニシリン | 100 U / mlの | シグマ | |
| ストレプトマイシン | 100μg/ mlの</ TD> | シグマ | |
| 注：Promocell社、ハイデルベルク、ドイツ。シグマアルドリッチカンパニー株式会社、ドーセット、イギリス | |||
表1：細胞培養培地成分および濃度。
| 培地組成 | 濃度 | カタログなし。 | 会社 |
| 前脂肪細胞成長培地 | C-27410（使用する準備ができて） | ||
| ウシ胎児血清 | 0.05ミリリットル/ mlの | Promocell社 | |
| 内皮細胞増殖サプリメント | 0.004ミリリットル/ mlの | Promocell社 | |
| 上皮成長因子（組換えヒト） | 10ng / mlの | Promocell社 | |
| ペニシリン | 100 U / mlの | シグマ | |
| ストレプトマイシン | 100μg/ mlの | シグマ | |
| グルタミン | 292 / mlの | シグマ | |
| D-ビオチン | 8.0 / mlの | Promocell社 | |
| インスリン（組換えヒト） | 0.5 / mlの | Promocell社 | |
| デキサメタゾン | 400 ng / mlの | Promocell社 | |
| IBMX | 44 / mlの | Promocell社 | |
| L-チロキシン | 9 / mlの | Promocell社 | |
| シグリタゾン | 3 / mlの | Promocell社 | |
| ペニシリン | 100 U / mlの | シグマ | |
| ストレプトマイシン | 100μg/ mlの | シグマ | |
| グルタミン | 292 / mlの | シグマ | |
| 前脂肪細胞分化培地 | C-27436（使用する準備ができて） | ||
| D-ビオチン | 8.0 / mlの | Promocell社 | |
| インスリン（組換えヒト） | 0.5 / mlの | Promocell社 | |
| デキサメタゾン | 400 ng / mlの | Promocell社 | |
| IBMX | 44 / mlの | Promocell社 | |
| L-チロキシン | 9 / mlの | Promocell社 | |
| シグリタゾン | 3 / mlの | Promocell社 | |
| ペニシリン | 100 U / mlの | シグマ | |
| Streptomycin | 100μg/ mlの | シグマ | |
| グルタミン | 292 / mlの | シグマ | |
| 脂肪細胞の栄養培地 | C-27438（使用する準備ができて） | ||
| D-ビオチン | 8.0 / mlの | Promocell社 | |
| インスリン（組換えヒト） | 0.5 / mlの | Promocell社 | |
| デキサメタゾン | 400 ng / mlの | Promocell社 | |
| ペニシリン | 100 U / mlの | シグマ | |
| ストレプトマイシン | 100μg/ mlの | シグマ | |
| グルタミン | 292 / mlの | シグマ | |
| 注：Promocell社、ハイデルベルク、ドイツ。シグマアルドリッチカンパニー株式会社、ドーセット、イギリス | |||
表2：脂肪生成細胞培養培地の組成物。
| 機器/試薬の名称 | 会社 | カタログなし。 | コメント/説明 |
| 細胞培養 | コラゲナーゼD | ロッシュ | 11088866001 |
| ディスパーゼII | シグマ | D4693-1G | フィルターは、使用前に滅菌されなければならない |
| トリプシン/ EDTA | （Gibco）をインビトロジェン | 15400-054 | |
| 100μmのセルストレーナー | BDバイオサイエンス | 352360 | |
| コラーゲン溶液（0.1％酢酸中に3mg / ml）を | シグマ、ドーセット、イギリス | C8919 | |
| のMinisart SRP15シリンジフィルター（0.2μm）で | 縫工筋 | 17573ACK | ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）膜 |
| CD56人間マイクロビーズ | ミルテニーバイオテク | 130-050-401 | 磁気活性化細胞選別（MACS） マイクロビーズの限られた貯蔵寿命の点に注意してください。 |
| 抗線維芽細胞マイクロビーズ（ヒト） | ミルテニーバイオテク | 130-050-601 | |
