Abstract
La reparación y la regeneración del músculo esquelético requiere la acción de las células satélite, que son las células madre de músculo residente. Estos se pueden aislar a partir de muestras de biopsia de músculo humano usando digestión enzimática y sus propiedades miogénicas estudiados en cultivo. Cuantitativamente, los dos principales tipos de células adherentes obtenidas a partir de la digestión enzimática son: (i) las células satélite (denominadas células miogénicas o células precursoras del músculo), identificado inicialmente como CD56 + y más tarde como desmina + / CD56 + células y (ii) músculo- fibroblastos derivados, identificadas como CD56 - y TE-7 +. Los fibroblastos proliferan de manera muy eficiente en la cultura y en las poblaciones de células mixtas estas células pueden invadir células miogénicas de dominar la cultura. El aislamiento y purificación de diferentes tipos de células de músculo humano es por lo tanto una consideración metodológica importante cuando se trata de investigar el comportamiento innato de cualquiera de los tipos de células en cultivo. Aquí DescrIbe un sistema de clasificación basada en la digestión enzimática suave de las células utilizando colagenasa y dispasa seguido por clasificación magnética de células activadas (MACS), que da a la vez una alta pureza (> 95% de células miogénicas) y buen rendimiento (~ 2,8 x 10 6 ± 8,87 x 10 5 células / g de tejido después de 7 días in vitro) de experimentación en la cultura. Este enfoque se basa en la incubación de la población de células derivadas de músculo mezclado con microperlas perlas magnéticas conjugadas con un anticuerpo contra CD56 y luego pasar las células a través de un campo magnético. Células CD56 + unidos a microperlas son retenidos por el campo mientras que CD56 - células pasan sin impedimentos a través de la columna. Las suspensiones celulares de cualquier etapa del proceso de clasificación pueden ser en placas y se cultivaron. A raíz de una intervención dada, la morfología celular, y la expresión y localización de proteínas, incluyendo factores de transcripción nuclear puede cuantificarse utilizando el etiquetado de inmunofluorescencia con anticuerpos específicos y una imagen Processing y el paquete de análisis.
Introduction
La reparación y la regeneración del músculo esquelético requiere la acción de las células satélite 1, las células madre miogénicas 2,3. In vivo estas células existen en un estado quiescente reversible situado entre el sarcolema y la lámina basal de cada miofibrillas, pero se activan para proliferar, fusibles y diferenciarse como el tejido muscular están dañados, reparar y regenerar 3. Las células satélite se pueden aislar a partir de muestras de biopsia de músculo humano joven y de edad avanzada utilizando digestión enzimática 4 y sus propiedades miogénicos posteriormente se pueden estudiar en la cultura primaria 5. La eficiencia de este proceso de aislamiento con respecto a tanto el rendimiento y la pureza de la población de células depende de los métodos utilizados y puede variar de muestra a muestra. Los dos principales tipos de células adherentes obtenidas a partir de la digestión enzimática son las células satélite (células miogénicas ahora denominados o células precursoras de músculo), identificados inicialmente como células CD56 + / desmina, y mufibroblastos SCLE derivados, identificadas como CD56 - y TE7 + 5 células. Los fibroblastos tienen una tasa de proliferación rápida y no se someten a la detención del crecimiento y la diferenciación terminal irreversible al contacto célula-célula, como las células miogénicas; por lo tanto en poblaciones mixtas, los fibroblastos pueden invadir células miogénicas a dominar la cultura.
Los fibroblastos a menudo se han visto como una irritación para los biólogos musculares, sin embargo, ahora existe un creciente interés en los fibroblastos como células dignos de estudio por derecho propio, en particular, ya que han demostrado tener un papel cooperativo con células miogénicas durante la reparación del músculo 6 . El aislamiento y purificación de diferentes tipos de células de músculo humano es por lo tanto una consideración metodológica importante cuando se trata de investigar el comportamiento innato de ambos tipos de células en cultivo. Activada por fluorescencia de células (FACS) es un método por el cual las células pueden ser ordenados para el estudio adicional y / o se contaron y seanalizada. FACS se ha demostrado para enriquecer de forma fiable células miogénicas humanos, pero el rendimiento de las células para el cultivo posterior hasta el momento no ha sido alto 7. Dado el potencial de replicación limitado de células somáticas, tales como células derivadas de células satélite miogénicas y muy pobre la proliferación y diferenciación asociados con la senescencia 4, se requieren métodos más suaves. Culturas individuales de fibras musculares ofrecen otra, menos agresivo, los medios de obtención de células satélite murinos todavía residente en su nicho sublaminal y después de su activación en la cultura 8,9. Sin embargo, esto a menudo no es posible a partir del material de biopsia de músculo humano (porque las fibras rara vez se pueden obtener de tendón a tendón) lo que significa que esta técnica puede no ser accesible a muchos laboratorios de investigación interesados en el estudio de células derivadas de músculo humanos. Por otra parte, la técnica de la fibra individual sólo proporciona el número de células muy limitadas.
Aquí se describe un sistema de clasificación basada en el gendigestión enzimática TLE de células utilizando colagenasa y dispasa seguido por dos rondas sucesivas de clasificación magnética de células activadas (MACS), que da a la vez una alta pureza (> 95% de células miogénicas) y rendimiento (~ 2,8 x 10 6 ± 8,87 x 10 5 células / g de tejido) para experimentos en la cultura. CD56 se considera el marcador de superficie estándar de oro para la identificación de las células satélite humanos in situ e in vitro 10 11 y proporciona el candidato ideal marcador de superficie para la fijación del talón. En este enfoque anticuerpos CD56 conjugados con óxido de hierro y perlas superparamagnéticas que contiene polisacárido se une a las células y pasa a través de una columna de separación celular magnética de alto gradiente colocado en un fuerte campo magnético 12,13. Las columnas de separación se llenan con una matriz de lana de acero o de hierro esferas ferromagnéticas que sirven para enfocar líneas de campo magnético hacia su superficie generar fuertes gradientes de campo magnético (~ 4tesla) 14. En estas columnas incluso células ligeramente magnéticos son atraídos y absorbidos a su superficie 14. Sin consolidar (CD56 -) las células pasan a través de la columna mientras que las células CD56 + etiquetados con microperlas magnéticas se conservan hasta la retirada del campo magnético 12,15.
Las suspensiones celulares de cualquier etapa del proceso de clasificación se pueden colocaron en placas a la densidad deseada para la experimentación adicional. A raíz de una intervención dada los constituyentes celulares pueden identificarse utilizando inmunocitoquímica, utilizando imágenes de campo amplio o microscopía de fluorescencia confocal y analizados cuantitativamente usando un enfoque de análisis de imágenes que permite una rápida medición objetiva de todas las células marcadas en cualquier imagen dada. En nuestro laboratorio hemos utilizado este enfoque doble clasificación inmunomagnética seguido por análisis de imagen 16 para demostrar que CD56 - fibroblastos humanos transdifferentiate fácilmente en los adipocitos, mientras que las células myogenics de origen satélite son altamente resistentes a esta conversión adipogenic 5.
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Protocol
NOTA: Para los estudios realizados en nuestro laboratorio de todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito para participar y todos los experimentos se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de Ética de Servicio Nacional de Salud del Reino Unido (Comité Ético de Investigación Londres; referencia: 10 / H0718 / 10) y de acuerdo con la Ley de Tejidos Humanos y la Declaración de Helsinki.
