Abstract
修理和骨骼肌的再生需要卫星细胞，这是驻地肌肉干细胞的作用。这些都可以从研究中培养用酶消化人肌肉活检样品和它们的生肌性质进行分离。定量，从酶消化获得的两个主要粘附细胞类型是：（i）卫星细胞（称为生肌细胞或肌细胞前体细胞），初步确定为CD56 +，后来作为CD56 + /结蛋白+细胞和（ii）muscle-成纤维细胞，鉴定为CD56 -和TE-7 +。成纤维细胞增殖非常有效地在文化和混合细胞群，这些细胞可能溢出肌细胞主导文化。从人的肌肉的不同类型的细胞的分离和纯化由此试图调查中培养两种细胞类型的先天行为时一个重要的考虑因素的方法。在这里，我们DESCRIBE基于使用胶原酶细胞轻柔酶消化排序和分散酶，随后通过磁性活化细胞分选（MACS）的一种系统，其不仅提供了高纯度（> 95％生肌细胞）和良好的产率（〜2.8×10 6±8.87 7天后在体外 ），用于在培养实验×10 5个细胞/ g组织。这种方法是基于孵育混合肌源性细胞群与偶联于抗CD56的抗体的磁性微球珠，然后使细胞虽然磁场。 CD56 +细胞势必微珠保留的，而CD56领域-细胞通过列畅通。从分类处理的任何阶段的细胞悬浮液可以被镀和培养。以下给定的介入，细胞形态，并且表达和蛋白质，包括核转录因子的定位可以通过使用免疫荧光标记用特异性抗体和图像P进行定量rocessing和分析软件包。
Introduction
骨骼肌的修复和再生，需要卫星细胞1，肌原干细胞2,3。的作用在体内位于每肌纤维的肌膜和基底层之间的可逆静止状态存在这些细胞中，但被活化增殖，保险丝和区分肌肉组织被破坏，修复和再生3。卫星细胞可以使用酶消化4年轻人和老年人人体肌肉活检标本及其生肌性能隔离随后可以在研究原代培养5。这种隔离方法的关于细胞群体的产量和纯度的效率取决于所使用的方法，可从样品变化进行采样。从酶消化得到的两个主要贴壁细胞类型的卫星细胞（现称为肌细胞或肌肉前体细胞），初步确定为CD56 + /结蛋白细胞，万亩SCLE衍生的成纤维细胞，鉴定为CD56 -和TE7 +细胞5。的成纤维细胞具有快速的增殖速率和不发生不可逆的生长停滞和终末分化时像肌原细胞的细胞 - 细胞接触;因此，在混合人群，成纤维细胞可能溢出肌细胞主导文化。
成纤维细胞经常被视为刺激肌肉生物学家，然而，现在有在成纤维细胞作为值得研究的在他们自己的权利的越来越大的兴趣，特别是因为它们已被证明在肌肉修复6有一个与肌细胞协同作用。从人的肌肉的不同类型的细胞的分离和纯化由此试图调查中培养两种细胞类型的先天行为时一个重要的考虑因素的方法。荧光激活细胞分选（FACS）是一种方法，通过它的细胞可以被分类为进一步研究和/或计数并分析。 FACS已表明可靠丰富人类肌细胞，但细胞的产量进行后续培养迄今尚未高7。定的体细胞，例如与衰老4相关的卫星细胞来源的肌细胞和非常差的增殖和分化的有限复制潜力，更温和的方法是必需的。单肌纤维的文化提供了一个不太积极的，是指获得鼠卫星细胞在他们sublaminal利基及其文化8,9激活后仍驻留的。然而，这常常是不可能的，从人的肌肉活检材料（因为纤维很少能由肌腱到肌腱获得），这意味着，这种技术可能无法访问到兴趣研究人类肌源性细胞许多研究实验室。另外，单纤维的技术仅提供了非常有限的细胞数。
在这里，我们将介绍基于发电机排序系统利用胶原酶细胞TLE酶消化和分散酶，随后通过两个连续的轮磁激活细胞分选（MACS），它不仅提供了高纯度（> 95％生肌细胞）和产率（〜2.8×10 6±8.87×10 5个细胞/ g组织），用于在培养实验。 CD56被认为是金标准表面标记为人类卫星细胞的原位 10和体外 11的识别和提供用于珠附着了理想表面标记候选。在此方法中CD56抗体缀合的氧化铁和超顺磁珠含有多糖类的通过一个高梯度磁性细胞分离柱放置在强磁场12,13结合到细胞和通过。分离柱充满从而起到集中磁力线走向其表面产生强磁场梯度（〜4tesla）铁磁性钢丝绒或铁球矩阵14。在这些列中，即使稍微磁性的细胞被吸引和吸附到其表面14。未结合（CD56 - ）细胞通过柱子而CD56 +细胞标记与磁微珠被保留，直到去除来自磁场12,15。
从分类处理的任何阶段的细胞悬浮液可以在进一步的实验所需的密度进行电镀。以下给定的介入的细胞成分可使用免疫细胞化学来鉴定，成像用宽视场或共聚焦荧光显微镜和分析定量使用图像分析方法，它允许在任何给定的图像中的所有标记细胞的快速客观测量。在我们的实验室，我们已经用这种双重免疫排序方式依次通过图像分析16表明CD56 -人成纤维细胞转分化容易进入脂肪细胞，而细胞肌卫星产地s为这种脂肪细胞转化5高度耐药。
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Protocol
注：对于在我们的实验室进行的研究所有受试者给他们的书面知情同意参加，所有实验均与英国国民保健服务伦理委员会批准实施（伦敦研究伦理委员会，参考：10 / H0718 / 10），并按照人体组织法和赫尔辛基宣言。
1.初始准备之前，肌肉活检（15分钟）
- 使人体骨骼肌生长培养基。到带刻度的无菌50ml锥形管中加入2.5毫升补充混合物，将10毫升胎牛血清，抗生素（青霉素/链霉素）和谷氨酰胺，以正确的最终浓度（ 表1），然后填充该管至50ml骨骼肌基底媒介。
