Abstract
Reparationen og regenerering af skeletmuskulatur kræver handling af satellit celler, som er de hjemmehørende muskel stamceller. Disse kan isoleres fra human muskel biopsiprøver under anvendelse af enzymatisk fordøjelse og deres myogene egenskaber undersøgt i kultur. Kvantitativt, de to vigtigste vedhængende celletyper opnået fra enzymatisk fordøjelse er: (i) satellit celler (betegnet myogene celler eller muskel præcursorceller), først identificeret som CD56 + og senere som CD56 + / desmin + celler og (ii) muskel- afledte fibroblaster, identificeret som CD56 - og TE-7 +. Fibroblaster formere meget effektivt i kultur og i blandede cellepopulationer disse celler kan overskridelse myogene celler at dominere kulturen. Isoleringen og oprensning af forskellige celletyper fra human muskel er således et vigtigt metodiske overvejelser, når de forsøger at undersøge medfødte adfærd enten celletype i kultur. Her descr viIBE et system til sortering baseret på den blide enzymatisk fordøjelse af celler under anvendelse af collagenase og dispase efterfulgt af magnetisk cellesortering (MACS), hvilket giver både en høj renhed (> 95% myogene celler) og godt udbytte (~ 2,8 x 10 6 ± 8,87 x 10 5 celler / g væv efter 7 dage in vitro) til forsøg i kultur. Denne tilgang er baseret på inkubering af blandede muskel-afledte cellepopulation med magnetiske mikroperler perler konjugeret til et antistof mod CD56 og derefter passerer celler selvom et magnetfelt. CD56 + celler bundet til mikroperler tilbageholdes af feltet mens CD56 - celler passerer uhindret gennem kolonnen. Cellesuspensioner fra enhver fase af sorteringsprocessen kan udplades og dyrkes. Efter en given indsats, cellemorfologi og ekspression og lokalisering af proteiner, herunder nukleære transkriptionsfaktorer kan kvantificeres ved hjælp af immunfluorescerende mærkning med specifikke antistoffer og et billede processing og analyse pakke.
Introduction
Reparationen og regenerering af skeletmuskulatur kræver handling af satellit celler 1, de myogene stamceller 2,3. In vivo findes disse celler i en reversibelt hvilende tilstand placeret mellem sarcolemma og basal lamina af hver myofibre, men bliver aktiveret til at formere sig, sikring og differentiere som muskelvæv er beskadiget, repareret og regenereret 3. Satellit-celler kan isoleres fra unge og ældre human muskel biopsiprøver under anvendelse af enzymatisk fordøjelse 4 og deres myogene egenskaber kan efterfølgende undersøgt i primær kultur 5. Effektiviteten af denne isolation proces med hensyn til både udbytte og renhed af cellepopulation afhænger af de anvendte metoder og kan variere fra prøve til prøve. De to vigtigste vedhængende celletyper opnået fra enzymatisk nedbrydning er satellit celler (nu betegnet myogene celler eller muskel præcursorceller), først identificeret som CD56 + / desmin celler og muSCLE-afledte fibroblaster, identificeret som CD56 - og TE7 + celler 5. Fibroblaster har en hurtig proliferativ sats og ikke undergår irreversibel vækststandsning og terminal differentiering ved celle-celle-kontakt som myogene celler; således i blandede populationer, kan fibroblaster overskredet myogene celler at dominere kulturen.
Fibroblaster er ofte blevet set som en irritation i muskelvæv biologer, men der er nu en stigende interesse for fibroblaster som celler værd at studere i deres egen ret, især fordi de har vist sig at have en kooperativ rolle med myogene celler under muskel reparation 6 . Isoleringen og oprensning af forskellige celletyper fra human muskel er således et vigtigt metodiske overvejelser, når de forsøger at undersøge medfødte adfærd begge celletyper i kultur. Fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) er en metode, ved hvilken celler kan sorteres til yderligere undersøgelse og / eller tælles oganalyseret. FACS har vist sig at pålideligt berige humane myogene celler, men udbyttet af celler til efterfølgende kultur har hidtil ikke været høj 7. I betragtning af den begrænsede replikationspotentiale af somatiske celler, såsom satellit-celleafledt myogene celler og meget dårlig proliferation og differentiering er forbundet med senescens 4 er mere skånsom metoder påkrævet. Enkelte kulturer muskel fiber tilbyde en anden, mindre aggressive, midler til at opnå murine satellit celler stadig bosat i deres sublaminal niche, og efter deres aktivering i kultur 8,9. Dette er imidlertid ofte ikke muligt fra human muskel biopsi materiale (fordi fibre sjældent kan opnås fra senen til sene) betyder, at denne teknik ikke kan være tilgængelige for mange forskningslaboratorier interesserede i at studere human muskel-afledte celler. Desuden enkelt fiber teknik kun giver meget begrænsede celletal.
Her beskriver vi et system med sortering baseret på gentle enzymatisk fordøjelse af celler under anvendelse af collagenase og dispase efterfulgt af to på hinanden følgende runder af magnetisk cellesortering (MACS), hvilket giver både en høj renhed (> 95% myogene celler) og udbytte (~ 2,8 x 10 6 ± 8,87 x 10 5 celler / g væv) til forsøg i kultur. CD56 betragtes som den gyldne standard overflade markør for identifikation af humane satellit celler in situ 10 og in vitro 11 og giver den ideelle overflade markør kandidat til perle fastgørelse. Ved denne fremgangsmåde CD56 antistoffer konjugeret til jernoxid og polysaccharid indeholdende superparamagnetiske kugler bundet til celler og ledes gennem en høj gradient magnetisk celleseparering kolonne anbringes i et stærkt magnetisk felt 12,13. Separationskolonnerne er fyldt med en matrix af ferromagnetiske ståluld eller jern kugler, der tjener til at fokusere magnetiske feltlinier mod deres overflade genererer stærke magnetiske feltgradienter (~ 4tesla) 14. I disse kolonner endda lidt magnetiske celler er tiltrukket og adsorberet til overfladen 14. Ubundet (CD56 -) celler passerer gennem kolonnen mens CD56 + celler mærket med magnetiske mikroperler bevares indtil fjernelse fra magnetfeltet 12,15.
Cellesuspensioner fra enhver fase af sortering proces kan være belagt på den ønskede densitet for yderligere eksperimenter. Efter en given indsats de cellulære bestanddele kan identificeres ved hjælp af immuncytokemi, afbildes ved hjælp af bredt område eller konfokal fluorescensmikroskopi og analyseret kvantitativt ved hjælp af en billedanalyse, der tillader en hurtig objektiv måling af alle mærkede celler i et givet billede. I vores laboratorium har vi brugt denne dobbelte immunomagnetisk sortering indflyvning efterfulgt af billedanalyse 16 at vise, at CD56 - humane fibroblaster let transdifferentiate til adipocyter, mens myogenic celles af satellit oprindelse er meget modstandsdygtige over for denne adipogeniske konvertering 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: de udførte i vores laboratorium undersøgelser alle fag har skriftligt, informeret samtykke til at deltage, og alle forsøg blev udført med britiske National Health Service etiske komité godkendelse (London Research etiske komité reference: 10 / H0718 / 10) og i overensstemmelse med Human Tissue Act og Helsinki Deklarationen.
1. Indledende forberedelse forud for muskel biopsi (15 min)
- Gør human skeletmuskulatur vækstmedium. Til en gradueret sterilt 50 ml konisk rør tilsættes 2,5 ml tillægget mix, 10 ml føtalt kalveserum, antibiotika (penicillin / streptomycin) og glutamin den korrekte endelige koncentrationer (tabel 1) og derefter fylde røret til 50 ml med skeletmuskulatur basal medium.
- Sæt 15 ml i skeletmuskulatur basalt medium i en steril 20 ml konisk rør og vejes. Når vejede sted dette rør på is. Brug dette til at modtage den menneskelige muskel prøven.