1. Preparación inicial antes de la biopsia muscular (15 min)
- Hacer medio de crecimiento de músculo esquelético humano. Para un tubo cónico de 50 ml estéril graduado añadir 2,5 ml de la mezcla de suplemento, 10 ml de suero de ternero fetal, antibióticos (penicilina / estreptomicina) y glutamina a las concentraciones finales correctas (Tabla 1) y luego llenar el tubo hasta 50 ml con basal del músculo esquelético medio.
- Poner 15 ml de medio basal del músculo esquelético en un tubo cónico de 20 ml estériles y pesarlo. Una vez pesada lugar este tubo en hielo. Utilice esta opción para recibir la muestra de músculo humano.
- En otro tubo de 20 ml preparar 10 ml de una solución de enzima colagenasa D y dispasa II a una concentración final de 2 mg / ml de cada uno por disolución de partes alícuotas del stock de estas enzimas en el medio basal del músculo esquelético. Filtros de esterilizar esta solución pasándola a través de un filtro de 0,22 micras. Coloque esta mezcla de enzimas estéril en el baño incubadora o agua a 37 ° C durante 15 minutos para calentar.
NOTA: Esta mezcla de enzimas es ligeramente más suave que la tripsina y mejor mantiene la viabilidad celular 17. - Ponga a un lado una placa de Petri y un par de escalpelos estériles.
2. Músculo procedimiento de biopsia (45 min-1 h)
- Antes de la contratación de los participantes, obtener la aprobación ética completa y aprobación de procedimientos (incluidas las vacunas pertinentes para experimentadores) de todos los órganos de gobierno correspondientes, comités y profesionales de la salud (por ejemplo, ético, institucional, etc. gubernamental).
- Crear un campo estéril alrededor de la pierna de la (por ejemplo, con sábanas quirúrgicas estériles) unad limpiar completamente el área alrededor del sitio de la biopsia con un agente antibacteriano antiséptico (clorhexidina).
- Anestesiar el sitio de la biopsia propuesto en la pierna del voluntario por inyección local de lidocaína al 2% en la región subcutánea que recubre la fascia del músculo vasto lateral.
- Hacer una incisión amplia ~ 5 mm utilizando una hoja de bisturí estéril a través de la piel y la fascia y realizar el procedimiento de biopsia con aguja Bergström 18 con succión adicional.
- El uso de pinzas estériles eliminar el músculo desde el lumen de la aguja y sumergirse en un medio basal en hielo. Transporte el tejido al laboratorio para su procesamiento posterior a la brevedad posible, aunque las células miogénicas viables se pueden obtener después de períodos de 24 hr o más.
- Dé cuenta de la asignatura, limpiar y sellar el sitio de la incisión con múltiples tiras de piel de cierre adhesivas estériles y vestido de forma aséptica con una cubierta impermeable externa.
3. Aislar derivadas de músculo Precursor CeLLS (1 hora, 30 min)
- Retire el tubo que contiene la muestra de músculo y pesarlo (asegúrese de que el tubo esté seca frotando con tejido). Calcular el peso de la muestra de músculo restando el peso del tubo que contiene el medio y la muestra del tubo que contiene medio solo.
- Agitar la solución varias veces para lavar la muestra de músculo de la sangre. Deje que el sedimento muscular a temperatura ambiente durante 30 a 60 segundos.
- Retire casi todo el volumen de medio del tubo, primero utilizando un auxiliar de pipeteado electrónico o aspirador pero dejar aproximadamente 2-3 ml en el tubo.
- Invertir el tubo a una placa de Petri estéril permitiendo que el fluido restante para llevar a la muestra de músculo en el plato; utilizar el bisturí estéril para extraer cualquier músculo restante fragments.Rotate el plato para movilizar el líquido restante y retírela con un pipette.Remove cualquier fragmentos visibles de grasa o tejido conjuntivo.
- Para biopsias que pesan 100-400 mg, añadir 3 ml de tibiasolución de enzima y el uso de escalpelos estériles cortar la muestra de músculo en trozos muy pequeños (<1-2 mm 3).
- Utilizando una amplia ml pipeta calibre 25 elaborar la solución fragmentos musculares y enzima y transferir a un tubo cónico de 10 ml estéril. Lavar la placa de Petri con un mayor 3-5 ml de colagenasa y dispasa solución de enzima y el uso de una más pequeña pipeta de 10 ml recoger los fragmentos musculares restantes y el lugar en el tubo. El volumen exacto no es crítico.
- Colocar el vial en una incubadora a 37ºC (o baño de agua) durante 60 min con trituración (10 ml pipeta) cada 15 min.
- Después de 1 hr terminar la disociación enzimática mediante la adición de un volumen equivalente de medio de crecimiento pre-calentado fresco y pasar la suspensión celular a través de un filtro de 100 micras para eliminar cualquier residuos grandes de miofibrillas. Centrifugar la solución de células filtrada a 657 xg durante 6 minutos a temperatura ambiente (20-25 ° C).
- Resuspender el sedimento celular en 5-7 ml de medio de crecimiento y la placa sin recubrir en un T-25matraz de cultivo tisular. Transfiera esta placa a la incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 7 días. Cambiar el medio cada 48 horas. En esta etapa las células miogénicas son muy pequeñas y redondeadas y difícil de discernir a partir de células no miogénicas.
- En el primer cambio de medio, centrifugar el sobrenadante para sedimentar las células no adherentes. Vuelva a suspender estos en medio fresco y re-placa.
- Después de 7 días en cultivo, asegúrese de que la mayoría de las células miogénicas (y fibroblastos) han unido pero las células aún no han llegado a la confluencia. Purificar los precursores miogénicos y realizar MACS acuerdo con un protocolo desarrollado originalmente por en los laboratorios de Gherardi y Chazaud 19,20 y aún más modificada por nosotros 5.
4. inmunomagnético Bead Clasificación de células basada en la expresión CD56 (1,5 horas)
- Después de 7 días de enjuague de la monocapa celular (que por lo general van a contener 50-60% de células miogénicas 5) con tres bolsasde solución tampón de fosfato temperatura ambiente (PBS) para eliminar cualquier resto de células no adherentes y los restos del aislamiento.
- Trypinize las células (0,04% de tripsina en PBS libre de Ca 2 + con EDTA 0,73 mM) durante 3 minutos. Una vez que las células se han desprendido, añadir 5.10 ml de medio de crecimiento del músculo esquelético para evitar el exceso de digestión. Sedimentar las células por centrifugación a 657 xg durante 6 min a temperatura ambiente (20-25 ° C) y se resuspende en un volumen apropiado de medio completo para el recuento.
- Contar una pequeña muestra de la suspensión de células usando el método deseado (por ejemplo, usando un hemocitómetro o un dispositivo de recuento automatizado) y calcular a partir del número de células y la viabilidad.
- Placa unos pocillos en una placa de 96 pocillos (o mayor buque, si es necesario) para inmunocitoquímica o flujo caracterización basada en citometría de la población antes de la clasificación (fibroblastos y células miogénicas serán los más abundantes tipos presentes células).
- Para el anuncio de suspensión celulard 15 ml de PBS estéril para diluir las células y medio. Centrifugar las células de nuevo y resuspender en 170 l de tampón de clasificación temperatura ambiente (1% de BSA en una solución de lavado MACS, esteriliza por medio de pasar a través de un filtro de 0,22 micras).
- Añadir 35 l de microperlas magnéticas bien mezclados conjugados con un anticuerpo primario CD56 (clon AF12-7H3, 130-050-401) en la solución de células, pipeta para mezclar y dejar incubar durante 15 min a 4 ° C con agitación suave en el punto medio.