| 40μmのプレセパレーションフィルター | ミルテニーバイオテク | 130-041-407 | |
| 大細胞Collumns | ミルテニーバイオテク | 130-042-202 | これらの列は、流れ抵抗が付属しています。流れ抵抗の使用は、ここで説明した高筋原純度を得る必要はない。 |
| LSカラム | ミルテニーバイオテク | 130-042-401 | |
| ミニマックスセパレーター | ミルテニーバイオテク | 130-042-102 | このセパレータは、大きなセル列ではなく、LSカラムに適合します。 |
| MidiMACS | ミルテニーバイオテク | 130-042-302 | |
| MACS multistand | ミルテニーバイオテク | 130-042-303 | |
| BSA | シグマ | フィルターは、使用前に滅菌されなければならない | |
| オイルレッドO | シグマ | O0625 | 脂質染色 |
| リン酸トリエチル | シグマ | 538728 | |
| ワットマン紙 | シグマ | Z241121-1PAK | 42号、無灰。フィルタは、半円形を作るために、円形濾紙を折る調製するために、その後、円錐形状を形成するために再び半分に半円を折る。フィルタリングのための漏斗の中にコーンを取り付けます。 |
| 取り付け | |||
| ゴールド褪色防止試薬を延ばす | 分子プローブ、Invitrogen社 | P36930 | これはDAPIの有無にかかわらず購入することができ、初期蛍光を消光しない。 |
| AxioVision | カールツァイス | お問い合わせツァイス | 画像の初期同期ソフトウェア |
| Adobe PhotoshopのCS5は、拡張 | アドビ（ピューコンピュータから購入） | ADPH16982 * | 画像解析ソフトウェア |
表3：機器および試薬。
| 名前/抗原 | 抗体種及びアイソタイプ | クローン名 | 使用のために希釈 | カタログなし。 | |
| 筋原マーカー： | |||||
| CD56（N-CAM） | マウスMCのIgG 1 | MY-31 | （1：100） | 347740 | BD |
| デスミン | ウサギMCのIgG 1 | D93F5（XP） | （：250 1） | 5332S | NEB |
| ミオゲニン | マウスMCのIgG 1 | F5D | （1:50） | F5D | DSHB |
| ミオシン重鎖 | マウスIgG2bのmcは、κ軽鎖 | MF20 | （1：200） | MF20 | DSHB |
| 線維芽細胞/結合 | |||||
| TIssueマーカー： | |||||
| 抗ヒト線維芽細胞 | マウスMCのIgG 1 | TE-7 | （1：100） | CBL271 | ミリポア |
| PDGFRα | ウサギMCのIgG | D13C6 | （1：500） | 5241 | NEB |
| 増殖マーカー： | |||||
| Ki67の | ウサギMCのIgG | SP6 | （1：200） | MP-325-CRM1 | MD |
| 脂質生成の | |||||
| 転写因子： | |||||
| PPARγ | マウスMCのIgG 1 | E8 | （1:20） | SC-7273 | サンタクルスバイオテクノロジー |
| キー：MC：モノクローナル、PC：ポリクローナル、DSHB：発達研究ハイブリドーマバンク、アイオワ州米国; | |||||
| NEB：New England Biolabs社、英国。 MD：A.メナリーニ診断、英国。 BD：BD Bioscience社、英国。 | |||||
表4：一次抗体。
| 抗原 | 抗体種及びアイソタイプ | 希釈 | カタログなし。 | 会社 |
| Alexafluor488 | ヤギ抗マウスIgG（H + L） | 1000：1 | -11001 | MP |
| アレクサ594 | ヤギ抗マウスIgG（H + L） | 1000：1 | -11005 | MP |
| アレクサ594 | ヤギ抗ウサギIgG（H + L） | 1000：1 | -11012 | MP | </ TR>
| キー：H + L =重鎖及び軽鎖; MP：分子プローブ、インビトロジェンライフテクノロジーズ、ペイズリー、英国 | ||||
表5：二次抗体。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我々は、筋生検材料の少量の試料からのヒト筋肉由来前駆体の選択的濃縮のためimmunomagentic選別手順を記載している。この手法は、線維芽細胞にヒト筋肉由来の文化の損失を克服するための、だけでなく、筋肉由来前駆細胞の異なる集団のユニークな振る舞いを理解するための私たちの研究室では非常に貴重なてきた。精製した後筋原細胞は、タンパク質および/または遺伝子発現の変化を調べ、または下流の実験のために使用することができる。