- I en anden 20 ml rør forberede 10 ml af en collagenase D og Dispase II enzymopløsning til en slutkoncentration på 2 mg / ml hver ved at opløse stock alikvoter af disse enzymer i skeletmuskulatur basal medium. Filtersteriliser denne opløsning ved passage gennem et 0,22 um filter. Placer denne sterile enzymblanding i inkubatoren eller vandbad ved 37 ° C i 15 minutter for at varme op.
BEMÆRK: Denne blanding af enzymer er lidt blidere end trypsin og bedre bevarer celle levedygtighed 17. - Afsæt en petriskål og et par sterile skalpeller.
2. muskelbiopsi Procedure (45 min-1 time)
- Forud for at rekruttere deltagere, opnå fuld etisk clearance og proceduremæssige godkendelse (herunder relevante vaccinationer for eksperimentatorer) fra alle relevante organer, udvalg og leverandører af sundhedsydelser (f.eks etiske, institutionelle, statslige etc.).
- Opret et sterilt område den omkring benet (fx med sterile kirurgiske ark) end Rengør grundigt området omkring biopsi site med et antiseptisk antibakterielt middel (chlorhexidin).
- Bedøve den foreslåede biopsi site på frivilliges ben ved lokal injektion af 2% lidocain i det subkutane område ligger over fascia af vastus lateralis musklen.
- Foretag en ~ 5 mm bred snit under anvendelse af en steril kirurgisk kniv gennem huden og fascia og udfører Bergström nålebiopsi procedure 18 med yderligere sugning.
- Brug steril pincet fjerne muskel fra nålen lumen og fordybe i basalt medium på is. Transport vævet til laboratoriet til videre behandling så hurtigt som muligt, selv om der kan opnås levedygtige myogene celler efter perioder 24 timers eller mere.
- Debriefing emnet, rense og forsegle incisionssted med flere sterile klæbende hud-lukkestrimler og aseptisk kjole med en ydre vandtæt overdækning.
3. Isolering Muskel-afledte Precursor CeLLS (1 time 30 min)
- Fjern rør indeholdende musklen prøven og vejes (sørg rør er tørt ved at tørre med væv). Beregn vægten af musklen prøven ved at trække vægten af røret medium og prøven fra røret indeholdende medium alene.
- Swirl opløsningen flere gange for at vaske muskel blodprøve. Lad muskel sediment ved stuetemperatur i 30-60 sek.
- Fjern næsten hele mængden af medium fra røret, først ved hjælp af en elektronisk pipettering støtte eller emhætte men lad ca 2-3 ml i røret.
- Vend røret på en steril petriskål tillader den resterende væske til at bære muskel prøve på skålen; bruge steril skalpel til at udtrække resterende muskler fragments.Rotate skålen at mobilisere den resterende væske og fjern den med en pipette.Remove eventuelle synlige stykker fedt eller bindevæv.
- For biopsier vejer 100-400 mg, tilsættes 3 ml varmenzymopløsning og anvendelse af sterile skalpeller skære musklen prøven i meget små stykker (<1-2 mm 3).
- Ved hjælp af en bred boring 25 ml pipette udarbejde muskel fragmenter og enzymopløsning og overførsel til et sterilt 10 ml konisk rør. Vask petriskål med yderligere 3-5 ml collagenase og dispase enzymopløsning og bruge en mindre 10 ml pipette indsamle eventuelle resterende muskel fragmenter og sted i røret. Den nøjagtige mængde er ikke kritisk.
- Anbring hætteglasset i et 37 ° C inkubator (eller vandbad) i 60 minutter med triturering (10 ml pipette) hver 15 min.
- Efter 1 time ophører enzymatisk dissociation ved tilsætning af et tilsvarende volumen af frisk forvarmet vækstmedium og passere cellesuspensionen gennem en 100 um filter for at fjerne eventuelle store myofibre snavs. Centrifugeres den filtrerede celle opløsning ved 657 xg i 6 min ved stuetemperatur (20-25 C).
- Resuspender cellepelleten i 5-7 ml vækstmedium og pladen i en ubelagt T-25vævskulturkolbe. Overfør denne plade til inkubatoren ved 37 ° C med 5% CO 2 til 7 dage. Skift medium hver 48 timer. På dette stadium myogene celler er meget små og afrundede og vanskelige at skelne fra ikke-myogene celler.
- På det første medium ændring, centrifugeres supernatanten for at pelletere eventuelle ikke-adhærente celler. Re-suspendere disse i frisk medium og re-plade.
- Efter 7 dage i kultur, sikre, at de fleste af de myogene (og fibroblast) celler har vedhæftet men cellerne er endnu ikke nået konfluens. Rense myogene forstadier og udfører MACS ifølge en protokol oprindeligt blev udviklet af i laboratorier Gherardi og Chazaud 19,20 og yderligere ændret af os 5.
4. Immunomagnetisk Bead Sortering af celler baseret på CD56 Expression (1,5 timer)
- Efter 7 dages Skyl cellemonolaget (som typisk vil indeholde 50-60% myogene celler 5) med tre børserfra stuetemperatur phosphatbufferopløsning (PBS) for at fjerne eventuelle resterende non-adhærente celler og debris fra isolation.
- Trypinize cellerne (0,04% trypsin i Ca2 + -fri PBS med 0,73 mM EDTA) i 3 minutter. Når cellerne er fritliggende, tilsættes 5-10 ml skeletmuskulaturen vækstmedium for at forhindre over-fordøjelse. Pelletere cellerne ved centrifugering ved 657 xg i 6 min ved stuetemperatur (20-25 C) og resuspender i et passende volumen af komplet medium til tælling.
- Tæl en lille prøve af cellesuspensionen ved hjælp af den ønskede metode (f.eks ved hjælp af et hæmocytometer eller en automatiseret optælling enhed) og beregne start celleantal og levedygtighed.
- Plate et par brønde i en plade med 96 brønde (eller større fartøj, hvis det kræves) for immuncytokemisk eller flowcytometri baseret karakterisering af befolkningen før sortering (fibroblaster og myogene celler vil være de mest rigelige celletyper stede).
- Til cellesuspensionen adD 15 ml sterilt PBS til at fortynde celler og medium. Centrifuger cellerne igen og resuspender dem i 170 pi stuetemperatur sortering buffer (1% BSA i en MACS skylleopløsning, steriliseret via passage gennem et 0,22 um filter).
- Tilsættes 35 pi godt blandede magnetiske mikroperler konjugeret til et CD56 primært antistof (klon AF12-7H3, 130-050-401) i cellen opløsning til pipette blandes og lad at inkubere i 15 min ved 4 ° C med forsigtig omrøring ved halvvejs.
- Efter inkubation fortyndes cellen og perlen opløsning med 10 ml MACS sortering puffer og centrifugeres ved 657 xg i 6 min. Resuspender cellerne i 1 ml sortering buffer.
- Tilsæt MLA separator (magnet) til MACS holder stand. Vær forsigtig, når du tilføjer magnet til standen på grund af den stærkt magnetfelt. Slot i kolonnen og passer pre-separation filter. 1 ml af sortering buffer gennem pre-separation filter og kolonnen for smøring.
- Immédiately efter dette, bland forsigtigt cellesuspensionen og drypper hele 1 ml gennem Pre-separation filter og i kolonnen.
- Vask kolonnen tre gange med 1 ml (eller 500 pi) for sortering buffer. Indsamle de ikke-bevaret celler, som passerer gennem søjlen på den første art i et sterilt 50 ml konisk rør indeholdende en lille mængde af vækstmedium. Disse celler er den første art CD56 - fraktion og vil blive stærkt beriget for bindevæv fibroblaster. Lad ikke kolonnen tørre ud mellem vaskene.