- 把15ml的所述骨骼肌基础培养基在无菌20毫升锥形管并称重。一旦称重地方该管在冰上。使用此接收人体肌肉样本。
- 在另外20毫升管准备10米升的胶原酶D和分散酶II酶溶液至2毫克的最终浓度/ ml的每个通过在骨骼肌基础培养基中溶解的库存等份这些酶。通过一个0.22微米的过滤器将它传递滤灭菌该溶液。将此无菌酶混合物在培养箱或水浴，在37℃下进行15分钟预热。
注：酶的这种混合物比胰蛋白酶稍微温和的和更好的维持细胞活力17。 - 设置一个培养皿和一对无菌解剖刀的一边。
2.肌肉活检程序（45分钟，1小时）
- 此前招募参与者，获得所有相关的理事机构，委员会和医疗服务提供全面的道德关和程序上的批准（包括相关的疫苗实验者）（ 例如，道德，制度，政府等 ）。
- 创建一个无菌区的周围的腿（ 例如 ，用无菌手术片）的ð彻底清洗周围的活检部位的面积与防腐抗菌剂（氯己定）。
- 通过局部注射2％利多卡因皮下区域覆股的筋膜麻醉建议活检部位对志愿者的腿部外侧肌。
- 使使用通过皮肤和筋膜的无菌外科刀片一〜5mm宽的切口，并用另外的吸力进行BERGSTROM针活检程序18。
- 使用无菌镊子从针内腔取出肌肉，浸入冰基础培养基。运输组织来尽快实验室进行进一步处理，虽然存活肌细胞可以周期24小时或更长时间后可以得到。
- 汇报的主题，清洁和密封切口部位与多个无菌粘性皮肤缝合带和无菌连衣裙搭配外部的防水盖。
3.隔离肌源性前体策LLS（1小时30分钟）
- 删除包含肌肉样品管称重（确保管干与组织擦拭）。减去含有介质和样品从仅含有培养基的管中的管的重量计算的肌肉样品的重量。
- 摇动溶液几次洗的血液的肌肉样品。让肌肉沉淀在室温下搅拌30-60秒。
- 从管中取出介质的大致整个容积，首先使用一个电子移液助剂或吸气器，但保留在管中大约2-3毫升。
- 倒置到无菌培养皿允许剩余流体携带的肌肉样品上的菜的管;使用无菌手术刀提取任何剩余的肌肉fragments.Rotate菜调动剩余的液体并用pipette.Remove删除任何可见部分脂肪和结缔组织。
- 对于活检重100-400毫克，加3毫升的温酶溶液，并使用无菌解剖刀切开肌肉样品成非常小的碎片（<1-2毫米3）。
- 使用宽孔25毫升吸管吸取了肌肉片段和酶液，并转移到一个10ml无菌锥形管中。与另外的3-5毫升胶原酶和分散酶的酶溶液，并用小10毫升吸管收集任何残留肌肉片段并将其放置在所述管的洗涤培养皿。确切的量不是关键的。
- 放置在37℃培养箱（或水浴）的小瓶60分钟与研磨（10毫升吸管），每15分钟。
- 1小时后，通过加入新鲜预热的生长培养基等体积的终止酶促解离，并通过细胞悬浮液通过100微米的过滤器，以去除任何大的肌纤维碎屑。离心在657×g离心过滤的细胞溶液6分钟，在室温（20-25℃）。
- 重悬在5-7毫升的生长培养基和板的细胞沉淀在未涂布的T-25组织培养瓶。该板转移到孵化器在37℃，5％CO 2的7天。改变介质每48小时。在这个阶段生肌细胞是非常小的和圆形的，并难以从非肌细胞辨别。
- 在第一介质的变化，离心上清以沉淀任何非贴壁细胞。在新鲜的培养基中，并重新盘重新暂停这些。
- 7天之后，在文化，以确保大部分生肌（和成纤维细胞）的细胞都附着但这些细胞尚未达到汇合。净化生肌前体，并根据最初由GHERARDI和Chazaud 19,20的实验室开发，并进一步由我们5修改的协议进行MACS。
细胞基于CD56表达4.免疫磁珠分选（1.5小时）
- 7天之后冲洗该细胞单层（其通常将包含50-60％的肌原细胞5）与三通室温磷酸盐缓冲液（PBS），以从隔离除去任何剩余的非贴壁细胞和碎片。
- Trypinize细胞（0.04％胰蛋白酶中的Ca 2+ -free PBS中与0.73毫摩尔EDTA）处理3分钟。一旦细胞脱离，加入5-10毫升骨骼肌生长培养基，以防止过度消化。通过离心在用于计数完全培养基的适当体积沉淀细胞在657×g离心6分钟，在室温（20-25℃）重悬。
- 计数细胞悬液用所需方法的小样本（ 例如，使用血细胞计数器或自动计数装置），并计算起始细胞数量和存活力。
- 板的几个孔中用于免疫细胞化学在96孔平板（如果需要或更大船只）或前分拣流人口流式细胞基于表征（成纤维细胞和肌细胞将存在的最丰富的细胞类型）。
- 向细胞悬浮液中的广告D 15-毫升无菌PBS中稀释的细胞和介质。离心再次将细胞重悬在他们170微升室温排序缓冲器（在MACS漂洗溶液的1％BSA，经由穿过0.22微米过滤灭菌）。
- 添加35微升偶联于CD56一抗（克隆AF12-7H3，130-050-401）进入细胞的溶液充分混合磁性微珠，吸管混合和离开孵育15分钟，在4℃下温和搅拌的中途站。
- 孵育后，稀释，用10ml MACS分选缓冲液和离心机在657×g离心6分钟的细胞和珠溶液。重悬在1ml排序缓冲器的细胞。
- 添加的MAC分隔符（磁铁）持有立场MACS。加入磁铁支架时，因强磁场照顾。槽在柱和合适的预分离过滤器。吸管1毫升通过预分离滤波器和列的润滑排序缓冲器。
- Immediat伊利在此之后，轻轻混合细胞悬液，并通过预分离过滤器而进入塔滴落整个1毫升。