我々はまた、詳細蛍光顕微鏡の顕微鏡写真に関心の特定の領域を分析する迅速かつ簡単な方法で細胞精製に加えて。蛍光顕微鏡からデジタル画像は細胞生物学者を抽出するための情報が豊富に含まれています。実際の画素は必ずしも人間の目には識別できないデータを保持する。この技術では定量的なデータは、多数の周りを得ることができる集団における個々の細胞の。フローサイトメトリーと比較した場合、画像解析のユニークな特徴は、細胞形状orcell - 細胞相互作用の変化を用いたタンパク質発現の変化を相関させる能力である。さらに、最適化された代表的な選択マスクを作成して保存する能力は、迅速、正確かつ再現可能な測定は、それによってユーザーバイアスの可能性を低減ビューの多くの分野にわたって行うことを可能にする。
MACSに基づく細胞の精製
この方法の1つの利点は、（収率が高くなるとき）の細胞が首尾よく単離直後または培養物中で数日後のいずれかで精製することができることである。
これがカラムを彼らの通過を妨げ、そしてさらなる拡大と実験のために取得した増殖細胞の割合を減少させるので決定的に、筋原細胞が選別前にコンフルエントになるまで許されるべきではない。
tは ">得られた初期の組織サンプルに応じて、この段階で、培養物中の非接着性赤血球の多数が存在し得る。方法は、しかしながら、この筋由来細胞を不要な化学的ストレスを回避するために、選択的に溶解赤血球に存在するステップが回避される。我々は、人間の筋肉由来細胞の初期の文化の赤血球のいずれかの注目すべき負の影響は確認されていませんし、筋原細胞が付着一度これらの赤血球は、メディアの変化によって除去される。直前に選別する細胞分離の他の方法（ 例えば 、他の穏やかなプロテアーゼまたはEDTAに基づく方法）は、細胞表面抗原の発現が低いかまたはトリプシン消化に対して特に感受性である細胞のために使用することができる。ヒト筋原細胞上のCD56の発現が強く、（ここで説明する抗体を用いてアッセイした）短いtrypsinsationに耐性である。
これは、並べ替えバッファはカルクを阻害するEDTAが含まれていることが重要であるイウム依存性細胞 - 細胞接着。これは、ソート用の単一細胞懸濁液を得た（と維持）のために非常に重要です。ソートされるセルの数、形状及び大きさに応じて、分離塔（ 表3参照）について説明するための選択肢がある。
保持された細胞を放出するために、磁界からカラムを削除すると、そのように（スカート場合でも）、そのコレクションチューブを確実に難しいことができ、輸送中の細胞の損失を避けるために、カラムに非常に近い位置にホルダー内に配置される。
我々は、骨格筋由来のヒト一次細胞で使用するためにこの技術を説明してきたが、このプロトコルは、簡単に特定/ユニークな細胞表面マーカーが知られている他の細胞タイプに適合させることができる。他の利点は、全体の手順は、層流キャビネットの無菌作業環境で行うことができるという事実を含む。また、MACS手順が低いためのFACSソーティングに比べて細胞に緩やかで剪断力及び大きなセルのために特別な利点であることができる。使用される磁気ビーズは、培養中、小、非毒性かつ生分解性である。実際、MACSに成功他の細胞型の数の精製および研究のために適用されている。
この技術の1つの制限は、MACSを簡単に同時に複数のマーカーを行うことができないことである。また、細胞のマーカーとサイズの量は、その後、選別工程中に確認することができない。
画像収集と分析を最適化するための考慮事項
ここで実証された画像解析方法は、細胞の大集団でセル単位でのタンパク質の発現レベルの変化を解明するための強力なツールを提供する。広く利用可能なソフトウェア·パッケージに層施設と選択マスクを利用することにより、実験者は客観的に可能にするために、複数の画像間で異なる蛍光シグナルを選択することができます個々の特徴の定量化、およびそれらのコンポーネントの任意の数。我々が正常に定量化し、直接的に脂肪生成チャレンジに曝露され、異なる細胞集団における転写因子の発現の範囲を比較するためにこの方法を使用している。
必要に応じて（特定のマーカーを表す）を各蛍光チャネルは、マルチカラー免疫標識実験のために有用であり、他のものから別々に維持し、オンまたはオフにすることができる。