- Después de la incubación, se diluye la solución de células y perlas con 10 ml de tampón MACS de clasificación y centrifugar a 657 xg durante 6 min. Resuspender las células en 1 ml de tampón de clasificación.
- Añadir el separador de MACs (imán) a las MACS sostienen stand. Tenga cuidado al añadir imán al soporte debido al campo magnético fuerte. Ranura en la columna y se ajusta el filtro de separación previa. Pipeta 1 ml de tampón de clasificación a través del filtro de pre-separación y columna para la lubricación.
- ImmediatEly después de esto, mezclar suavemente la suspensión celular y gotear toda la 1 ml a través del filtro de pre-separación y en la columna.
- Lavar la columna tres veces con 1 ml (o 500 l) de tampón de clasificación. Recoger las células no retenidas que pasan a través de la columna en la primera clase en un tubo cónico de 50 ml estéril que contiene una pequeña cantidad de medio de crecimiento. Estas células son el primer tipo CD56 - fracción y serán altamente enriquecido para los fibroblastos del tejido conectivo. No deje que la columna se seque entre lavados.
- Después se lava el quitar el filtro de separación y añadir 2,5 ml de tampón MACS a la columna. A continuación, retire inmediatamente la columna del imán y recoger la primera especie CD56 + fracción en un tubo cónico de 50 ml separado presionando el émbolo en la parte superior de la columna.
NOTA: El émbolo encaja muy bien en la parte superior de la columna y puede ser bastante complicado para operar; sin embargo, esto se debe hacer mientras que la columna sigue siendo full del buffer, por lo que se requiere velocidad. Evite apretar el émbolo demasiado duro y rápido. - Antes de chapado evaluar la viabilidad de las células, utilizando, por ejemplo, el ensayo de azul de tripano. Determinar el porcentaje de células viables de los campos 8 x 1 mm 2 de conteo (las dos cámaras del hemocitómetro).
NOTA: Las células puede ser simple o doble ordenados dependiendo de la pureza requerida. Si se hace con cuidado estas células toleran el procedimiento de doble clasificación muy bien y la viabilidad es muy alta> 95%. Por doble clasificación, establecer otra columna, lubrique con 1 ml de tampón de clasificación y proceda desde el paso 4.6.- Si la imagen se va a realizar, células de la placa directamente sobre cubreobjetos de vidrio situadas en placas de 24 pocillos recubiertas con 21 y su elección de la molécula de ECM para la fijación celular (por ejemplo, colágeno o laminina). Aquí, utilizar 0,1-0,5 mg / ml de colágeno-I (Tabla 3).
5. Clasificación de Humun fibroblastos derivadas de músculo Inmediatamente después del aislamiento.
- Para purificar progenitores fibroblastos inmediatamente después del aislamiento, emplear el protocolo que el anterior con las siguientes modificaciones:
- Inmediatamente después de volver a suspender las células aislamiento en medio completo y el filtro una vez a través de un colador de células 100 micras y luego de nuevo a través de un filtro de 40 micras. Añadir 5 ml de PBS y centrifugado a 657 g durante 6 min.
- Resuspender las células en tampón MACS de clasificación y se incuban en microperlas de fibroblastos anti-humanos durante 15-30 minutos a temperatura ambiente.
- Utilice la columna de la LS y el separador de Midi-MACS (Tabla 3) e instalar el filtro de separación de 40 micras.
- Realizar uno o dos tipos dependiendo de la pureza requerida, transferir las células tan pronto como sea posible en medio que contiene suero, realizar un recuento, y depositarse en la densidad deseada
6. La tinción inmunocitoquímica (1 día y la noche).
- Arreglarcélulas en sus pozos por la adición de un volumen igual de 8% de paraformaldehído en PBS enfriado con hielo durante 10 min con agitación suave. Después de 10 minutos aspirado fijador y lavar dos veces con PBS.
- Para inmunotinción antígenos de superficie celular, células de bloques durante al menos 1 h en 1% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS y luego la sonda con los anticuerpos primarios pertinentes (Tabla 4).
- Para antígenos intracelulares, permeabilizar las células después de la fijación mediante la adición de 0,2% Triton X-100 en PBS con 1% de BSA y NaN 3 (0,01%) durante 10 min, entonces el bloque y se incuba con anticuerpos primarios. Realice todas las incubaciones de anticuerpos primarios noche a temperatura ambiente (o a 4 ° C) con agitación suave en una plataforma oscilante.
- Eliminar el anticuerpo primario no unido y lavar las células tres veces con PBS frío. Incubar durante 1 hora de incubación con anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia específicos de especie (Tabla 4) a temperatura ambiente.
- Después de la eliminación deanticuerpos secundarios no unidos, enjuagar las células con tres intercambios de PBS y luego contratinción con el tinte de ADN fluorescente Hoechst 33342 (1 mg / ml) solución durante 10 min en una plataforma oscilante.
- Para la visualización simultánea de ambos antígenos de superficie celular y antígenos intracelulares, las células de sonda primero con anticuerpos primarios a antígenos de la superficie celular seguido por sus anticuerpos secundarios apropiados. A continuación, volver a fijar las células en frío PFA, permeabilizar, bloqueo y se incuba con anticuerpos primarios contra antígenos citoplasmáticos o nucleares seguidos por sus anticuerpos secundarios apropiados.
- Después de la tinción, retire cubreobjetos de sus pozos utilizando pinzas curvas y enjuagar la parte posterior del cubreobjetos usando agua destilada. Coloque la celda cubreobjetos deslice hacia abajo sobre una gota de medio de montaje 22 set en un portaobjetos de vidrio anti-fade.
7. Oil Red O tinción en combinación con inmunofluorescencia tinción de las células (2 horas)
- Revelarel contenido de lípidos de las células plateado en placas de 24 pocillos por tinción con Oil Red O (1 - ([4- (Xylylazo) xililo] azo) -2-naftol) 5,23. En primer lugar preparar una solución madre de 0,5% (w / v) Oil Red O disolviendo 500 mg de Oil Red O en 60 ml de 99% de trietilo-fosfato y 40 ml de agua destilada. Mantener esta solución a temperatura ambiente en la oscuridad hasta su uso.
- En el día de uso, hacer un 36% (w / v) de solución de trietilo-fosfato de trabajo, que contiene 12 ml de solución madre de Oil Red O y 8 ml de agua destilada. Filtrar esta solución a través de papel de filtro número 42 para eliminar todo cristalizado Oil Red O (que perjudica la calidad de la imagen).
- Calentar suavemente esta solución de trabajo en un baño de agua durante 1 hr después de lo cual la solución se centrifugó a 1.200 xg durante 6 min. Eliminar el sobrenadante y filtrar de nuevo a través de papel de filtro (número 42) y transferir a un tubo de 20 ml fresco.
- Después las células se han fijado, permeabilised y inmunoteñidas, retire el PBS y añadir 500 l de Oil Red O / Trietilo-phossolución de fosfato en los pocillos durante 60 minutos. Triton-X a la concentración utilizada aquí para la permeabilización de la membrana celular no afecta el contenido de lípidos celulares 23.
NOTA: Oil Red O se excita por longitudes de onda entre 540 y 580 nm y por lo tanto el filtro de Texas-Red se puede utilizar para detectar Oil Red O emisión en microscopía de fluorescencia 23. Tenga en cuenta que la emisión de fluorescencia de Oil Red O puede ocasionalmente fugas en el canal rojo lejano si las células están muy fuertemente teñidas (es decir, muy alto contenido de grasa). - Después de la incubación, retirar el exceso de aceite rojo O y aclarar las células cinco veces con 500 l de PBS. Montar los cubreobjetos como para inmunotinción como se describe en la sección 6. Detectar Oil Red O tinte por tanto campo claro / fase microscopía de contraste o por microscopía de epifluorescencia utilizando el filtro rojo de Texas (desplazamiento libre, EX BP 560/40, BS FT 585, EM BP 630 / 75, Carl Zeiss).