- Efter vasker fjerne pre-separation filter og tilsættes 2,5 ml MACS buffer til kolonnen. Straks derefter fjerner søjlen fra magneten og samle den første art CD56 + fraktionen i en separat 50 ml konisk rør ved at trykke stemplet i toppen af søjlen.
BEMÆRK: Stemplet passer meget stramt i toppen af søjlen og kan være ganske vanskelig at betjene; dog skal dette ske, mens kolonnen er stadig full buffer, så hastighed er påkrævet. Undgå at trykke stemplet for hårdt og hurtigt. - Forud for udpladning vurdere levedygtigheden af cellerne under anvendelse af, for eksempel trypanblåt assay. Bestem procentdelen af levedygtige celler fra 8 x 1 mm2 tælle felter (begge kamre i hæmocytometeret).
BEMÆRK: Cellerne kan enten enkelt eller dobbelt sorteres alt efter renhed kræves. Hvis det gøres omhyggeligt disse celler tolerere dobbelt sortering procedure udmærket og levedygtighed er meget høj> 95%. For dobbelt sortering, oprettet en anden kolonne, smøre med 1 ml sortering af buffer, og fortsæt fra trin 4.6.- Hvis billeddannelse skal udføres, plade celler direkte på dækglas beliggende i 24-brønds skåle 21 og overtrukket med valget af ECM-molekyle for cellebinding (f.eks collagen eller laminin). Her bruge 0,1-0,5 mg / ml collagen-I (tabel 3).
5. Sortering af Humen Muskel-afledte Fibroblaster straks efter isolering.
- For at rense fibroblast stamceller umiddelbart efter isolering, beskæftiger protokollen som ovenfor med følgende modifikationer:
- Umiddelbart efter isolering resuspender cellerne i komplet medium og filter en gang om en 100 um celle si og derefter igen selv en 40 um si. Der tilsættes 5 ml PBS og centrifugering ved 657 xg i 6 min.
- Resuspender cellerne i MACS sortering buffer og inkuberes i Anti-humane fibroblastmikroperler i 15-30 minutter ved stuetemperatur.
- Brug LS-søjle og Midi-MACS separator (tabel 3) og installere 40 um pre-separation filter.
- Udføre en eller to former, afhængigt af renheden nødvendigt overføre celler så hurtigt som muligt i serumholdigt medium, udføre en optælling, og pladen ved den ønskede densitet
6. immuncytokemisk farvning (1 dag og natten over).
- Fixceller i deres brønde ved tilsætning af et lige volumen af 8% paraformaldehyd i iskold PBS i 10 minutter med forsigtig omrøring. Efter 10 min aspirat fiksativ og vaskes to gange med PBS.
- Til immunfarvning celleoverfladeantigener, blok-celler i mindst 1 time i 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS og derefter probe med de relevante primære antistoffer (tabel 4).
- For intracellulære antigener, permeabilisere celler efter fiksering ved tilsætning af 0,2% Triton-X 100 i PBS med 1% BSA og NaN3 (0,01%) i 10 minutter, derefter blokere og inkuberes med primære antistoffer. Udfør alle primære antistofinkubationer natten over ved stuetemperatur (eller ved 4 ° C) med forsigtig omrøring på en vippende platform.
- Fjernelse af ubundet primært antistof og vaskes cellerne tre gange med kold PBS. Inkuberes i 1 time inkubation med artsspecifikke fluorescensmærkede sekundære antistoffer (tabel 4) ved stuetemperatur.
- Efter fjernelse afubundne sekundære antistoffer, skylles cellerne med tre udveksling af PBS og derefter kontrastfarve med det fluorescerende DNA-farvestof Hoechst 33342 (1 ug / ml) opløsning i 10 minutter på en vippende platform.
- For samtidig visualisering af begge celleoverfladeantigener og intracellulære antigener, til at probe cellerne først med primære antistoffer celleoverfladeantigener efterfulgt af deres passende sekundære antistoffer. Dernæst re-fix cellerne i kold PFA, permeabilisere, blok og inkuberes med primære antistoffer mod cytoplasmatiske eller nukleare antigener efterfulgt af deres relevante sekundære antistoffer.
- Efter farvning fjerne dækglas fra deres brønde med buede pincet og skyl bagsiden af dækglasset med destilleret vand. Læg dækglasset cellen glide ned på en dråbe af anti-fade montering medium 22 sæt på et glas objektglas.
7. Oil Red O farvning i kombination med immunfluorescensfarvning af celler (2 timer)
- Revealindholdet af celler lipid udpladet i 24 brønds skåle ved farvning med Oil Red O (1 - ([4- (Xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol) 5,23. Først fremstille en stamopløsning af 0,5% (w / v) Oil Red O ved at opløse 500 mg af Oil Red O i 60 ml 99% triethyl-phosphat og 40 ml destilleret vand. Oprethold denne opløsning ved stuetemperatur i mørke indtil brug.
- På dagen for anvendelse lave en 36% (w / v) triethyl-phosphat arbejdsopløsning indeholdende 12 ml Oil Red O stamopløsning og 8 ml destilleret vand. Filtrer denne opløsning gennem filtrerpapir nummer 42 for at fjerne alle krystalliserede Oil Red O (som forringer billedkvaliteten).
- Forsigtigt opvarme denne arbejdsopløsning i et vandbad i 1 time, hvorefter opløsningen centrifugeret ved 1.200 xg i 6 min. Fjern supernatanten og filtreres igen gennem filtrerpapir (nummer 42) og overføres til et frisk 20 ml rør.
- Efter cellerne er blevet fastsat, permeabiliseres og immunofarvet, fjern PBS, og der tilsættes 500 pi Oil Red O / Triethyl-phossulfat opløsning til brøndene i 60 min. Triton-X ved den koncentration her bruges til cellemembranen permeabilisering påvirker ikke cellulære fedtindhold 23.
BEMÆRK: Oil Red O exciteres ved bølgelængder mellem 540 og 580 nm og dermed Texas-rødt filter kan anvendes til at detektere Oil Red O emission i fluorescensmikroskopi 23. Bemærk at fluorescensemissionen fra Oil Red O lejlighedsvis kan sive ind i langt røde kanal, hvis celler er meget stærkt farves (dvs. meget højt fedtindhold). - Efter inkubation fjernes det overskydende Oil Red O og skylles cellerne fem gange med 500 pi PBS. Monter dækglas som for immunfarvning som beskrevet i afsnit 6. Detect Oil Red O farvestof både brightfield / fasekontrastmikroskopi eller ved epifluorescensmikroskopi hjælp af Texas Red filter (skift fri, EX BP 560/40, BS FT 585, EM BP 630 / 75, Carl Zeiss).
8. Indhentning Mikrografier fra Fluorescence Microscopy til efterfølgende AnANALYSE
BEMÆRK: Sørg for, der glider skal sammenlignes kvantitativt farves med de samme løsninger, fotograferet på identiske betingelser (fx eksponering, kamera og indstillinger køb etc.) og fanget i den samme mikroskopi session. Alle formatering efter overtagelsen skal også være ens og være i nøje overensstemmelse med forslaget til retningslinjer for digitale billeder 24.
- For billedoptagelse (vidvinklede mikroskopi), tænde mikroskopet og fluorescens lyskilde og orlov til den anbefalede mængde af tid til at gøre det muligt for fluorescens lyskilde til at varme op og stabiliseres.
- Indstil den mørke strøm til kameraet ved at blokere strålegangen til kameraet; erhverve et billede med maksimal opløsning og bruge denne til at rette senere erhvervede billeder.