蛍光顕微鏡28から定量的および半定量的なデータを抽出しようとすると、多数の要因を考慮しなければならない。これらへの注意がなされるべき基本的な半定量的な測定を可能にする。多くの場合、研究者は、関心の異なるタンパク質を標識する蛍光色素の数を使用する。最も重要で個々の発光スペクトルとを区別できるようにする能力である。ほとんどの場合、これは、選択excitatによって達成される同時に複数の蛍光色素のイオン。しかし、発光および/または励起スペクトルは有意に重複し、または不十分なブリードスルーまたはクロストークが得られた画像データの正確性が損なわれる可能性があり、次いで、濾過されている場合。スルーブリード不適切な検出チャネルにおいて蛍光発光の通路であり、発光スペクトル29,30の重なりによって生じる。
考慮すべき点がある：、よく分離された励起および発光スペクトルを有する蛍光色素を選択することは非常に選択的な励起波長を用いて（共焦点顕微鏡でレーザーによって達成される）、発光フィルタセットが不要な波長を排除するために十分にストリンジェントであることを保証し、多色撮像を行う最長で（ すなわち 、「最も赤い'）吸収スペクトルは、一般に発光スペクトルに対し、短波長（青色光）に偏っているという事実を考慮して、最初のピークの発光色素を波長より長いヴァヴェルに偏っているengths（赤色光）。蛍光標識のスペクトルは、Invitrogen社が提供する「蛍光スペクトルビューアー」でご利用いただけます。
高品質目標を使用すると、分析に宛てた画像のために重要である。高い開口数（> 1.3）最高の倍率は広視野顕微鏡カメラに適合されるべきである。広視野および共焦点顕微鏡の両方で、NAは開口数の関数で29平方としてz軸の解像度が向上するように、重要である。どこで、球面収差と色収差29の両方に補正しているプラン·アポクロマートレンズの可能性メーク使用。彼らは前に顕微鏡の対物レンズ29への参入に空間的および時間的コヒーレンスを減らすために光源照明をスクランブルすることにより、照明ムラを軽減するなどの液体ライトガイドを使用することを強くお勧めします。
飽和画素を正しくすることができないように、それは、画像の飽和を回避することが重要であるquantifi最も強烈なグレーレベルでの情報のクリッピングが原因でEDは26値 。
さまざまな「プラグイン」は比較的容易に実施さにフラットフィールド補正手順を可能にするために利用可能である。例えば博士ジョン·C·ラスは、これらの利用可能な無料のオンライン（http://www.drjohnruss.com/download.html）の多くを行っている。これは、基準画像内の対応するものに実験顕微鏡写真における各画素の明るさの比率を使用すると、プラグインを計算し、元に置き換えられている。結果は、画像の明るさの範囲を満たすようにスケールされる。あるいは、ImageJの画像演算部は照明ムラを補正する別の手段である。
それは、検出器29に到達するピンボケ蛍光を防ぐように、いくつかの画像解析のために、共焦点顕微鏡は、選択の方法であってもよい。しかし、このアプローチは、麻痺を制限する、広視野蛍光顕微鏡よりも実質的に長く取ることができ単一のセッションで得られる視野の個々のフィールドの小胞体。
最近、他の方法は、ヒト筋肉組織から筋原細胞の濃縮のために報告されている。 CXCR4 + / CD56 +筋原細胞の正の選択のためにFACSが続く：Bareja 31（のCD11b、CD31、CD34＆CD45用）MACS枯渇の組み合わせを使用していました。この手順は非常に濃縮された筋原集団を生成することができたものの、それはここに詳述する方法よりもかなり長大で、より多くの連続したステップや組織のグラム当たりの下に精製された筋原細胞の低い収率の結果が含まれています。
/ CD56 + /のPax7 +細胞（典型的な衛星細胞）筋原系統potentiだけでなく、骨形成を示すことができる-別の最近の研究では、複数のマーカーを使用し、FACSによるヒト胎児筋からカスティリオーニ32孤立myofibre関連細胞は、CD34があることを示したらは、私たちの仕事との一般的な合意に脂肪生成の可能性を示していない。細胞非筋原性であったが、脂肪生成および骨形成分化することができた-これらの著者はまた、CD34 + / PAX7があることを示した。 CD34におけるCD90発現（筋線維芽細胞33のマーカー）の濃縮+非筋原性画分は、これらの細胞の大部分が成人の骨格筋における脂肪細胞の主な原因であることが示されている線維芽細胞であったかもしれないことを示唆している培養物（参考文献5および図2）。筋肉由来の線維芽細胞はまた、骨形成分化能令状さらなる調査を持っているかどうか。