- 用1ml分拣缓冲液（或500微升）洗柱三次。收集非保留细胞通过在第一排序列中的无菌50ml锥形管中含有少量生长培养基通过。这些细胞是第一个排序CD56 -部分，将高浓缩铀结缔组织的成纤维细胞。不要让列干燥洗涤之间。
- 后洗除去预分离过滤器和加入2.5毫升MACS缓冲到柱上。然后立即删除从磁体列和通过按压柱塞进入塔的顶部收集第一排序CD56 +级分在一个单独的50ml锥形管中。
注：柱塞配合非常紧密到塔的顶部，并可以是，操作相当棘手;然而，这是一定要做而列仍然˚F缓冲ULL，所以速度是必需的。避免按下柱塞太硬和快速。 - 之前电镀评估使用的细胞的生存力，例如台盼蓝测定法。确定活细胞的来自8×1毫米2计数字段的百分比（血细胞计数仪的两个腔室）。
注：细胞可以是单面或双面的排序条件取决于所需的纯度。如果做仔细这些细胞耐受的双重分选过程非常好，存活率非常高> 95％。对于双排序，建立了另一列，润滑用1毫升缓冲分拣并从步骤4.6。- 如果成像是要执行，板单元直接向位于24孔培养皿21及涂覆有你选择的ECM分子的细胞附着（ 如胶原或层粘连蛋白）的玻璃盖玻片上。这里，可以使用0.1〜0.5毫克/毫升的胶原-I（ 见表3）。
5.排序坎一肌成纤维细胞立即隔离后。
- 向分离后立即净化成纤维细胞的祖细胞，采用的协议如上述并作以下修改：
- 之后立即隔离悬浮细胞在完全培养基中，并过滤一次虽然100微米的细胞过滤网，然后再次虽然40μm的过滤器。加入5毫升的PBS和自旋的在657×g离心6分钟。
- 将细胞重悬于MACS分选缓冲液并培育在抗人成纤维细胞微珠在室温下15-30分钟。
- 使用LS柱和南部- MACS分离器（ 表3），并安装为40μm预分离过滤器。
- 执行一个或两个种类取决于所需的纯度，尽快转移细胞到含血清的培养基中，执行一计数和积垢在所希望的密度
6.免疫细胞化学染色（1天，过夜）。
- 确定细胞在它们的孔中通过加入8％的多聚甲醛在冰冷的PBS等体积10分钟并轻轻搅拌。 10分钟后吸出固定液，用PBS洗两次。
- 免疫染色细胞表面抗原，细胞块为至少1小时，以1％的牛血清白蛋白（BSA）的PBS，然后探测与有关第一抗体（ 表4）。
- 对于细胞内抗原，固定后通透细胞，通过加入0.2％的Triton-X 100的PBS，用1％BSA和NaN 3的（0.01％）为10分钟，然后方框孵育与初级抗体。完成摇摆平台上的所有初级抗体孵育过夜，在室温（或在4℃）温和搅拌。
- 除去未结合的第一抗体和用冷PBS洗涤细胞三次。孵育在室温下孵育1小时以种特异性荧光标记的二抗（ 表4）。
- 拆除后未结合的二抗，漂洗细胞与三通的PBS，然后染液用荧光DNA染料赫斯特33342（1微克/毫升）处理10分钟，溶液在摇摆平台上。
- 对于这两种细胞表面抗原和细胞内抗原的同时可视化，探针的细胞先与初级抗体与细胞表面抗原，随后通过适当的二级抗体。接下来，重新修复的细胞在寒冷的PFA，通透，块和孵化与对细胞质或核抗原后其相应的二级抗体的主要抗体。
- 染色后，删除使用弯钳从他们的井盖玻片和冲洗用蒸馏水盖玻片的背面。铺设盖玻片细胞滑下上一滴抗褪色封固剂22集在玻璃显微镜载玻片。
联合与细胞免疫荧光染色7.油红O染色（2小时）
- 揭示5,23 -细胞的脂质含量通过与油红O（（4-（Xylylazo）二甲苯基]偶氮）-2-萘酚1）染色铺板于24孔皿。第一（V W /）油红O通过在60毫升99％的三乙基磷酸和40毫升蒸馏水中溶解500mg的油红O的制备0.5％的储备溶液。维持该溶液在室温下在黑暗中直到使用。
- 上使用的当天，让36％（重量/体积）三乙基磷酸酯工作溶液，含有12毫升油红O贮存液和8ml蒸馏水。过滤通过滤纸号42该溶液以除去所有的结晶油红O（这损害图像质量）。
- 轻轻暖水浴中本工作溶液1小时后，该溶液进行纺丝，在1200×g离心6分钟。除去上清液，并通过滤纸（编号42）和转印再次过滤至新的20毫升管。
- 经过细胞已被固定，透化和免疫染色，除去PBS，加入500微升油红O /三乙酯，磷酸的phate溶液至孔60分钟。的Triton-X，在此处使用的细胞膜通透的浓度不影响细胞的脂质含量23。
注意：油红O是由间540和580纳米，因此德克萨斯红滤波器波长激发可用于检测在荧光显微镜23的油红O排放。需要注意的是，从油红O的荧光发射可以偶尔漏入远红色通道，如果细胞被强烈染色（ 即 ，非常高脂肪含量）。 - 培养结束后，去除多余的油红O和冲洗细胞五次500微升PBS。如第6双方明/相衬显微镜或使用德州红过滤器荧光显微镜检测油红染料描述安装盖玻片作为免疫（无移位，EX BP四十零分之五百六十○，BS FT 585，EM BP 630 / 75，卡尔蔡司）。
8.获得来自荧光显微镜的显微照片的后续alysis
注：确保滑动以进行定量比较染色用相同的解决方案，在拍摄的相同的条件（ 例如，曝光，照相机和采集设置等 ），并在同一会话显微镜捕获。所有收购后的格式也应该是相同的，是严格按照建议的指导方针数字图像24。
- 对于图像采集（广角镜），打开显微镜和荧光光源及离开时间的推荐量，使荧光光源预热并稳定下来。