- Belyse immunfluorescerende prober ved epifluorescens leveret af flydende lysledere (fleksibelt rør af fluorplast fyldt med phenylmethyl siliconeolie) ennd signaler visualiseret gennem rød (filter sæt 45 HQ Texas rødforskydning fri, grøn (filter sæt 44 FITC særlige skift gratis) og blå (filter sæt 49 DAPI skift gratis) band pass filtre på en omvendt epi-fluorescens mikroskop (10X, 20X, 40X, planlægge apokromatiske mål med 0,25, 0,75, 0,95 numeriske åbninger henholdsvis).
- For at undgå pixel mætning finde den optimale eksponering i det lineære område af detektoren for hver fluorescerende markør ved hjælp af 'overeksponering' i billedet erhvervelse software. Notér den standardiserede eksponering for hver fluorescerende mærke.
- Capture enkelte kanaler og gemme gråtoner eller pseudocolored tiff (TIFF) billedfiler i den højeste bit dybde (helst 16 bit - 65.536 grå værdier), som optagelsen enhed (f.eks afkølet CCD (opkræves koblet enhed) monteret på mikroskop) . Indstil billedopløsningen til 1.388 x 1.040 eller højere. Vær sikker på at medtage en skala bar eller en genstand med kendt dimensioner i billedet.
- Hvor det er muligt at gemme filer i 16 bit TIFF (.tiff) og ikke i .jpeg-format for at forhindre tab af information 25.
- Hvis der er nogen bekymring over jævnhed af belysning (software bundtet med mikroskop kan have automatisk korrektion for dette) tage en "fladskærms-feltet 'billede af dækglas uden celler, men farves og monteres på samme måde som eksperimentelle dias; dette kan bruges til at korrigere for belysning defekter efter opkøb i billedanalyse software.
- For billedoptagelse (konfokal mikroskopi), optimere detektor forstærkning og laser strøm til hver imaging eksperiment (undgå mætning). Generelt fluorescensen måles er proportional med laser effektniveau. Sæt pinhole størrelse til '1 luftige' for at opnå bedst signal-støj-forhold (forbedret opløsning kan opnås ved 0,5 luftige for særligt stærke signaler). Tag optiske sektioner på forskellige niveauer langs z-aksen gennem antiBody-mærkede celler og gemme en 16 bit maksimal projektion for hver kanal til billedanalyse.
9. Udførelse Målinger af fluorescensmærkede nukleare transkriptionsfaktorer Brug billedbehandling og Analysis Software (5 min pr synsfelt).
- Adgang individuel tiff billedfiler og overlay tilsvarende kanaler ved at klikke og trække et billede til et andet. Hver kanal vises derefter som et separat lag i panelet Lag.
- Vælg lysne fra filteret menuen for at give lag under at blive visualiseret samtidigt. Alternativt justere opaciteten af de øverste lag til 50%.
BEMÆRK: TIFF-billeder kan gemmes med "tabsfri" Lempel-Ziv-Welch (LZW) datakomprimering at sænke filstørrelser uden tab af information. - I analysen vinduet (Analyse> Vælg datapunkter> Brugerdefineret), vælg Analyse og vælge de målinger, der kræves (f.eks Integreret tæthed, betyde Density, cirkularitet, histogram etc.). Kassér alle unødvendige målinger ved at fjerne markeringen i feltet ud for dem. Hvis arealet er påkrævet i um klik på Analyse> Indstil måleskala. Herskeren Værktøjet vises automatisk - spore længden af skalaen bar og indtaste sit kendt længde i mikrometer. Softwaren vil derefter konvertere arealet til firkantede mikron.
BEMÆRK: Hvis der er valgt histogram analyse, når målinger registreres en ekstra mappe vises (placeringen af som kan vælges) med 8 bit histogrammer for hver enkelt valgområde i mikrografiet samt summen af alle individuelle valg (dette altid vises som Histogram-1, hvis flere valg er lavet). Denne analyse kan ikke udføres af softwaren i 16 bit format, men er meget anvendelig til at undersøge fordelingen af pixel intensiteter gennem et objekt af interesse. - Til analyse af nukleare fluorescensintensitet først konstruere et repræsentant 'Color Range Selection Mask "(CRSM) for Hoechst eller DAPI farvede DNA til at definere det nukleare område. Når den ønskede kanal billeder overlejret, bør kun Hoechst kanal lag efterlades i udsigt ved at sikre den "øje-ikonet" støder op til det under fanen Lag er valgt, og derefter lag er markeret (bliver blå), mens alle andre lag bør være fravalgt. Sørg for, blending dropdown er sat tilbage til "normale" under fanen Lag.
- Åbn dialogboksen Color Range (Vælg> Color Range) og indstil valgmulighed dropdown til stikprøveudvalgte farver «. Med valget forhåndsvisning sat til 'maske' (rød baggrund) Vælg alle de blå farvetoner i kernerne ved at holde shift-tasten ("+" tegnet vises) ved at klikke i kernerne ved hjælp af pipette værktøj, der vises.
- Hvis der er valgt uønskede toner, skal du fjerne dem ved at trykke på Alt-tasten ("─'sign vises) og klikkepå dem. Fastholde uskarphed skalaudslag i nulpunktet, så kun manuelt udvalgte farvetoner indgår i målingen og »Lokaliserede farve klynger bør ikke gøres noget.
- Gem denne CRSM til computerens harddisk som et-program-specifikke ekstrakt fil (.AXT fil). Med en anden tilfældig inden for kerner, belastning, opdatere og gemme CRSM (Select, Color Range, Load). Gør dette i mindst fem tilfældige felter for at sikre, at nukleare markeringer er repræsentative.
- Brug en farvet udgave af et gråtonebillede til oprettelse af en maske for at isolere funktioner, fordi det menneskelige øje er bedre i stand til at skelne mellem forskellige nuancer af farve end mellem forskellige gråtoner 26.
- Brug nukleare CRSM at segmentere nukleare regioner til farvning. Når kerner er udvalgt Klik på billedet> Justering> Threshold og flyt skyderen helt til højre, således at kernerne bliver sort. Alternativthøjreklikke og vælge "Fyld" derefter vælge "Fyld til: sort '. Klik derefter på Vælg> Inverter og nu trykke Slet for at fjerne alle baggrund (hvis indstillingen vises vælg 'fyld til: Hvid'). Dette væsentlige binarizes billedet ud fra dit valg. Derefter indlæse skelsættende plugin fra fanen filtrene til at adskille overlappende kerner (Filter> binære billede> Watershed funktion separation).
- Hvis mange kerner er stærkt overlappende, fjern kernerne fra analyse ved at fjerne markeringen dem (hold Alt-tasten og løst trække omkring dem med lasso værktøj).
- På den nu binære nukleare lag, gå til Vælg> Color Range og> Shadows, at vælge individuelle kerner. Alternativ hold shift og klik på en hvilken som helst sort kerne. Alle kerner vil straks blive udvalgt. Derefter overfører dette valg til laget, der indeholder nukleare transkriptionsfaktor farvning (f.eks myogenin) ved at vælge det lag og fravælge alleandre lag. Marching linjer vil nu viser positionen af kernerne i myogenin kanal.
- Hvis du arbejder med pseudocolored kun billeder klik på paletten Kanaler (til højre for fanen lag), og kun vælge den grønne kanal (billedet vises nu grå). Klik derefter på Billede> Tilstand> Gråtoner. Der vises en advarsel "Samkopier synlige lag og skjulte lag kassere 'Klik på OK, så en anden advarsel vil sige" kassere andre kanaler' på OK igen. Kun et enkelt lag af gråtoner udvalgte kerner vil nu være til stede i lag paletten.
- Klik registrere målinger i målingen Log at indhente data for de valgte kerner. Hvis laget, der skal analyseres (f.eks myogenin farvning) er allerede en rå 16 bit gråtonebillede derefter blot trykke registrere målinger.