カスティリオーニ32に記載の方法とは異なり、我々の方法は、再現可能に純粋な筋原細胞培養物の高い収率を得るために、（7とは対照的に）一つだけの抗体を必要とし、層流フードの無菌条件内で迅速に行うことができる。さらにmethodologicaLの違いは、これらの著者は、解離した筋肉から直接細胞を単離し、次いで1週間、私たちが最も頻繁に培養細胞に対し、ソートや栽培の前に、培養液中でこれらに従っていることである。私たちの手では、このアプローチは、細胞によって許容優れています。重要なことは、培養液中の総時間は、2つのアプローチの本質的に同等である。さらに、胎児骨格筋過形成および肥大筋成長34を受けていることを考えると、それは成人の筋肉と比較した場合、筋原性前駆体の収率が胎児筋組織から大きいことは驚くべきことではない
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | Must be filter sterilized before use |
| Trypsin/EDTA | (Gibco) Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 μm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Sigma, Dorset, UK | C8919 | |
| Minisart SRP15 syringe filter (0.2 μm) | Sartorius | 17573ACK | Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane |
| CD56 human Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-050-401 | Be aware of the limited shelf life of microbeads |
| Anti- fibroblast Microbeads, human | Miltenyi Biotech | 130-050-601 | |
| 40 μm Pre-separation filters | Miltenyi Biotech | 130-041-407 | |
| Large Cell Collumns | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here. |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MiniMacs Seperator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | This separator fits the large cell column but not the LS column. |
| MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| BSA | Sigma | Must be filter sterilized before use | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Triethyl phosphate | Sigma | 538728 | |
| Whatman Paper | Sigma | Z241121-1PAK | No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Molecular Probes, Invitrogen | P36930 | This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence. |
| AxioVision | Carl Zeiss | Contact Zeiss | |
| Adobe Photoshop CS5 Extended | Adobe (purchased from Pugh Computers) | ADPH16982* |
References
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibres. J. Cell Biol. 9, 493-495 (1961).
- Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J. Appl. Physiol. 91, 534-551 (2001).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and the Muscle Stem Cell Niche. Physiol. Rev. 93, 23-67 (2013).