8. Obtención de micrografías de microscopía de fluorescencia para la posterior Unálisis
NOTA: Asegúrese de que se desliza de compararse cuantitativamente se tiñen con las mismas soluciones, fotografiado en idénticas condiciones (por ejemplo, la exposición, la cámara y los ajustes de adquisición, etc.) y capturado en la misma sesión de la microscopía. Todo el formato post-adquisición también debe ser idénticas y estar en estricta conformidad con las directrices sugeridas para las imágenes digitales 24.
- Para la adquisición de imágenes (microscopía widefield), encienda la fuente de luz del microscopio y la fluorescencia y dejar para la cantidad recomendada de tiempo para permitir que la fuente de luz de fluorescencia se caliente y se estabilice.
- Ajuste la corriente oscura de la cámara mediante el bloqueo de la trayectoria de la luz a la cámara; adquirir una imagen a máxima resolución y usar esto para corregir las imágenes adquiridas posteriormente.
- Ilumine sondas de inmunofluorescencia por epifluorescencia entregado por las guías de luz líquidos (tubo flexible de fluoroplástico lleno de aceite de silicona fenilmetil) unnd señales visualizadas a través roja (filtro ajustado 45 HQ Tejas turno libre de rojo, verde (filtro ajustado 44 FITC turno especial libre) y azul (filtro configurado filtros de paso de banda libre) 49 turnos DAPI en un microscopio invertido epi-fluorescencia (10X, 20X, 40X, planificar objetivos apocromáticos con 0.25, 0.75, 0.95 aperturas numéricas, respectivamente).
- Para evitar la saturación de píxeles encontrar la exposición óptima dentro del rango lineal del detector para cada marcador fluorescente usando la función de 'sobreexposición' de software de adquisición de imagen. Tome nota de la exposición estandarizado para cada marcador fluorescente.
- Captura de canales individuales y ahorrar en escala de grises o tiff pseudocoloreada (etiquetado formato de archivo de imagen) archivos de imágenes en la profundidad de bit más alto (preferiblemente de 16 bits - 65.536 valores de gris) proporcionada por el dispositivo de grabación (por ejemplo, enfriado CCD (dispositivo de carga acoplada) montado en el microscopio) . Ajuste la resolución de la imagen de 1388 x 1040 o superior. Asegúrese de incluir una barra de escala o un objeto de conocida dimensiones en la imagen.
- Siempre que sea posible guardar archivos en formato de 16 bits archivo de imagen etiquetado (.tiff) y no en formato .jpeg para evitar la pérdida de información 25.
- Si hay alguna preocupación por la uniformidad de la iluminación (software incluido con el microscopio puede tener la corrección automática para esto) tomar una imagen de 'flat-field' de cubreobjetos sin células, pero manchado y montado de la misma manera diapositivas como experimentales; esto puede ser usado para corregir defectos de iluminación posterior a la adquisición en el software de análisis de imagen.
- Para la adquisición de imágenes (microscopía confocal), optimizar la ganancia del detector y la potencia del láser para cada experimento de imágenes (evitar la saturación). En general, la fluorescencia medida es proporcional al nivel de potencia láser. Definición del tamaño del agujero de alfiler a '1 aireado' para lograr la mejor relación señal-ruido (resolución mejorada puede lograrse a 0,5 aireado para señales especialmente fuertes). Tome secciones ópticas a diferentes niveles a lo largo del eje z a través de la hormigacélulas ibody marcado y guardar una proyección máxima de 16 bits para cada canal para el análisis de imágenes.
9. Medidas Escénicas de la etiqueta fluorescente factores de transcripción nuclear utilizando el procesamiento y análisis de imágenes de software (5 min por campo de visión).
- Acceso a archivos de imagen TIFF individuo y de superposición correspondiente canales haciendo clic y arrastrando una imagen en otra. Cada canal aparecerá entonces como una capa separada en el panel de capas.
- Seleccione aligerar el menú de filtros para permitir capas por debajo, para ser visualizados simultáneamente. Alternativamente, ajustar la opacidad de las capas superiores al 50%.
NOTA: Las imágenes TIFF se pueden guardar con el Lempel-Ziv-Welch (LZW) compresión de datos "sin pérdida" para reducir los tamaños de archivo sin pérdida de información. - En la ventana de análisis (Análisis> Seleccionar puntos de datos> Personalizar), seleccione Análisis y elegir las mediciones requeridas (por ejemplo, la densidad integrada, Densit significary, la circularidad, histograma, etc.). Deseche cualquier mediciones innecesarias desmarcando la casilla junto a ellos. Si se requieren mediciones de área en micras, haga clic en Análisis> Configurar escala de medida. La herramienta gobernante aparecerá automáticamente - rastrear la longitud de la barra de escala y escriba su longitud conocida en micrómetros. El software entonces convertir las mediciones de área en micras cuadradas.
NOTA: Si se selecciona el análisis de histogramas, cuando se registran las mediciones aparecerá una carpeta adicional (la localización de los cuales puede ser elegido) con 8 bits histogramas para cada área de selección individual en la micrografía, así como la suma de todas las selecciones individuales (esto siempre aparece como histograma en 1 si se realizan varias selecciones). Este análisis no puede realizarse por el software en formato de 16 bits, pero es muy útil para examinar la distribución de las intensidades de los píxeles a lo largo de un objeto de interés. - Para el análisis de la intensidad de fluorescencia nuclear primero construir un representante 'Color Range Selección Mask' (CRSM) por Hoechst o ADN manchado DAPI para definir el área nuclear. Una vez que las imágenes del canal deseado se superponen, sólo la capa de canal Hoechst se debe dejar a la vista, garantizando el "icono del ojo 'junto a ella en la pestaña capas se selecciona y luego se pone de relieve capa (se vuelve azul), mientras que todas las demás capas deben ser sin seleccionar. Asegúrese de que el menú desplegable de la mezcla es un retroceso en "Normal" en la pestaña de capas.
- Abra el cuadro de diálogo Rango de color (Selección> Gama de colores) y establezca la opción desplegable de selección para "colores muestreados. Con la vista previa de selección establecido en 'máscara rápida' (fondo rojo) seleccionar todos los tonos de color azul dentro de los núcleos manteniendo pulsada la tecla shift (aparece signo '+') y haciendo clic dentro de los núcleos utilizando la herramienta cuentagotas que aparece.
- Si se seleccionan los tonos no deseados, eliminarlos pulsando la tecla Alt ('aparece ─'sign) y haciendo clicen ellos. Mantener la escala borrosidad en cero para que los tonos de color seleccionadas manualmente se incluyen en la medición y clusters de color localizados 'deben dejarse sin marcar.
- Guardar este CRSM a disco duro del ordenador como un programa específico de archivo de extracción (.axt). Con otro campo aleatorio de núcleos, carga, actualizar y guardar el CRSM (Select, gama de colores, de carga). Haga esto por lo menos cinco campos aleatorios para asegurar que las selecciones nucleares son representativos.
- Utilice una versión en color de una imagen en escala de grises para la creación de una máscara para aislar características porque el ojo humano es más capaz de discriminar entre diferentes tonos de color que entre varios tonos de gris 26.