- Eksport udvalgte målinger som txt-fil til placeringen af dit valg. Disse kan derefter bearbejdes yderligere og analyseret i anden håndtering af data software packages
BEMÆRK: Rediger> tilbageskridt kommando (Tryk alle Alt, Ctrl og Z taster samtidigt) genskaber alle tidligere lag, hvis det kræves. - Korrekt for ikke specifik baggrundsfluorescens 27 for resultater til at være kvantitativ og sammenlignelige som målinger af fluorescens intensitet er altid en blanding af signal og baggrund.
- Vælg den firkantede markeringsværktøj og tjek "fast størrelse" vælger 20 med 20 pixel (eller større, hvis det ønskes, og afhængigt af konfluens af celler i billedet). Mens du holder shift vælge ti eller flere baggrundsområder spredt over hele synsfeltet. Tryk 'registrere målinger' i Måling Log.
- Beregn den gennemsnitlige integrerede tæthed (summen af alle pixel grå værdier) pr pixel i alle 10 udvalgte baggrund regioner (givet som »gennemsnitlige grå værdi« i målingen log). Det gennemsnitlige baggrund tæthed per pixel med antallet af pixels i målobjektet (
- Subtraher baggrundsfluorescens fra objekterne oprindelige integrerede tæthed til opnåelse af endelige korrigerede baggrund værdi. Denne fremgangsmåde udgør potentielle felt til felt variation i ikke-specifik baggrundsfluorescens.
BEMÆRK: Det er yderst vigtigt at vælge kun bona fide baggrund regioner denne korrektion har en betydelig indvirkning på de endelige værdier. Anbefales zoomer ind ved hjælp af forstørrelsesglas, når de foretager valg.- Det kan også være nyttigt at opdele den generelle baggrund korrigerede værdi af det område af kernen i pixel (samme som at tage gennemsnitlige gråtone / intensitet per kerne) for at minimere eventuelle påvirkning af nukleart lokaliseret baggrund signal, der ville bidrage mere til den integrerede tæthed værdi med stigende nuklear størrelse (figur 3C).
- Subtraher baggrundsfluorescens fra objekterne oprindelige integrerede tæthed til opnåelse af endelige korrigerede baggrund værdi. Denne fremgangsmåde udgør potentielle felt til felt variation i ikke-specifik baggrundsfluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oprensede myogene celler og fibroblaster kan dyrkes i adipogenisk differentiering medium i tre dage efterfulgt af adipogenisk ernæring medium fra et sted mellem 7-30 dage for at vurdere deres potentiale for adipogenese. Anvendelse af det oprensede cellepopulationer, Oil Red O-farvning i kombination med immunfarvning for adipogeniske og myogene afstamning markører viste, at kun fraktionen fibroblast var i stand adipogenisk differentiering (figur 2). Den massive ophobning af fedt af fibroblasterne er synlig med det blotte øje (panel A), og deres fuldstændige transdifferentiering er vist ved den meget stærke ekspression af nuklear PPAR γ (figur 2 paneler B & C og figur 3). Med 15 dage behandling, har disse celler frigivet eventuelt resterende TE-7 (en bindevæv antigen) på deres substrat (panel D). Derimod myogene celler opretholde deres normale fænotype, herunder ekspression af desmin og myosin tungkæde (figur 2 paneler E & F) og ikke opregulerer nukleare PPARy (figur 3C).
Et eksempel på kvantitativ analyse af et felt af myogene celler (desmin +) er vist i figur 3. Panel B viser området analyseres og panel A viser kvantificerede fluorescensintensitet (efter korrektion baggrund). Denne metode viser klart variationen af myogenin ekspression i individuelle kerner på dette specifikke podningstæthed og tidspunkt. Figur 3C viser anvendeligheden af fremgangsmåden til direkte at sammenligne transkriptionsfaktor niveauer i forskellige celletyper på en celle til celle-niveau. Her viser vi, at CD56 - muskel fibroblaster udtrykker et højt niveau af de adipogeniske transkriptionsfaktor PPARy henviser sorteret CD56 + myogene celler opretholder kun meget lave niveauer efter udsættelse for adipocyt Inducing Medium.
Figur 1:. Oprensede populationer af myogene celler og fibroblaster opnået ved immunmagnetisk perle sortering (AB) Efter en uge i kultur sorteret myogene celler udtrykker celleoverfladen celleadhæsionsmolekyle CD56 (N-CAM) og musklen specifikt mellemprodukt filament desmin. Nuklear ki-67-ekspression dokumenterer, at disse celler prolifererende. Farvningen af membranen, cytoplasmiske og nukleare bestanddele er beskrevet i protokol trin 6.5. (CD) myogene celler udtrykker ikke fibroblast markør TE-7. (E) Fibroblaster afledt fra human muskel udtrykke TE-7 og (F) den transmembrane blodplade -afledt vækstfaktorreceptor α (PDGFRα). Skalapanelerne er: (A) = 20 um, (B, C & E) = 200 um (D & F) 50 &# 181;. M Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2: human muskel-afledte CD56 - / TE-7 + fibroblaster og CD56 + / desmin + myogene celler dyrket i adipocyt Inducing Medium (AIM). (A) Fibroblaster isoleret ved MACS differentiere til adipocyter, når de dyrkes i adipocyt Inducing Medium (AIM), og dette kan ses let med det blotte øje efter Oil Red O-farvning. Myogene celler viser ingen tegn på adipogenisk differentiering efter samme periode i AIM og viser meget begrænset Oil Red O-farvning. (B & C) HUman muskel-afledte fibroblaster meget udtrykkelig PPARy og CEBPα (ikke vist) efter dyrkning i AIM. (C) Da fibroblaster differentiere til adipocyter de frigiver resterende intracellulær ECM protein, som danner et tæt netværk omkring dem. (E) Myogenic celle bevarer deres myogenic morfologi og ekspression af afstamning markører, såsom desmin og (F) myosin tung kæde (MHC), en markør for terminal myogene differentiering og mislykkes med at samle lipid. Scale barer er: (B, D) = 200 um (E, F) = 100 um, (C) = 100 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3: Sample data indhentet fr about immunolabelled kulturer ved hjælp af beskrevne billedanalyse metode (Adobe Photoshop Extended tilgang). (A) en celle til celle-fluorescensintensitet plot for musklen specifikke nukleare transkriptionsfaktor myogenin efter 24 timer i serumfrit differentiering medium. (B) Repræsentative mikrografier af desmin + / myogenin + humane myogene forstadier. Scale barer er: (B) = 50 um (C) PPARy fluorescensintensitet i individuelle kerner fra sorteres CD56 + / desmin + myogene populationer (CD56 +) og CD56 - / TE-7 + / PDGFRα + / Collagen VI + celler (CD56. -) efter dyrkning i adipocyt Inducing Medium i 15 dage. De fluorescens-værdierne blev normaliseret til nukleare område for at tage højde for variationer i nukleare størrelse mellem de to celletyper. Vandrette sorte bjælker i (A) og (B) viser middelværdien.52.049 / 52049fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| Mediumkomponenter | Koncentration | Katalog nr. | Kommerciel kilde |
| Human skeletmuskel vækstmedium: | C-23060 (Comes "klar til brug", der indeholder alle de faktorer, der er anført) | ||
| Skeletmuskel basalmedium | - | Promocell | |
| Føtalt kalveserum | 15% | Promocell (5%) og FCS Gold, PAA Laboratories (10%) - Cat nr. A15-151 | |
| Fetuin (kvæg) | 50 ug / ml | Promocell | |
| Epidermal vækstfaktor | 10 ng / ml | Promocell | |
| Basisk fibroblastvækstfaktor (rekombinant human) | 1 ng / ml | Promocell | |
| Dexamethason | 0,4 ug / ml | Promocell | |
| Insulin (rekombinant human) | 10 ug / ml | Promocell | |
| Penicillin | 100 U / ml | Sigma | |
| Streptomycin | 100 ug / ml | Sigma | |
| L-Glutamin | 292 ug / ml | Sigma | |
| Myogene differentiering medium | C-23260 | ||
| Skeletmuskel basalmedium | - | Promocell | |
| Penicillin | 100 U / ml | Sigma | |
| Streptomycin | 100 ug / ml </ Td> | Sigma | |
| Bemærk: Promocell, Heidelberg, Tyskland; Sigma-Aldrich Company Ltd, Dorset, UK | |||
Tabel 1: cellekulturmedier komponenter og koncentrationer.