- 通过阻断光路向照相机设置暗电流为摄像机;在获得最大分辨率的图像，并用它来纠正随后获得的图像。
- 通过荧光用液体光导（氟塑料的柔性管充满苯甲基硅油）一个交付照亮免疫探头次通过红色可视信号（滤波器组45 HQ德克萨斯红移自由，绿（滤波器设置免费44 FITC特殊移）和蓝（滤波器设置49的DAPI移免费）的带通滤波器上的倒置落射荧光显微镜（10X，20X， 40X，计划复消色差目标0.25，0.75，0.95的数值孔径分别）。
- 为了避免像素饱和度查找探测器对每个荧光标记物的线性范围内使用图像采集软件的“过度曝光”功能的最佳曝光。记下曝光标准化每个荧光标记的。
- 捕获单个通道并保存灰度或伪彩色TIFF（标记图像文件格式）中的最高比特深度的图像文件（优选16位- 65,536灰度值）由记录设备提供的（ 例如冷却CCD（电荷耦合器件）装配到显微镜） 。设置图像分辨率为1,388 X 1,040或更高。一定要包括已知迪的比例尺或对象mensions在图像中。
- 如果可能保存为jpeg格式，16位标记图像文件格式（.tiff格式）文件，而不是防止信息丢失25。
- 如果有超过照度（软件与显微镜捆绑可具有自动校正这一点）的均匀性的任何问题采取盖玻片的'平场“图像没有细胞染色，但与安装在相同的方式试验幻灯片;这可以被用来校正照射缺陷的采集后图像分析软件。
- 对于图像采集（共聚焦显微镜），优化器增益和激光功率为每个成像实验（避免饱和）。在一般情况下，测得的荧光正比于激光功率电平。设置针孔大小为'1通风'，以达到最佳信噪比（改善分辨率可能在0.5通风为特别强的信号来实现）。通过蚂蚁采取在不同层面沿z轴的光学部分ibody标记的细胞并保存一个16位的最大突起每个通道用于图像分析。
将荧光9.执行测量标记使用图像处理和分析软件（每视野5分钟）核转录因子。
- 访问个人TIFF图像文件和相应的覆盖渠道通过单击并拖动一个图像到另一个。每个通道都将出现在图层面板中一个单独的层。
- 在滤镜菜单中选择减仓，使层下应同时显示。可替代地，调整顶部的层的不透明度为50％。
NOTE：TIFF图像可以保存在“无损”的Lempel-谢夫 - 韦尔奇（LZW）数据压缩，以降低文件大小不丢失信息。 - 在分析窗口（分析>选择数据点>自定义），选择分析，然后选择所需的测量（ 例如，集成密度，平均DENSITY，圆，柱状图等）。取消选中旁边的复选框他们放弃任何不必要的测量。如果面积测量需要在微米点击分析>设置测量量表。统治者的工具会自动出现 - 跟踪比例尺的长度和微米输入它的已知长度。该软件将转换面积测量成平方微米。
注：如果选择了直方图分析，测量时记录的附加文件夹将显示与8位的直方图为每个单独的选择区域中的显微照片，以及所有个体的选择的总和（其中可以选择的位置）（此如果始终选择了多项表现为直方图-1）。这个分析不能由以16位格式的软件来执行，但是检验的像素强度的分布在整个感兴趣的对象非常有用的。 - 核荧光强度的分析首先构造一个representative“色彩范围选择面膜”（CRSM）为赫斯特或DAPI染色的DNA，以确定核区。一旦所期望的信道的图像重叠，仅Hoechst的沟道层应留在视图通过确保'眼睛图标'在层片邻接它被选中，然后层被突出显示（变为蓝色），而所有其他层应取消。确保混合下拉重新设置为“正常”，在图层选项卡。
- 打开颜色范围对话框（选择>色彩范围），然后将选择选项下拉菜单“取样颜色”。与选择预览设置为“快速蒙版”（红色背景）按住（“+”符号出现）Shift键并单击使用出现的滴管工具细胞核内选择所有的细胞核内的蓝色色调。
- 如果不需要的色调选择，按Alt键（'─'sign出现），然后单击删除在他们身上。保持模糊规模为零，使得只有手动选择的色调都包括在测量和“本地化颜色簇”应该任其发展。
- 保存此CRSM到计算机的硬盘作为一个程序的具体提取文件（.AXT文件）。与另一个随机实地核，负载，更新，并保存CRSM（选择，色彩范围，负载）。这样做至少五随机域，以确保核选择有代表性。
- 使用灰度图像的着色版本的创建的掩模的隔离功能，因为人的眼睛能够比不同的灰色阴影26之间的颜色深浅不同的区分。
- 使用核CRSM分割核区进行染色。一旦核已被选定点击图像>调整>阈值，并一路将滑块移动到右侧，使得核变黑。或者，点击右键，选择“填充”，然后选择“填充到：黑”。然后点击选择>逆，现在按Delete键删除所有背景（如果选项出现选择“填写为：白”）。这实质上是二值化的基础上选择的图像。然后从过滤器选项卡中加载的分水岭插件分离重叠的细胞核（滤镜>二进制图像>流域功能分离）。
- 如果许多晶核都严重重叠，通过取消他们的分析取出细胞核（按住Alt键和周围松散绘制套索工具）。
- 在现在的二进制核层，去选择>色彩范围和>阴影，以选择单个核。在任何一个黑色的核替代按住Shift键并单击。所有细胞核会立即被选中。那么这个选择转移到含有核转录因子染色层（如肌细胞），通过选择层和取消所有其它层。行进线现在将显示细胞核中肌细胞生成素的信道的位置。