- Utilice la CRSM nuclear a las regiones nucleares del segmento para la tinción. Una vez que los núcleos se han seleccionado, haga clic en Imagen> Ajuste> Umbral y mueva el control deslizante hacia la derecha, de modo que los núcleos se vuelven negro. Alternativamente,haga clic derecho y seleccione "llenar" a continuación, elija 'Llena de: negro'. Luego haga clic en Selección> Invertir y ahora presione Eliminar para eliminar todos los antecedentes (si la opción aparece elija 'llenar a: Blanca'). Este binarizes esencialmente la imagen en función de su selección. A continuación, cargue el plugin de cuencas en la ficha filtros para separar los núcleos superpuestos (Filtro> imagen binaria> separación característica de cuencas).
- Si muchos núcleos están fuertemente solapada, retire los núcleos de análisis anulando su selección (Mantenga pulsada la tecla Alt y sin apretar dibujar alrededor de ellos con la herramienta Lazo).
- En la capa nuclear ahora binario, ir a Selección> Gama de colores y> Sombras, para seleccionar los distintos núcleos. Turno de espera Alternativa y clic dentro de cualquier núcleo negro. Serán inmediatamente seleccionaron todos los núcleos. A continuación, traslado de esta selección a la capa que contiene la tinción de factor de transcripción nuclear (por ejemplo miogenina) seleccionando esa capa y anulando la selección de todosotras capas. Líneas que marchan ahora mostrarán la posición de los núcleos en el canal miogenina.
- Si se trabaja con imágenes pseudocoloreada sólo haga clic en la paleta Canales (a la derecha de la pestaña de capas) y seleccione sólo el canal verde (la imagen aparecerá ahora gris). Luego haga clic en Imagen> Modo> Escala de grises. Una advertencia aparecerá "Acoplar capas visibles y deseche las capas ocultas 'haga clic en Aceptar, a continuación, otra advertencia dirá' descartar otros canales 'haga clic en Aceptar de nuevo. Sólo una capa única de escala de grises seleccionado núcleos ahora estará presente en la paleta de capas.
- Haga clic en Grabar medidas en el registro de medidas para obtener datos de los núcleos seleccionados. Si la capa a analizar (por ejemplo miogenina tinción) ya es una imagen en escala de grises de 16 bits en bruto y luego simplemente presione Grabar medidas.
- Exportación medidas seleccionadas como TXT archivo a la ubicación de su elección. Estos pueden ser procesados y analizados en otro software de manejo de datos p másackages
NOTA: El comando Edición> Paso atrás (pulse todos Alt, Ctrl y las teclas Z simultáneamente) restaura todas las capas anteriores si es necesario. - Correcta para no específica fluorescencia de fondo 27 que los resultados sean cuantitativa y comparable como mediciones de la intensidad de fluorescencia son siempre una mezcla de señal y el fondo.
- Seleccione la herramienta de selección de plaza y comprobar 'Tamaño fijo' elegir 20 por 20 píxeles (o mayor si se desea y en función de la confluencia de las células en la imagen). Mientras mantiene turno seleccionar diez o más zonas de fondo extendido por todo el campo de visión. Pulse 'Mediciones de registro' en el registro de medidas.
- Calcular la densidad media integrado (suma de todos los valores de gris píxeles) por píxel de las 10 regiones de fondo seleccionadas (dado que el 'valor medio gris "en el registro de medición). Multiplicar el promedio de densidad de fondo por píxel por el número de píxeles en el objeto de destino (
- Reste fondo de fluorescencia de los objetos de densidad integrada originales para dar el fondo último valor corregido. Este enfoque representa el potencial del campo de variación del campo en no específica fluorescencia de fondo.
NOTA: Es de suma importancia para seleccionar sólo las regiones de fondo de buena fe como esta corrección tiene un impacto considerable en los valores finales. Zoom en el uso de la lupa se recomienda al hacer selecciones.- También puede ser útil dividir el fondo general de valor corregido por el área del núcleo en píxeles (mismo que tomar el nivel medio del gris / intensidad por núcleo) para minimizar cualquier posible influencia de la señal de fondo nuclear localizada que contribuir más a la densidad integrada valor con el aumento del tamaño nuclear (Figura 3C).
- Reste fondo de fluorescencia de los objetos de densidad integrada originales para dar el fondo último valor corregido. Este enfoque representa el potencial del campo de variación del campo en no específica fluorescencia de fondo.
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Representative Results
Células miogénicas y fibroblastos purificadas pueden ser cultivadas en un medio de diferenciación adipogénica durante tres días seguidos por medio de la nutrición adipogenic desde cualquier lugar entre 7-30 días para evaluar su potencial para la adipogénesis. Uso de las poblaciones de células purificadas, la tinción con Oil Red O en combinación con inmunotinción para marcadores de linaje adipogénicos y miogénicas mostró que sólo la fracción de fibroblastos era capaz de diferenciación adipogénica (Figura 2). La acumulación masiva de grasa por los fibroblastos es visible para el ojo desnudo (panel A), y su transdiferenciación completo se muestra por la muy fuerte expresión de PPAR γ nuclear (Figura 2 paneles B y C y la Figura 3). Por 15 días de tratamiento, estas células han lanzado ningún restante TE-7 (un antígeno de tejido conectivo) en su sustrato (panel D). Por el contrario, las células miogénicas mantienen su fenotipo normal incluyendo la expresión de desmina y miosina pesadacadena (Figura 2 paneles E y F) y no upregulate PPAR nucleares (Figura 3C).
Un ejemplo de análisis cuantitativo de un campo de células miogénicas (desmina +) se muestra en la Figura 3. El panel B muestra el campo analizado, y el panel A muestra la intensidad de la fluorescencia cuantificada (después de la corrección de fondo). Este método muestra claramente la variación de la expresión de miogenina en los núcleos individuales en este punto la densidad y el tiempo de la siembra específica. Figura 3C demuestra la utilidad del método para comparar directamente los niveles de factor de transcripción en diferentes tipos de células en un nivel de celda por celda. Aquí nos muestran que CD56 - fibroblastos musculares expresan un alto nivel de los factores de transcripción PPAR adipogénicos mientras que CD56 + células ordenados miogénicos mantienen sólo niveles muy bajos después de la exposición al adipocito medio inductor.