| Medium sammensætning | Koncentration | Katalog nr. | Firma |
| Preadipocyte Vækstmedium | C-27410 (klar til brug) | ||
| Føtalt kalveserum | 0,05 ml / ml | Promocell | |
| Endothelial Cell Growth Supplement | 0,004 ml / ml | Promocell | |
| Epidermal vækstfaktor (rekombinant human) | 10 ng / ml | Promocell | |
| Penicillin | 100 U / ml | Sigma | |
| Streptomycin | 100 ug / ml | Sigma | |
| Glutamin | 292 ug / ml | Sigma | |
| D-biotin | 8,0 ug / ml | Promocell | |
| Insulin (rekombinant human) | 0,5 ug / ml | Promocell | |
| Dexamethason | 400 ng / ml | Promocell | |
| IBMX | 44 ug / ml | Promocell | |
| L-Thyroxine | 9 ng / ml | Promocell | |
| Ciglitazon | 3 ug / ml | Promocell | |
| Penicillin | 100 U / ml | Sigma | |
| Streptomycin | 100 ug / ml | Sigma | |
| Glutamin | 292 ug / ml | Sigma | |
| Preadipocyte differentiering medium | C-27436 (klar til brug) | ||
| D-biotin | 8,0 ug / ml | Promocell | |
| Insulin (rekombinant human) | 0,5 ug / ml | Promocell | |
| Dexamethason | 400 ng / ml | Promocell | |
| IBMX | 44 ug / ml | Promocell | |
| L-Thyroxine | 9 ng / ml | Promocell | |
| Ciglitazon | 3 ug / ml | Promocell | |
| Penicillin | 100 U / ml | Sigma | |
| Streptomycin | 100 ug / ml | Sigma | |
| Glutamin | 292 ug / ml | Sigma | |
| Adipocyt næringsmedium | C-27438 (klar til brug) | ||
| D-biotin | 8,0 ug / ml | Promocell | |
| Insulin (rekombinant human) | 0,5 ug / ml | Promocell | |
| Dexamethason | 400 ng / ml | Promocell | |
| Penicillin | 100 U / ml | Sigma | |
| Streptomycin | 100 ug / ml | Sigma | |
| Glutamin | 292 ug / ml | Sigma | |
| Bemærk: Promocell, Heidelberg, Tyskland; Sigma-Aldrich Company Ltd, Dorset, UK | |||
Tabel 2: Sammensætning af adipogenisk celledyrkningsmedier.
| Navn på udstyr / reagens | Firma | Katalog nr. | Kommentarer / beskrivelse |
| Cellekultur | Collagenase D | Roche | 11088866001 |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | Skal filter steriliseres før brug |
| Trypsin / EDTA | (Gibco) Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 um cellefilter | BD Biosciences | 352.360 | |
| Collagen-opløsning (3 mg / ml i 0,1% eddikesyre) | Sigma, Dorset, UK | C8919 | |
| Minisart SRP15 sprøjtefilter (0,2 um) | Sartorius | 17573ACK | Polytetrafluorethylen (PTFE) membran |
| CD56 menneskelige Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-050-401 | Magnetisk cellesortering (MACS) Vær opmærksom på den begrænsede holdbarhed af mikroperler |
| Anti fibroblastmikroperler, human | Miltenyi Biotech | 130-050-601 | |
| 40 um Pre-separation filtre | Miltenyi Biotech | 130-041-407 | |
| Storcellet collumns | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | Disse kolonner kommer med et flow modstand. Anvendelse af strømningsmodstanden er ikke nødvendig for at opnå de høje myogene renheder beskrevet her. |
| LS kolonner | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | Denne separator passer storcellet kolonne, men ikke LS kolonne. |
| MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| BSA | Sigma | Skal filter steriliseres før brug | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | Lipid-farvning |
| Triethylphosphat | Sigma | 538.728 | |
| Whatman Paper | Sigma | Z241121-1PAK | No. 42, askefrit. For at fremstille filteret fold cirkulære filterpapir til at gøre en halvcirkel, så fold halvcirklen i halvdelen igen for at danne en kegleform. Monter kegle i en tragt til filtrering. |
| Montering | |||
| Forlænge Gold antiblegemiddel Reagent | Molecular Probes, Invitrogen | P36930 | Dette kan købes med eller uden DAPI og ikke slukke indledende fluorescens. |
| AxioVision | Carl Zeiss- | Kontakt Zeiss | Billede erhvervelsen software |
| Adobe Photoshop CS5 Extended | Adobe (købt hos Pugh Computers) | ADPH16982 * | Billedanalyse software |
Tabel 3: Udstyr og reagenser.
| Navn / antigen | Antistof arter og isotypen | Klon navn | Fortynding til brug | Katalog nr. | |
| Myogene markører: | |||||
| CD56 (N-CAM) | Mus mc IgG 1 | MY-31 | (1: 100) | 347.740 | BD |
| Desmin | Kanin mc IgG 1 | D93F5 (XP) | (1: 250) | 5332S | NEB |
| Myogenin | Mus mc IgG 1 | F5D | (1:50) | F5D | DSHB |
| Myosin Heavy Chain | Mus mc IgG2b, kappa let kæde | MF20 | (1: 200) | MF20 | DSHB |
| Fibroblast / bindevæv | |||||
| TIssue markører: | |||||
| Anti- human fibroblast | Mus mc IgG 1 | TE-7 | (1: 100) | CBL271 | Millipore |
| PDGFRα | Kanin mc IgG | D13C6 | (1: 500) | 5241 | NEB |
| Proliferative markører: | |||||
| Ki67 | Kanin mc IgG | SP6 | (1: 200) | MP-325-CRM1 | MD |
| Adipogenisk | |||||
| transkriptionsfaktorer: | |||||
| PPARy | Mus mc IgG 1 | E8 | (1:20) | SC-7273 | Santa Cruz Biotechnology |
| Nøgle: mc: monoklonale,PC: polyklonale, DSHB: Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa USA; | |||||
| NEB: New England BioLabs, UK; MD: A. Menarini Diagnostics, UK; BD: BD Bioscience, UK. | |||||
Tabel 4: primære antistoffer.
| Antigen | Antistof arter og isotypen | Fortynding | Katalog nr. | Firma |
| Alexafluor488 | Gede-anti-muse-IgG (H + L) | 1: 1000 | A-11001 | MP |
| AlexaFluor 594 | Gede-anti-muse-IgG (H + L) | 1: 1000 | A-11005 | MP |
| AlexaFluor 594 | Gede-anti-kanin-IgG (H + L) | 1: 1000 | A-11012 | MP | </ Tr>
| Nøgle: H + L = tunge og lette kæder; MP: Molecular Probes, Invitrogen Life Technologies, Paisley UK | ||||
Tabel 5: Sekundære antistoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en immunomagentic sortering procedure for selektiv berigelse af menneskelige muskel-afledte forstadier fra små prøver af muskel biopsi materiale. Denne teknik har været uvurderlig i vores laboratorium for at overvinde tabet af human muskel-afledte kulturer fibroblaster, men også for at forstå den unikke opførsel af distinkte populationer af muskel- afledte progenitorceller. Når rensede myogene celler kan undersøges for ændringer i protein og / eller genekspression, eller anvendes til downstream eksperimenter.