- 如果用伪彩色图像时只点击通道面板（该层标签的右侧），只选择了绿色通道（现图像将显示为灰色）。然后点击图像>模式>灰度。会出现“拼合可见图层并丢弃隐藏图层”点击OK警告，然后又警告将再说OK“放弃其他渠道”的点击。灰度选定原子核只有单层现在将存在于层调色板。
- 点击测量日志记录测量，以获得所选择的核数据。如果要分析的层（ 如肌细胞染色）已经是一个原始的16位灰度图像，然后只需按下记录测量。
- 导出所选测量为TXT文件到您选择的位置。这些然后可以进一步处理和在其它数据处理软件P分析ackages
注：编辑>倒退命令（记者全Alt键，Ctrl键和Z键的同时）将恢复以前的所有层，如果需要的。 - 校正非特异性背景荧光27的结果是定量的和可比较的荧光强度的测量是始终信号和背景的混合物。
- 选择方选择工具，并检查“固定尺寸”选择20乘20像素（或更大如果需要的话，并根据细胞的图像中的汇合）。在保持变速选择传遍视场10或更多的背景区域。在测量记录按“记录测量”。
- 计算平均集成密度（所有像素的灰度值的总和）占所有10个选定的背景区域的像素（给定为“平均灰度值'中的测量日志）。通过在目标对象中的像素的数目乘以每个像素的平均背景密度（
- 从物体原始集成密度减去背景荧光，以产生最后的背景校正的值。这种方法占势场中的非特异性背景荧光场的变化。
注：这是最重要的选择只有真正背景区域，因为这修正对最终值相当大的影响。放大用放大镜进行选择时，建议。- 它也可能是有用的除以核的区域中的像素的一般背景校正后的值（同服用每核平均灰度级/亮度），以尽量减少核局部背景信号，将到集成密度贡献更多的任何潜在的影响值随着核大小（ 图3C）。
- 从物体原始集成密度减去背景荧光，以产生最后的背景校正的值。这种方法占势场中的非特异性背景荧光场的变化。
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Representative Results
纯化的肌细胞和成纤维细胞可在脂肪形成分化培养基中培养三天之后，从7-30之间的任何地方天成脂营养介质，以评估其潜力脂肪生成。使用纯化的细胞群，在与免疫染色对脂肪形成和生肌谱系标记物组合的油红O染色显示，只有在成纤维细胞级分是能够分化成脂肪细胞（ 图2）的。脂肪由成纤维细胞的大量积累可见肉眼（A组），其完整的转分化显示核PPARγ（ 图2板B＆C和图3）的很强的表现。 15天的治疗，这些细胞释放任何剩余的TE-7（结缔组织抗原）到他们的基板（面板D）。相比之下，肌细胞保持其正常的表型，包括结蛋白和肌球蛋白重表达链（ 图2板E＆F），不上调PPARγ核（ 图3C）。
肌细胞（结蛋白+）的场的量化分析的一个例子示于图3。图B显示的字段进行分析，并面板A显示了量化荧光强度（背景校正后）。这种方法明显地示出了在各个核肌细胞生成素的表达，在该特定的接种密度和时间点的变化。 图3C展示了直接在小区由细胞水平进行比较的转录因子的水平在不同的细胞类型的方法的效用。在这里，我们表明，CD56 -肌成纤维细胞表达的成脂转录因子PPARγ的高水平，而排序CD56 +肌细胞保持仅暴露于脂肪细胞诱导培养基后非常低的水平。
图1：通过免疫磁珠分选得到的成肌细胞和成纤维细胞的纯化种群（AB）中培养一周后排序肌细胞表达的细胞表面的细胞粘附分子CD56（N-CAM）和特定肌肉中间丝结蛋白。核Ki-67的表达提供的证据表明，这些细胞增殖。膜，细胞质和核组分的染色协议步骤6.5中描述。（CD）的肌原细胞不表达的成纤维细胞标记物的TE-7。来自人肌源性（E）的成纤维细胞表达的TE-7和（F）的跨膜血小板衍生生长因子受体α（PDGFRα）。比例尺为：（A）= 20微米;（B，C＆E）= 200微米;（D＆F）50＃181;米请点击此处查看该图的放大版本。
图2：人类肌源性CD56 - / TE-7 +成纤维细胞和CD56 + / +结蛋白肌细胞的脂肪细胞诱导培养基（AIM）培养。 （A）的成纤维细胞分离MACS分化成脂肪细胞时在脂肪细胞诱导培养基（AIM）和该培养可以通过肉眼以下油红O染色很容易看到。肌细胞没有证据显示成脂分化的时间在AIM同一时期后表现得非常有限，油红O染色。（B＆C）H乌曼肌成纤维细胞高表达PPARγ和CEBPα（未显示）培养后在AIM（C）由于成纤维细胞分化成脂肪细胞会释放剩余的细胞内蛋白质的细胞外基质形成密集的网络周围。（E）成肌细胞保持其生肌形态和谱系标记物，如结蛋白和（F）的肌球蛋白重链（MHC），终端肌分化的标志物的表达，并且不积累脂质。比例尺为：（B，D）= 200微米（E，F）= 100微米;（C）= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：获得的样本数据FR OM immunolabelled使用上述图像分析方法（Adobe公司的Photoshop扩展的方法）的文化。 （A）细胞通过细胞荧光强度积为24小时，在无血清分化培养基后的肌肉特异性核转录因子肌细胞生成素。（B）的结蛋白+ /肌细胞生成素+人生肌前体的代表性显微照片。比例尺分别是：（B）= 50微米的距离来分类CD56 + /结蛋白+生肌群体（CD56 +）和CD56个别核（C）的 PPARγ荧光强度- / TE-7 + /PDGFRα+ /胶原VI +细胞（CD56。 - ）培养脂肪细胞诱导培养基后15天。荧光值标准化为核面积占变化在两种细胞类型之间的核尺寸。在（A）及（B）水平黑条显示的平均值。52049 / 52049fig3large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