Figura 1:. Poblaciones purificadas de células miogénicas y fibroblastos obtenidos por selección de perlas inmunomagnéticas (AB) Después de una semana en cultivo de células miogénicas ordenadas expresan la superficie de la célula molécula de adhesión celular CD56 (N-CAM) y el intermedio desmina filamento músculo específico. Nuclear Ki-67 expresión proporciona evidencia de que estas células están proliferando. La tinción de la membrana, citoplasma y componentes nucleares se describe en el paso de protocolo 6.5. (CD) células miogénicas no expresan el marcador de fibroblastos TE-7. (E) fibroblastos derivados de músculo humano expresan TE-7 y (F) la plaqueta transmembrana α -derivado receptor del factor de crecimiento (PDGFR). Las barras de escala son: (A) = 20 m; (B, C y E) = 200 micras; (D & F) 50 y# 181;. M Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: CD56 derivada de músculo humano - / TE-7 + fibroblastos y CD56 + / desmina + células miogénicas cultivadas en Adipocito medio inductor (AIM). Los fibroblastos (A) aisladas por MACS se diferencian en adipocitos cuando se cultivan en Adipocito medio inductor (AIM) y esto se puede ver fácilmente a simple vista después de la tinción con Oil Red O. Células Myogenic no muestran evidencia de diferenciación adipogénica después el mismo período de tiempo en el AIM y muestran Oil Red O tinción muy limitada. (B & C) Hfibroblastos derivadas de músculo Uman altamente expresa PPAR y CEBPα (no se muestra) después del cultivo en AIM. (C) A medida que los fibroblastos se diferencian en adipocitos liberan restantes proteínas ECM intracelular que forma una red densa alrededor de ellos. (E) de células Miogénica mantener su miogénico la morfología y la expresión de marcadores de linaje, como desmina y (F) de la cadena pesada de miosina (MHC), un marcador de la diferenciación miogénica terminal, y no para acumular lípidos. Las barras de escala son: (B, D) = 200 m (E, F) = 100 m; (C) = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Datos de la muestra obtuvieron fr om immunolabelled culturas utilizando el método de análisis de imágenes se describe (enfoque Extended Adobe Photoshop). (A) Una parcela celda por celda de intensidad de fluorescencia para el factor de transcripción nuclear myogenin específica muscular después de 24 h en medio de diferenciación exento de suero. (B) micrografías representativas de desmina + / + myogenin precursores miogénicas humanos. Las barras de escala son: (B) = 50 micras (C) la intensidad de fluorescencia PPAR en los núcleos individuales de ordenados CD56 + / desmina + poblaciones miogénicas (CD56 +) y CD56 - / TE-7 + / PDGFRa + / colágeno VI + células (CD56. -) después del cultivo en Adipocito medio inductor durante 15 días. Los valores de fluorescencia se normalizaron a la zona nuclear para tener en cuenta variaciones en el tamaño nuclear entre los dos tipos de células. Barras negras horizontales en (A) y (B) muestran la media.52049 / 52049fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Los componentes del medio | Concentración | Catálogo n. | Fuente comercial |
| Medio de crecimiento esquelético muscular humana: | C-23060 (Comes 'listo para usar' que contiene todos los factores enumerados) | ||
| Medio basal del músculo esquelético | - | PromoCell | |
| Suero de ternero fetal | 15% | PromoCell (5%) y FCS Oro, PAA Laboratories (10%) - Cat no. A15-151 | |
| Fetuina (bovina) | 50 mg / ml | PromoCell | |
| Factor de crecimiento epidérmico | 10 ng / ml | PromoCell | |
| Factor de crecimiento de fibroblastos básico (humana recombinante) | 1 ng / ml | PromoCell | |
| Dexametasona | 0,4 g / ml | PromoCell | |
| La insulina (recombinante humana) | 10 mg / ml | PromoCell | |
| Penicilina | 100 U / ml | Sigma | |
| Estreptomicina | 100 mg / ml | Sigma | |
| L-Glutamina | 292 mg / ml | Sigma | |
| Medio de diferenciación miogénica | C-23 260 | ||
| Medio basal del músculo esquelético | - | PromoCell | |
| Penicilina | 100 U / ml | Sigma | |
| Estreptomicina | 100 mg / ml </ Td> | Sigma | |
| Nota: PromoCell, Heidelberg, Alemania; Sigma-Aldrich Company Ltd, Dorset, Reino Unido | |||
Tabla 1: componentes y las concentraciones de medios de cultivo celular.
| Composición del medio | Concentración | Catálogo n. | Empresa |
| El medio de crecimiento de preadipocitos | C-27410 (listo para usar) | ||
| Suero de ternero fetal | 0,05 ml / ml | PromoCell | |
| Suplemento de crecimiento de células endoteliales | 0,004 ml / ml | PromoCell | |
| Factor de crecimiento epidérmico (recombinante humana) | 10 ng / ml | PromoCell | |
| Penicilina | 100 U / ml | Sigma | |
| Estreptomicina | 100 mg / ml | Sigma | |
| Glutamina | 292 mg / ml | Sigma | |
| D-Biotina | 8,0 g / ml | PromoCell | |
| La insulina (recombinante humana) | 0,5 g / ml | PromoCell | |
| Dexametasona | 400 ng / ml | PromoCell | |
| IBMX | 44 mg / ml | PromoCell | |
| L-tiroxina | 9 ng / ml | PromoCell | |
| Ciglitazona | 3 mg / ml | PromoCell | |
| Penicilina | 100 U / ml | Sigma | |
| Streptomicina | 100 mg / ml | Sigma | |
| Glutamina | 292 mg / ml | Sigma | |
| Medio de diferenciación de preadipocitos | C-27436 (listo para usar) | ||
| D-Biotina | 8,0 g / ml | PromoCell | |
| La insulina (recombinante humana) | 0,5 g / ml | PromoCell | |
| Dexametasona | 400 ng / ml | PromoCell | |
| IBMX | 44 mg / ml | PromoCell | |
| L-tiroxina | 9 ng / ml | PromoCell | |
| Ciglitazona | 3 mg / ml | PromoCell | |
| Penicilina | 100 U / ml | Sigma | |
| Streptomycin | 100 mg / ml | Sigma | |
| Glutamina | 292 mg / ml | Sigma | |
| Medio nutrición Adipocito | C-27438 (listo para usar) | ||
| D-Biotina | 8,0 g / ml | PromoCell | |
| La insulina (recombinante humana) | 0,5 g / ml | PromoCell | |
| Dexametasona | 400 ng / ml | PromoCell | |
| Penicilina | 100 U / ml | Sigma | |
| Estreptomicina | 100 mg / ml | Sigma | |
| Glutamina | 292 mg / ml | Sigma | |
| Nota: PromoCell, Heidelberg, Alemania; Sigma-Aldrich Company Ltd, Dorset, Reino Unido | |||
Tabla 2: Composición de los medios de cultivo celular adipogénica.
| Nombre de equipo / reactivo | Empresa | Catálogo n. | Comentarios / Descripción |
| Cultivo celular | La colagenasa D | Roche | 11088866001 |
| Dispasa II | Sigma | D4693-1G | Debe ser esterilizado por filtración antes de su uso |
| La tripsina / EDTA | (Gibco) Invitrogen | 15400-054 | |
| Filtro de células de 100 micras | BD Biosciences | 352360 | |
| Solución de colágeno (3 mg / ml en ácido acético 0,1%) | Sigma, Dorset, Reino Unido | C8919 | |
| Filtro de jeringa de Minisart SRP15 (0,2 micras) | Sartorio | 17573ACK | Politetrafluoroetileno (PTFE) de membrana |
| CD56 Microbeads humanos | Miltenyi Biotech | 130-050-401 | Magnético-separación de células activadas (MACS) Esté al tanto de la vida útil limitada de microperlas |
| Microbeads fibroblastos anti-, humano | Miltenyi Biotech | 130-050-601 | |
| 40 micras filtros pre-separación | Miltenyi Biotech | 130-041-407 | |
| Grandes Collumns celulares | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | Estas columnas tienen una resistencia de flujo. El uso de la resistencia de flujo no es necesario para obtener las purezas miogénicas altos descritos aquí. |
| LS columnas | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MiniMacs Seperator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | Este separador se ajusta a la columna de células grandes, pero no la columna de la LS. |
| MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| BSA | Sigma | Debe ser esterilizado por filtración antes de su uso | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | Tinción de Lípidos |
| Fosfato de trietilo | Sigma | 538728 | |
| Papel Whatman | Sigma | Z241121-1PAK | No. 42, sin cenizas. Para preparar el filtro plegado del papel de filtro circular para hacer un semicírculo, luego doble la semi-círculo por la mitad otra vez para formar una forma de cono. Coloque el cono en un embudo para el filtrado. |
| Montaje | |||
| Prolongar Oro Antifade Reactivo | Molecular Probes, Invitrogen | P36930 | Esto se puede comprar con o sin DAPI y no apaga la fluorescencia inicial. |
| AxioVision | Carl Zeiss | Contacto Zeiss | Software de adquisición de imagen |
| Adobe Photoshop CS5 Extended | Adobe (adquirido de Pugh Informática) | ADPH16982 * | Image software de análisis |
Tabla 3: Equipos y reactivos.