- Alsharidah, M., et al. Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture. Aging Cell. 12, 333-344 (2013).
- Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. Human skeletal muscle fibroblasts, but not myogenic cells, readily undergo adipogenic differentiation. J. Cell Sci. 126, 5610-5625 (2013).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138, 3625-3637 (2011).
- Webster, C., Pavlath, G. K., Parks, D. R., Walsh, F. S., Blau, H. M. Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter. Exp. Cell Res. 174, 252-265 (1988).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. J. Vis Exp. , e50074 (2013).
- Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric Self-Renewal and Commitment of Satellite Stem Cells in Muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
- Mackey, A. L., et al. Assessment of satellite cell number and activity status in human skeletal muscle biopsies. Muscle a d Nerve. 40, 455-465 (2009).
- Stewart, J. D., et al. Characterization of proliferating human skeletal muscle-derived cells in vitro: Differential modulation of myoblast markers by TGF-β2. J. Cell. Physiol. 196, 70-78 (2003).
- Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11, 231-238 (1990).
- Clarke, C., Davies, S. Ch. 2. Methods in Molecular Medicine. Metastasis Research Protocols. Brooks, S. A., Schumacher, U. 58, Humana Press. 17-23 (2001).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
- Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).
- Agley, C. C., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. An Image Analysis Method for the Precise Selection and Quantitation of Fluorescently Labeled Cellular Constituents: Application to the Measurement of Human Muscle Cells in Culture. J. Histochem. Cytochem. 60, 428-438 (2012).
- Danoviz, M., Yablonka-Reuveni, Z. Ch. 2. Methods in Molecular Biology. Myogenesis. DiMario, J. X. 798, Humana Press. New York, NY. 21-52 (2012).
- Bergström, J. Muscle electrolytes in man. Determined by neutron activation analysis on needle biopsy specimens. A study on normal subjects, kidney patients, and patients with chronic diarrhoea. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 14, 7-100 (1962).
- Chazaud, B., et al. Satellite cells attract monocytes and use macrophages as a support to escape apoptosis and enhance muscle growth. The Journal of Cell Biology. 163, 1133-1143 (2003).
- Abou-Khalil, R., et al. Autocrine and Paracrine Angiopoietin 1/Tie-2 Signaling Promotes Muscle Satellite Cell Self-Renewal. Cell Stem Cell. 5, 298-309 (2009).
- Timpl, R., Kvonder Mark, Role of laminin and fibronectin in selecting myogenic versus fibrogenic cells from skeletal muscle cells in. 117, 628-635 (1986).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. Fluorescence microscopy. Nat Meth. 2, 910-919 (2005).
- Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem. Cell Biol. 116, 63-68 (2001).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166, 11-15 (2004).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: Focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
- Johnson, J. Not seeing is not believing: improving the visibility of your fluorescence images. Mol. Biol. Cell. 23, 754-757 (2012).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
- Pawley, J. The 39 steps: A cautionary tale of quantitative 3-D fluorescence microscopy. Biotechniques. 28, 884-887 (2000).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
- Brown, C. M. Fluorescence microscopy - avoiding the pitfalls. J. Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).
- Bareja, A., et al. Human and Mouse Skeletal Muscle Stem Cells: Convergent and Divergent Mechanisms of Myogenesis. PLoS ONE. 9, e90398 (2014).
- Castiglioni, A., et al. Isolation of Progenitors that Exhibit Myogenic/Osteogenic Bipotency In by Fluorescence-Activated Cell Sorting from Human Fetal Muscle. Stem Cell Reports. 2, 560 (2014).
- Fukada, S. -i, et al. CD90-positive cells, an additional cell population, produce laminin α2 upon transplantation to dy3k/dy3k mice. Exp. Cell Res. 314, 193-203 (2008).
- Stickland, N. Muscle development in the human fetus as exemplified by m. sartorius: a quantitative study. J. Anat. 132, 557-579 (1981).