| 培养基成分 | 浓度 | 目录没有。 | 商业来源 |
| 人体骨骼肌肉的生长介质： | C-23060（自带“准备使用”包含列出的所有因素） | ||
| 骨骼肌基础培养基 | - | PromoCell | |
| 胎牛血清 | 15％ | PromoCell（5％）及FCS的金色，PAA实验室（10％） - 猫没有。 A15-151 | |
| 胎球蛋白（牛） | 50微克/毫升 | PromoCell | |
| 表皮生长因子 | 10ng / ml的 | PromoCell | |
| 碱性成纤维细胞生长因子（重组人） | 1ng / ml的 | PromoCell | |
| 地塞米松 | 0.4微克/毫升 | PromoCell | |
| 胰岛素（重组人） | 10微克/毫升 | PromoCell | |
| 青霉素 | 100 U / ml的 | 适马 | |
| 链霉素 | 100微克/毫升 | 适马 | |
| L-谷氨酰胺 | 292微克/毫升 | 适马 | |
| 生肌分化培养基 | C-23260 | ||
| 骨骼肌基础培养基 | - | PromoCell | |
| 青霉素 | 100 U / ml的 | 适马 | |
| 链霉素 | 100微克/毫升</ TD> | 适马 | |
| 注：PromoCell，德国海德堡; Sigma-Aldrich公司有限公司，赛特，英国 | |||
表1：细胞培养的培养基成分和浓度。
| 培养基成分 | 浓度 | 目录没有。 | 公司 |
| 前脂肪细胞生长培养基 | C-27410（即用型） | ||
| 胎牛血清 | 0.05毫升/毫升 | PromoCell | |
| 内皮细胞生长补充 | 0.004毫升/毫升 | PromoCell | |
| 表皮生长因子（重组人） | 10ng / ml的 | PromoCell | |
| 青霉素 | 100 U / ml的 | 适马 | |
| 链霉素 | 100微克/毫升 | 适马 | |
| 谷氨酰胺 | 292微克/毫升 | 适马 | |
| D-生物素 | 8.0微克/毫升 | PromoCell | |
| 胰岛素（重组人） | 0.5微克/毫升 | PromoCell | |
| 地塞米松 | 400毫微克/毫升 | PromoCell | |
| IBMX | 44微克/毫升 | PromoCell | |
| 左旋甲状腺素 | 9毫微克/毫升 | PromoCell | |
| 环格列酮 | 3微克/毫升 | PromoCell | |
| 青霉素 | 100 U / ml的 | 适马 | |
| 链球菌霉素 | 100微克/毫升 | 适马 | |
| 谷氨酰胺 | 292微克/毫升 | 适马 | |
| 前脂肪细胞分化培养基 | C-27436（即用型） | ||
| D-生物素 | 8.0微克/毫升 | PromoCell | |
| 胰岛素（重组人） | 0.5微克/毫升 | PromoCell | |
| 地塞米松 | 400毫微克/毫升 | PromoCell | |
| IBMX | 44微克/毫升 | PromoCell | |
| 左旋甲状腺素 | 9毫微克/毫升 | PromoCell | |
| 环格列酮 | 3微克/毫升 | PromoCell | |
| 青霉素 | 100 U / ml的 | 适马 | |
| Streptomycin | 100微克/毫升 | 适马 | |
| 谷氨酰胺 | 292微克/毫升 | 适马 | |
| 脂肪细胞营养中等 | C-27438（即用型） | ||
| D-生物素 | 8.0微克/毫升 | PromoCell | |
| 胰岛素（重组人） | 0.5微克/毫升 | PromoCell | |
| 地塞米松 | 400毫微克/毫升 | PromoCell | |
| 青霉素 | 100 U / ml的 | 适马 | |
| 链霉素 | 100微克/毫升 | 适马 | |
| 谷氨酰胺 | 292微克/毫升 | 适马 | |
| 注：PromoCell，德国海德堡; Sigma-Aldrich公司有限公司，赛特，英国 | |||
表2：脂肪形成细胞培养基的组成。
| 设备/试剂名称 | 公司 | 目录没有。 | 评论/说明 |
| 细胞培养 | 胶原酶ð | 罗氏 | 11088866001 |
| 分散酶II | 适马 | D4693-1G | 使用前必须过滤消毒 |
| 胰蛋白酶/ EDTA | （Gibco）中Invitrogen公司 | 15400-054 | |
| 100微米的细胞过滤 | BD生物科学 | 352360 | |
| 胶原溶液（3毫克/毫升在0.1％乙酸）精制 | 西格玛，赛特，英国 | C8919 | |