Ud over celle oprensning vi også detaljer en enkel og hurtig fremgangsmåde til analyse af specifikke områder af interesse i micrographs fra fluorescensmikroskopi. Digitale billeder fra fluorescensmikroskopi indeholder et væld af oplysninger om cellebiologer at udvinde; faktisk pixel holde data, der ikke nødvendigvis mærkbar for det menneskelige øje. Med denne teknik kan der opnås kvantitative data om et stort antal af individuelle celler i en population. En unik egenskab ved billedanalyse i forhold til flowcytometri er evnen til at korrelere ændringer i proteinekspression med ændringer i celleform orcell-celle interaktioner. Endvidere kapaciteten oprette og gemme optimeret og repræsentativt udvalg masker tillader hurtig, nøjagtige og reproducerbare målinger, der skal foretages på tværs af mange synsfelter dermed mindske risikoen for brugeren bias.
MACS-baserede celle oprensning
En fordel ved denne metode er, at cellerne kan oprenses held enten umiddelbart efter isolering eller efter et par dage i kultur (hvor udbyttet vil være højere).
Afgørende, bør myogene celler ikke lov til at blive sammenflydende før sortering fordi dette hæmmer deres passage gennem søjlen og vil reducere andelen af proliferative celler opnået for yderligere ekspansion og eksperimenter.
t "> Afhængigt oprindelige vævsprøve opnås, kan der være et stort antal ikke-adhærente erythrocytter i kulturen på dette tidspunkt. Metoder eksisterer til selektivt lysere erythrocytter, men for at undgå enhver unødig kemisk stress muskel-afledte celler denne trin undgås. Vi har ikke observeret nogen bemærkelsesværdige negative virkninger af erythrocytter på den tidlige dyrkning af humane muskel-afledte celler, og disse erytrocytterne fjernes ved medieændringer når myogene celler vedhæfte.Andre fremgangsmåder til celle løsrivelse lige før sortering (fx andre blide proteaser eller EDTA baserede metoder) kan anvendes til celler, hvori ekspressionen af celleoverflade-antigenet er lav eller særligt følsomme over for tryptisk fordøjelse. Ekspressionen af CD56 på humane myogene celler er stærk og modstandsdygtig over for en kort trypsinsation (når analyseret med antistofferne beskrevet her).
Det er vigtigt, at sortering buffer indeholder EDTA at inhibere calcium-afhængig celle-celle adhæsion; dette er af afgørende betydning for at opnå (og opretholde) et enkelt-cellesuspension til sortering. Afhængigt af celleantal, form og størrelser, der skal sorteres, er der et valg, der skal foretages med hensyn separeringskolonnen (se tabel 3).
Fjernelse af søjlen fra det magnetiske felt for at frigive tilbageholdte celler kan være vanskelig, så sikre, at opsamlingsrøret (selvom skørt) er placeret i en holder placeret meget tæt til søjlen for at undgå tab af celler i transit.
Selv om vi har beskrevet denne teknik til brug med humane primære celler fra skeletmuskulaturen, kan denne protokol let tilpasses til andre celletyper, for hvilke en specifik / unik celle-overflade markør er kendt. Andre fordele nævnes, at hele proceduren kan udføres i sterile arbejdsmiljø af en laminar strømning. Også MACS procedure er mere skånsom på cellerne i forhold til FACS-sortering på grund af lavforskydningskræfter og kan være en særlig fordel for større celler. De magnetiske perler, der anvendes er små, ikke-toksiske og bionedbrydelige i kultur. Faktisk MACS har med held været anvendt til oprensning og undersøgelse af en række andre celletyper.
En begrænsning ved denne teknik er, at MACS ikke nemt kan udføres for flere markører på samme tid. Ligeledes kan mængden af markør og størrelse af celler ikke kan fastslås under sorteringsprocessen, kun bagefter.
Overvejelser til at optimere indsamling og analyse billede
Billedet analysemetode påvises her tilvejebringer et kraftfuldt værktøj til at belyse ændringer i ekspressionsniveauet af proteiner på en celle til celle-basis i store populationer af celler. Ved at udnytte lagene facility og udvælgelse masker i et bredt tilgængelig softwarepakke, kan forsøgslederen objektivt vælge forskellige fluorescerende signaler på tværs af flere billeder, for at tilladekvantificering af individuelle træk, og et antal af komponenter i dem. Vi har med succes anvendt denne metode til at kvantificere og direkte sammenligne række transkriptionsfaktor ekspression i forskellige cellepopulationer udsat for en adipogeniske udfordring.
Hver fluorescens kanal (der repræsenterer en specifik markør) kan holdes adskilt fra de andre og slået til eller fra efter behov, hvilket er nyttigt for flerfarvede immunomærkning eksperimenter.
En række faktorer skal tages i betragtning, når du forsøger at udtrække kvantitative og semi-kvantitative data fra fluorescensmikroskopi 28. Opmærksomhed på disse vil tillade grundlæggende semi-kvantitative målinger, der skal foretages. Ofte forskere ønsker at bruge en række fluorochromer at mærke forskellige proteiner af interesse; af afgørende betydning er evnen til at kunne skelne mellem de enkelte emissionsspektre. I de fleste tilfælde opnås ved selektiv excitation af kun en fluorochrom ad gangen. Men hvis emission og / eller excitationsspektre overlapper betydeligt eller utilstrækkeligt filtreres derefter bløder-through eller krydstale kan kompromittere nøjagtigheden af billeddata opnåede. Udluft gennem er passagen af fluorescensemission i en uhensigtsmæssig detektion kanal og er forårsaget af et overlap på emissionsspektre 29,30.
Nogle punkter at overveje, er: valg af fluorokromer, som har godt adskilt excitation og emission spektre, ved hjælp af meget selektive excitationsbølgelængder (som opnås ved lasere i konfokal mikroskopi), sikre, at udledningen filtersæt er strenge nok til at udelukke uønskede bølgelængder, og udførelse af flerfarvet billeddannelse på den længste (dvs. den "rødeste") bølgelængde peak emission farvestof først at tage højde for det faktum, at absorptionsspektre generelt skæv til kortere bølgelængder (blå lys), mens emission spektre skæv retning længere Wavelengths (rødt lys). Spektrene for fluorescerende mærker er tilgængelige på 'Fluorescens Spectraviewer «fra Invitrogen.
Brugen af mål af høj kvalitet er afgørende for billeder, der er bestemt til analyse. En høj numerisk blænde (> 1.3) er bedst og forstørrelser bør tilpasses til kameraet i Vidvinklet mikroskopi. I både Vidvinklet og konfokal mikroskopi, NA er kritisk, da Z-opløsning forbedrer som en funktion af den numeriske apertur kvadreret 29. Hvor det er muligt at gøre brug af Plan-apokromater, der korrigeres for både sfæriske og kromatiske aberrationer 29. Anvendelse af flydende lysledere anbefales kraftigt, da de reducerer ujævn belysning ved scrambling kilden belysning for at reducere tid og rum kohærens inden den træder i mikroskopobjektivet 29.
Det er vigtigt at undgå mætning af billeder, som mættede pixels kan ikke være korrekt kvantified grund klipning af oplysninger på det mest intense grå niveau værdier 26.
Forskellige "plugins" kan være til rådighed for at muliggøre flad-field korrektionsprocedurer til udført med relativ lethed; for eksempel Dr. John C. Russ har gjort mange af disse gratis tilgængelig online (http://www.drjohnruss.com/download.html). Brug af denne plugin forholdet mellem lysstyrke for hver pixel i den eksperimentelle mikrografi til den tilsvarende i referencebilledet beregnes og erstatter det oprindelige. Resultaterne er derefter skaleres til at fylde lysstyrken række af billedet. Alternativt billedet lommeregner af ImageJ er et andet middel til at korrigere for ujævn belysning.