| Nombre / antígeno | Especie de anticuerpo y de isotipo | Nombre Clone | La dilución de uso | Catálogo n. | |
| Marcadores Myogenic: | |||||
| CD56 (N-CAM) | IgG de ratón mc 1 | MI-31 | (1: 100) | 347740 | BD |
| Desmina | Rabbit IgG mc 1 | D93F5 (XP) | (1: 250) | 5332S | NEB |
| Miogenina | IgG de ratón mc 1 | F5D | (01:50) | F5D | DSHB |
| La miosina de cadena pesada | Ratón mc IgG2b, cadena ligera kappa | MF20 | (1: 200) | MF20 | DSHB |
| Fibroblastos / conectivo | |||||
| timarcadores DICIÓN: | |||||
| Fibroblastos humanos Anti- | IgG de ratón mc 1 | TE-7 | (1: 100) | CBL271 | Millipore |
| PDGFRa | Conejo mc IgG | D13C6 | (1: 500) | 5241 | NEB |
| Marcadores de proliferación: | |||||
| Ki67 | Conejo mc IgG | SP6 | (1: 200) | MP-325-CRM1 | Maryland |
| Adipogénico | |||||
| factores de transcripción: | |||||
| PPAR? | IgG de ratón mc 1 | E8 | (1:20) | Sc-7273 | Santa Cruz de Biotecnología |
| Clave: mc: monoclonal,pc: policlonal, DSHB: Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma, Iowa EE.UU.; | |||||
| NEB: New England Biolabs, Reino Unido; MD: A. Menarini Diagnostics, Reino Unido; BD: BD Bioscience, Reino Unido. | |||||
Tabla 4: Anticuerpos primarios.
| Antígeno | Especie de anticuerpo y de isotipo | Dilución | Catálogo n. | Empresa |
| Alexafluor488 | De cabra anti-ratón IgG (H + L) | 1: 1000 | A-11001 | MP |
| Alexafluor 594 | De cabra anti-ratón IgG (H + L) | 1: 1000 | A-11005 | MP |
| Alexafluor 594 | De cabra anti-conejo IgG (H + L) | 1: 1000 | A-11012 | MP | </ Tr>
| Clave: H + L = cadenas pesadas y ligeras; MP: Molecular Probes, Invitrogen Life Technologies, Paisley Reino Unido | ||||
Tabla 5: Los anticuerpos secundarios.
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Discussion
Hemos descrito un procedimiento de clasificación immunomagentic para el enriquecimiento selectivo de precursores derivadas de músculo humanos a partir de pequeñas muestras de material de biopsia muscular. Esta técnica ha sido muy valiosa en nuestro laboratorio para superar la pérdida de cultivos de músculo humanos derivados de los fibroblastos, sino también para la comprensión del comportamiento único de poblaciones distintas de células progenitoras derivadas de músculo. Células miogénicas Una vez purificados pueden ser investigados por los cambios en la proteína y / o la expresión de genes, o utilizados para experimentos posteriores.
Además de la purificación de células también detalle un método rápido y simple de análisis de regiones específicas de interés en micrografías de microscopía de fluorescencia. Las imágenes digitales de microscopía de fluorescencia contienen una gran cantidad de información para los biólogos celulares para extraer; de hecho píxeles contienen datos que no está necesariamente discernibles para el ojo humano. Con esta técnica los datos cuantitativos se pueden obtener sobre un gran número de las células individuales en una población. Una característica única de análisis de imagen en comparación con la citometría de flujo es la capacidad para correlacionar los cambios en la expresión de proteínas con los cambios en la forma celular interacciones célula-Orcell. Además, la capacidad de crear y guardar las máscaras de selección optimizados y representativas permite mediciones rápidas, precisas y reproducibles que hacerse a través de muchos campos de visión, reduciendo así la posibilidad de sesgo de usuario.
Purificación basado en células-MACS
Una ventaja de este método es que las células pueden purificarse con éxito ya sea inmediatamente después del aislamiento o después de unos pocos días en cultivo (cuando el rendimiento será más alto).
Fundamentalmente, las células miogénicas no se debe permitir a confluir antes de la clasificación, porque esto impide su paso a través de la columna, y se reducirá la proporción de células proliferativas obtenidos para una mayor expansión y experimentación.
t "> Dependiendo de la muestra de tejido inicial obtenida, puede haber un gran número de eritrocitos no adherentes de la cultura en esta etapa. Los métodos existen para selectivamente eritrocitos lisan, sin embargo para evitar cualquier tensión innecesaria de químicos a las células de este derivadas de músculo paso es evitado. Hemos no observado ningún efecto negativo notable de eritrocitos en la cultura temprana de las células derivadas de músculo humanos, y estos eritrocitos son eliminados por los cambios de medios una vez que las células miogénicas atribuyen.Otros métodos de desprendimiento de las células justo antes de la clasificación (por ejemplo, otras proteasas suaves o métodos basados en EDTA) pueden ser utilizados para células en las que la expresión del antígeno de superficie celular es baja o particularmente sensibles a la digestión con tripsina. La expresión de CD56 en las células miogénicas humanos es fuerte y resistente a un corto trypsinsation (cuando se ensaya con los anticuerpos descritos aquí).
Es importante que el tampón de clasificación contiene EDTA para inhibir calcIUM dependiente de adhesión célula-célula; esto es crucial para obtener (y mantener) una suspensión de una sola célula para la clasificación. Dependiendo del número de células, forma y tamaños para ser ordenados, hay una opción que se hará con respecto a la columna de separación (véase el cuadro 3).
Extracción de la columna del campo magnético para liberar células retenidas puede ser complicado por lo que asegurarse de que el tubo de recogida (incluso si faldón) se coloca en un soporte situado muy cerca de la columna para evitar la pérdida de las células en tránsito.
Aunque hemos descrito esta técnica para su uso con células primarias humanas de músculo esquelético, este protocolo se puede adaptar fácilmente para otros tipos de células que dan fama a un marcador de superficie celular específica / única. Otras ventajas incluyen el hecho de que todo el procedimiento puede llevarse a cabo en el entorno de trabajo estéril de una cabina de flujo laminar. Además, el procedimiento MACS es más suave en las células en comparación con FACS de clasificación debido a la bajafuerzas de cizallamiento y puede ser una ventaja particular para las células más grandes. Las perlas magnéticas utilizadas son pequeñas, no tóxico y biodegradable en cultivo. De hecho, MACS se ha aplicado con éxito para la purificación y estudio de un número de otros tipos de células.
Una limitación de esta técnica es que MACS no puede fácilmente ser realizado para múltiples marcadores simultáneamente. Además, la cantidad de marcador y tamaño de las células no se puede determinar durante el proceso de clasificación, sólo después.