| Minisart SRP15注射器过滤器（0.2微米） | 赛多利斯 | 17573ACK | 聚四氟乙烯（PTFE）膜 |
| CD56人微珠 | 美天旎生物技术 | 130-050-401 | 磁激活细胞分选（MACS） 注意微珠的有限的货架寿命 |
| 抗成纤维细胞微珠，人 | 美天旎生物技术 | 130-050-601 | |
| 40微米预分离过滤器 | 美天旎生物技术 | 130-041-407 | |
| 大细胞Collumns | 美天旎生物技术 | 130-042-202 | 这些列配有流电阻。使用流电阻不需要获得此处所描述的高纯度生肌。 |
| LS列 | 美天旎生物技术 | 130-042-401 | |
| 应用MiniMACS分离器 | 美天旎生物技术 | 130-042-102 | 该隔板适合的大单元列，但尚未对LS柱。 |
| MidiMACS | 美天旎生物技术 | 130-042-302 | |
| MACS multistand | 美天旎生物技术 | 130-042-303 | |
| BSA | 适马 | 使用前必须过滤消毒 | |
| 油红O | 适马 | O0625 | 脂质染色 |
| 磷酸三乙酯 | 适马 | 538728 | |
| Whatman滤纸 | 适马 | Z241121-1PAK | 第42号，无灰。以制备过滤器折叠圆形滤纸作半圈，然后再折半圆成两半，以形成一个圆锥形状。适合锥体成漏斗进行过滤。 |
| 安装 | |||
| 延长黄金抗淬灭剂 | 分子探针，Invitrogen公司 | P36930 | 这可以使用或不DAPI可购买的，并且不淬初始荧光。 |
| 的AxioVision | 卡尔蔡司 | 联系蔡司 | 图像AQUISITION软件 |
| Adobe公司的Photoshop CS5扩展 | 土坯（购自普格计算机） | ADPH16982 * | 图像分析软件 |
表3：设备和试剂。
| 名称/抗原 | 抗体种类和同型 | 克隆名称 | 稀释使用 | 目录没有。 | |
| 生肌标记： | |||||
| CD56（N-CAM） | 鼠标MC抗体1 | MY-31 | （1：100） | 347740 | BD |
| 结蛋白 | 兔MC抗体1 | D93F5（XP） | （1：250） | 5332S | NEB |
| 肌细胞生成素 | 鼠标MC抗体1 | F5D | （1:50） | F5D | DSHB |
| 肌球蛋白重链 | 鼠标MC的IgG2b，κ轻链 | MF20 | （1：200） | MF20 | DSHB |
| 成纤维细胞/结缔组织 | |||||
| TIssue标记： | |||||
| 抗人成纤维细胞 | 鼠标MC抗体1 | TE-7 | （1：100） | CBL271 | 密理博 |
| PDGFRα | 兔MC抗体 | D13C6 | （1：500） | 5241 | NEB |
| 增殖标记： | |||||
| Ki67的 | 兔MC抗体 | SP6 | （1：200） | MP-325-CRM1 | MD |
| 成脂 | |||||
| 转录因子： | |||||
| PPARγ | 鼠标MC抗体1 | E8 | （1:20） | SC-7273 | Santa Cruz公司 |
| 关键：MC：单克隆，PC：多克隆，DSHB：发育研究杂交瘤细胞银行，美国爱荷华州; | |||||
| NEB：新英格兰生物实验室，UK; MD：A. MENARINI诊断，UK; BD：BD生物科学，UK。 | |||||
表4：一级抗体。
| 抗原 | 抗体种类和同型 | 稀释 | 目录没有。 | 公司 |
| Alexafluor488 | 山羊抗小鼠IgG（H + L）的 | 1：1000 | A-11001 | MP |
| Alexafluor 594 | 山羊抗小鼠IgG（H + L）的 | 1：1000 | A-11005 | MP |
| Alexafluor 594 | 山羊抗兔IgG（H + L） | 1：1000 | A-11012 | MP | </ TR>
| 键：H + L =重链和轻链; MP：分子探针，Invitrogen公司Life Technologies公司，英国佩斯利 | ||||
表5：二次抗体。
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Discussion
我们已经描述了immunomagentic分拣过程对人类肌源性前体从肌肉活检材料小样本的选择性富集。这种技术是非常宝贵的在我们的实验室克服人类肌源性文化的流失，成纤维细胞，同时也为了解肌源性祖细胞不同群体的独特的行为。一旦纯化的生肌细胞可以追究变化的蛋白质和/或基因表达，或者用于下行实验。
除了细胞纯化，我们也详细了快速而直接的荧光显微镜分析的显微照片感兴趣的特定区域的方法。从荧光显微镜数字图像包含了丰富的信息细胞生物学家提取;的确像素持有的数据不一定可辨别人眼。利用这种技术的定量数据可在约大量获得单个细胞的人口。图像分析时相比流式细胞一个独特的特点是，以改变蛋白质表达的变化的细胞形状orcell - 细胞相互作用相关的能力。此外，有能力创建并保存了优化，代表的选择口罩可以快速，准确，重复性测量整个视许多领域，从而减少了对用户的偏见的可能性作出。