For nogle billedanalyse kan konfokal mikroskopi være den foretrukne fremgangsmåde da det forhindrer ud af fokus fluorescens fra at nå detektoren 29. Imidlertid kan denne fremgangsmåde tage væsentligt længere end vidvinklede fluorescensmikroskopi begrænse følelsesløsER enkelte synsfelter, der kan opnås i en enkelt session.
For nylig er rapporteret andre metoder til berigelse af myogene celler fra humant muskelvæv. Bareja 31 anvendes en kombination af MACS udtømning (for: CD11b, CD31, CD34 og CD45), efterfulgt af FACS for positiv selektion af CXCR4 + / CD56 + myogene celler. , Skønt denne procedure var i stand til at generere et højt beriget myogene befolkning, er det imidlertid væsentligt længerevarende end fremgangsmåden beskrevet her, indeholder mange flere på hinanden følgende trin og resulterer i et lavere udbytte af oprensede myogene celler lavere per gram væv.
I en anden undersøgelse for nylig, Castiglioni 32 isolerede myofibre-associerede celler fra human føtal muskel ved FACS ved hjælp af flere markører og viste, at CD34 - / CD56 + / Pax7 + celler (arketypiske satellit celler) kan udvise osteogent samt myogenic afstamning Potential, men generelt enighed med vores arbejde viser ikke adipogenisk potentiale. Disse forfattere viste også, at CD34 + / PAX7 - celler var ikke-myogene, men var i stand til adipogenisk og osteogen differentiering. Den berigelse af CD90-ekspression (en markør for muskel fibroblaster 33) i CD34 + ikke-myogenic fraktion tyder på, at en stor del af disse celler kan have været fibroblaster, som har vist sig at være den største kilde til adipocytter hos voksne human skeletmuskel kulturer (henvisning 5 og figur 2). Uanset om muskel-afledte fibroblaster har også osteogene differentiering potentielle warrants yderligere undersøgelser.
I modsætning til fremgangsmåden ifølge Castiglioni 32 vores metode kræver kun ét antistof (i modsætning til 7) til reproducerbart at opnå høje udbytter af rene myogene cellekulturer og kan udføres hurtigt inden for de aseptiske forhold i en laminar strøm-hætte. En yderligere methodological forskel er, at disse forfattere isolerede celler direkte fra dissocieret muskler og derefter fulgte disse i kultur, mens vi oftest kultur celler i 1 uge før sorteringen og dyrke. I vores hænder denne fremgangsmåde er bedre tolereret af cellerne. Vigtigere, samlet tid i kultur er i det væsentlige ækvivalent mellem de to metoder. Endvidere, eftersom føtalt skeletmuskel undergår hyperplasisk og hypertrofisk muskelvækst 34 er det ikke overraskende, at udbyttet af myogene forstadier er større fra føtalt muskelvæv i forhold til voksne muskel
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | Must be filter sterilized before use |
| Trypsin/EDTA | (Gibco) Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 μm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Sigma, Dorset, UK | C8919 | |
| Minisart SRP15 syringe filter (0.2 μm) | Sartorius | 17573ACK | Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane |
| CD56 human Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-050-401 | Be aware of the limited shelf life of microbeads |
| Anti- fibroblast Microbeads, human | Miltenyi Biotech | 130-050-601 | |
| 40 μm Pre-separation filters | Miltenyi Biotech | 130-041-407 | |
| Large Cell Collumns | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here. |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MiniMacs Seperator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | This separator fits the large cell column but not the LS column. |
| MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| BSA | Sigma | Must be filter sterilized before use | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Triethyl phosphate | Sigma | 538728 | |
| Whatman Paper | Sigma | Z241121-1PAK | No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Molecular Probes, Invitrogen | P36930 | This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence. |
| AxioVision | Carl Zeiss | Contact Zeiss | |
| Adobe Photoshop CS5 Extended | Adobe (purchased from Pugh Computers) | ADPH16982* |
References
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibres. J. Cell Biol. 9, 493-495 (1961).
- Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J. Appl. Physiol. 91, 534-551 (2001).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and the Muscle Stem Cell Niche. Physiol. Rev. 93, 23-67 (2013).
- Alsharidah, M., et al. Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture. Aging Cell. 12, 333-344 (2013).
- Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. Human skeletal muscle fibroblasts, but not myogenic cells, readily undergo adipogenic differentiation. J. Cell Sci. 126, 5610-5625 (2013).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138, 3625-3637 (2011).
- Webster, C., Pavlath, G. K., Parks, D. R., Walsh, F. S., Blau, H. M. Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter. Exp. Cell Res. 174, 252-265 (1988).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. J. Vis Exp. , e50074 (2013).
- Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric Self-Renewal and Commitment of Satellite Stem Cells in Muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
- Mackey, A. L., et al. Assessment of satellite cell number and activity status in human skeletal muscle biopsies. Muscle a d Nerve. 40, 455-465 (2009).
- Stewart, J. D., et al. Characterization of proliferating human skeletal muscle-derived cells in vitro: Differential modulation of myoblast markers by TGF-β2. J. Cell. Physiol. 196, 70-78 (2003).
- Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11, 231-238 (1990).
- Clarke, C., Davies, S. Ch. 2. Methods in Molecular Medicine. Metastasis Research Protocols. Brooks, S. A., Schumacher, U. 58, Humana Press. 17-23 (2001).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
- Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).
- Agley, C. C., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. An Image Analysis Method for the Precise Selection and Quantitation of Fluorescently Labeled Cellular Constituents: Application to the Measurement of Human Muscle Cells in Culture. J. Histochem. Cytochem. 60, 428-438 (2012).
- Danoviz, M., Yablonka-Reuveni, Z. Ch. 2. Methods in Molecular Biology. Myogenesis. DiMario, J. X. 798, Humana Press. New York, NY. 21-52 (2012).
- Bergström, J. Muscle electrolytes in man. Determined by neutron activation analysis on needle biopsy specimens. A study on normal subjects, kidney patients, and patients with chronic diarrhoea. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 14, 7-100 (1962).
- Chazaud, B., et al. Satellite cells attract monocytes and use macrophages as a support to escape apoptosis and enhance muscle growth. The Journal of Cell Biology. 163, 1133-1143 (2003).
- Abou-Khalil, R., et al. Autocrine and Paracrine Angiopoietin 1/Tie-2 Signaling Promotes Muscle Satellite Cell Self-Renewal. Cell Stem Cell. 5, 298-309 (2009).
- Timpl, R., Kvonder Mark, Role of laminin and fibronectin in selecting myogenic versus fibrogenic cells from skeletal muscle cells in. 117, 628-635 (1986).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. Fluorescence microscopy. Nat Meth. 2, 910-919 (2005).
- Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem. Cell Biol. 116, 63-68 (2001).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166, 11-15 (2004).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: Focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
- Johnson, J. Not seeing is not believing: improving the visibility of your fluorescence images. Mol. Biol. Cell. 23, 754-757 (2012).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
- Pawley, J. The 39 steps: A cautionary tale of quantitative 3-D fluorescence microscopy. Biotechniques. 28, 884-887 (2000).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
- Brown, C. M. Fluorescence microscopy - avoiding the pitfalls. J. Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).
- Bareja, A., et al. Human and Mouse Skeletal Muscle Stem Cells: Convergent and Divergent Mechanisms of Myogenesis. PLoS ONE. 9, e90398 (2014).
- Castiglioni, A., et al. Isolation of Progenitors that Exhibit Myogenic/Osteogenic Bipotency In by Fluorescence-Activated Cell Sorting from Human Fetal Muscle. Stem Cell Reports. 2, 560 (2014).
- Fukada, S. -i, et al. CD90-positive cells, an additional cell population, produce laminin α2 upon transplantation to dy3k/dy3k mice. Exp. Cell Res. 314, 193-203 (2008).
- Stickland, N. Muscle development in the human fetus as exemplified by m. sartorius: a quantitative study. J. Anat. 132, 557-579 (1981).