Consideraciones para la optimización de adquisición y análisis de imágenes
El método de análisis de imagen demostrado aquí ofrece una herramienta poderosa para dilucidar los cambios en el nivel de expresión de proteínas en una base de celda por celda en grandes poblaciones de células. Mediante la explotación de las máscaras de capas de las instalaciones y de selección en un paquete de software ampliamente disponible, el experimentador puede seleccionar objetivamente diferentes señales fluorescentes a través de múltiples imágenes, para permitirla cuantificación de las características individuales, y cualquier número de componentes dentro de ellos. Hemos utilizado con éxito este método para cuantificar y comparar directamente el rango de factor de transcripción expresión en diferentes poblaciones de células expuestas a un desafío adipogénica.
Cada canal de fluorescencia (que representa un marcador específico) se puede mantener separado de los otros y encendido o apagado según se requiera, que es útil para los experimentos immunolabelling multi-color.
Un número de factores que deben tenerse en consideración al intentar extraer datos cuantitativos y semicuantitativos de microscopía de fluorescencia 28. La atención a estos permita mediciones básicas semi-cuantitativo que se hizo. A menudo los investigadores desean utilizar un número de fluorocromos para etiquetar diferentes proteínas de interés; de primordial importancia es la capacidad de ser capaz de distinguir entre espectros de emisión individual. En la mayoría de los casos, esto se logra mediante excitat selectivaion de un solo fluorocromo a la vez. Sin embargo, si los espectros de emisión y / o de excitación se superponen significativamente o no están adecuadamente filtraron a sangrar a través o diafonía pueden comprometer la exactitud de los datos de las imágenes obtenidas. Sangrar a través es el paso de la emisión de fluorescencia en un canal de detección apropiado y es causada por una superposición de espectros de emisión 29,30.
Algunos puntos a tener en cuenta son: la elección de fluorocromos que tienen excitación bien separadas y los espectros de emisión, con longitudes de onda de excitación muy selectivos (como se logra mediante láseres en microscopía confocal), asegurando que los conjuntos de filtros de emisión son lo suficientemente estrictas para excluir a las longitudes de onda no deseadas, y la realización de imágenes multicolor en el más largo (es decir, el "más roja ') de longitud de onda pico de emisión de tinte primero en explicar el hecho de que los espectros de absorción son generalmente sesgada hacia longitudes de onda más cortas (azul claro), mientras que los espectros de emisión están sesgadas hacia wavel yaengths (luz roja). Los espectros de las etiquetas fluorescentes están disponibles en 'fluorescencia Spectraviewer' proporcionado por Invitrogen.
El uso de objetivos de alta calidad es crucial para imágenes destinadas a análisis. Una alta apertura numérica (> 1,3) es el mejor y aumentos debe adaptarse a la cámara en la microscopía de campo amplio. En tanto widefield y microscopía confocal, la NA es crítico, ya que z resolución mejora como una función de la apertura numérica cuadrado 29. Siempre que sea posible hacer uso de lentes de planta apocromática que se corrigen para ambas aberraciones esféricas y cromáticas 29. El uso de guías de luz líquidos es muy recomendable, ya que reducen iluminación desigual por revolver la iluminación de la fuente para reducir la coherencia espacial y temporal con anterioridad a su entrada en el microscopio objetivo 29.
Es importante para evitar la saturación de imágenes, como píxeles saturados no pueden ser cuantificación correctamenteed debido a la saturación de información en el más intenso nivel de gris valores 26.
Varios 'plugins' pueden estar disponibles para permitir procedimientos Campo plano a cabo con relativa facilidad; por ejemplo, el Dr. John C. Russ ha hecho que muchos de estos disponibles en línea gratis (http://www.drjohnruss.com/download.html). El uso de este plugin la relación del brillo de cada pixel en la micrografía experimental a la correspondiente en la imagen de referencia se calcula y se sustituye al original. Los resultados se escalan para llenar el intervalo de brillo de la imagen. Alternativamente, la calculadora imagen de ImageJ es otro medio de corrección de iluminación desigual.
Para algunos análisis de imágenes, la microscopía confocal puede ser el método de elección, ya que evita la fluorescencia fuera de foco de alcanzar el detector 29. Sin embargo, este enfoque puede tener sustancialmente más larga que la microscopía de fluorescencia widefield, limitando la entumecidaer de campos de vista individuales que se pueden obtener en una sola sesión.
Recientemente otros métodos se han reportado para el enriquecimiento de células miogénicas de tejido muscular humano. Bareja 31 utiliza una combinación de agotamiento MACS (para: CD11b, CD31, CD34 y CD45) seguido por FACS para la selección positiva de células miogénicas CXCR4 + / CD56 +. Sin embargo, aunque este procedimiento fue capaz de generar una población miogénico altamente enriquecido, es considerablemente más largo que el método detallado aquí, contiene muchos pasos más consecutivos y los resultados en un menor rendimiento de células miogénicas purificados más bajos por gramo de tejido.
En otro estudio reciente, Castiglioni 32 células aisladas de las fibras musculares asociadas de músculo fetal humano mediante FACS utilizando múltiples marcadores y mostraron que CD34 - + células / CD56 + / Pax7 (células satélite arquetípicas) pueden exhibir osteogénico así como potenti linaje miogénicootros, pero en general de acuerdo con nuestro trabajo no muestran potencial adipogénico. Estos autores también mostraron que CD34 + / - PAX7 células fueron no miogénico, pero eran capaces de diferenciación adipogénica y osteogénica. El enriquecimiento de la expresión de CD90 (un marcador de fibroblastos musculares 33) en el CD34 + fracción no myogenic sugiere que una gran proporción de estas células puede tener fibroblastos estado, que han demostrado ser la fuente principal de adipocitos en el músculo esquelético humano adulto culturas (referencia 5 y Figura 2). Ya sea fibroblastos derivadas de músculo también tienen osteogénicas potencial de diferenciación de nuevas investigaciones.
A diferencia del método de Castiglioni 32, nuestro método requiere solamente un anticuerpo (en oposición a 7) para obtener de forma reproducible altos rendimientos de cultivos de células myogenic puras y se puede realizar rápidamente dentro de las condiciones asépticas de una campana de flujo laminar. Un methodologica másl diferencia es que estos autores aislaron células directamente de músculo disociada y luego siguieron estos en la cultura, mientras que más a menudo células de cultivo durante 1 semana antes de la clasificación y el cultivo. En nuestras manos este enfoque es mejor tolerado por las células. Es importante destacar que el tiempo total en la cultura es esencialmente equivalente entre los dos enfoques. Además, dado que el músculo esquelético fetal está experimentando hiperplásico y el músculo hipertrófica crecimiento 34 no es sorprendente que el rendimiento de los precursores miogénicos es mayor a partir de tejido muscular fetal cuando se compara con el músculo adulto
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | Must be filter sterilized before use |
| Trypsin/EDTA | (Gibco) Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 μm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Sigma, Dorset, UK | C8919 | |
| Minisart SRP15 syringe filter (0.2 μm) | Sartorius | 17573ACK | Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane |
| CD56 human Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-050-401 | Be aware of the limited shelf life of microbeads |
| Anti- fibroblast Microbeads, human | Miltenyi Biotech | 130-050-601 | |
| 40 μm Pre-separation filters | Miltenyi Biotech | 130-041-407 | |
| Large Cell Collumns | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here. |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MiniMacs Seperator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | This separator fits the large cell column but not the LS column. |
| MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| BSA | Sigma | Must be filter sterilized before use | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Triethyl phosphate | Sigma | 538728 | |
| Whatman Paper | Sigma | Z241121-1PAK | No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Molecular Probes, Invitrogen | P36930 | This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence. |
| AxioVision | Carl Zeiss | Contact Zeiss | |
| Adobe Photoshop CS5 Extended | Adobe (purchased from Pugh Computers) | ADPH16982* |
References
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