MACS型细胞纯化
这种方法的一个好处是，细胞可以立即在分离后或在培养数天（当产率会更高）可以成功地纯化。
至关重要的是，肌细胞不应该被允许到前排序，因为这阻碍了它们穿过柱变得汇合，并会减少用于进一步扩展和实验获得的增殖性细胞的比例。
吨“>根据所得到的初始组织样品，可能有大量的在培养在这个阶段非粘附红细胞。方法存在以选择性裂解红细胞，但是，以避免任何不必要的化学应力的肌源性细胞本步骤是可以避免的。我们没有观察到对人体肌肉衍生的细胞的早期培养红细胞的任何显着的负面影响，并且这些红细胞通过媒体改变除去一次生肌细胞附着。可用于细胞，其中所述细胞表面抗原的表达是低的或特别敏感，胰蛋白酶消化细胞脱离之前，为了分选（ 例如 ，其它平缓蛋白酶或EDTA为基础的方法）等方法。 CD56对人肌细胞中的表达是强烈的并且抗短trypsinsation（当与这里描述的抗体测定）。
重要的是，分选缓冲液含有EDTA的抑制，计算的IUM依赖性细胞 - 细胞粘着;这是用于获得（和保持）的单细胞悬浮液用于排序的关键。根据细胞数，形状和大小进行排序，存在要作出关于该分离柱（ 见表3）的选择。
除去磁场来释放保留细胞的列可以是棘手的，以便确保该收集管（即使裙）被放置在位于非常靠近柱，以避免在运输过程中的细胞损失的保持器。
尽管我们已经描述这种技术用于与从骨骼肌人类的原代细胞的使用，该协议可以很容易地适于为哪些特定/独特的细胞表面标记物是已知的其它类型的细胞。其它的优点包括这样的事实，整个过程可在层流室的无菌工作环境下进行。另外，相比于FACS由于低排序MACS程序是温和的细胞剪切力，并且可以是一个特别的优点为更大的细胞。所用的磁珠是小的，无毒的和可生物降解的培养。事实上，MACS已成功地应用于对若干其他细胞类型的纯化和研究。
这种技术的一个限制是，MACS不能容易地为多种标记同时进行。此外，标志物细胞和大小的量，不能在分拣过程中查明，事后才。
考虑优化图像采集和分析
这里展示的图像分析方法提供了一个有力的工具以阐明变化的蛋白质在细胞逐个小区基础细胞的大群体中的表达水平。通过利用层工具和选择口罩的广泛使用的软件包，实验者可以客观地选择不同的荧光信号在多个图像，允许量化的各个特征，并且任何数量的在其中的组件。我们已经成功地使用这种方法来量化和在暴露于生脂挑战不同细胞群体直接比较转录因子表达的范围。
每个荧光通道（表示特定标记物）可以保持独立于其他和开启或根据需要关闭，这是用于多色免疫标记实验是有用的。
有若干因素，必须尝试从荧光显微镜28中提取定量和半定量数据时加以考虑。要作出关注这些将允许基本的半定量测量。研究人员经常要使用一些荧光染料标记的兴趣不同的蛋白质;至关重要的是能够从个人的发射光谱之间进行区分的能力。在大多数情况下，这是通过选择性excitat实现仅一个荧光染料的离子的时间。然而，如果发射和/或激发光谱显著重叠或者不充分过滤，然后放气通过或串音可能损害获得的图像数据的准确性。流血通过是荧光发射的通道中的不适当的检测信道，并且所造成的发射光谱29,30的重叠。
一些需要考虑的要点是：选择具有良好分离的激发和发射光谱的荧光染料，使用非常有选择性的激励波长（如由在共聚焦显微镜激光器实现），以确保发射滤光片套都不够严格排除不想要的波长的光，并进行多色成像最长（ 即 “最红'）的第一波长峰值发射染料占事实吸收光谱通常偏向较短波长（蓝色光），而发射光谱偏向较长沃维勒engths（红灯）。荧光标签的光谱可在“荧光光谱”Invitrogen公司提供的。
使用高品质的目标是为目的地为分析图像的关键。高数值孔径（> 1.3）是最好的，放大倍数应适应到相机中广角镜。在这两个广角和共焦显微镜中，NA是至关重要的，因为Z轴分辨率提高作为数值孔径的一个函数平方29。如果可能的话使用全被修正为球形和色差，29计划，复消色差镜片。使用的液体光导的强烈建议，因为他们通过加扰源照明，以减少时间和空间的连贯性之前，其进入显微镜物镜29降低照度不均匀。
以避免图像的饱和度，如饱和的像素不能正确quantifi是很重要由于在最激烈的灰度级编了信息裁剪值26。
各种“插件”可提供使平场校正程序，以相对容易地进行;例如约翰·C·拉斯博士做了很多，这些免费提供的在线（http://www.drjohnruss.com/download.html）的。使用该插件在实验显微照片的各像素的亮度的比值，以相应的一个参考图像中被计算和替换原始。然后将结果缩放到填满图像的亮度范围。另外，ImageJ的形象计算器是校正照度不均匀的另一种手段。
对于一些图像分析，共焦显微镜可以是选择的方法，因为它防止了焦荧光到达检测器29。然而，这种方法可能需要比广角荧光显微镜基本上更长的时间，限制了麻木呃的观点，即可以在单个会话中可以得到各个领域。
最近的其它方法已经报道了用于从人的肌肉组织肌细胞的富集。 Bareja 31使用MACS耗竭（为：细胞CD11b，CD31，CD34和CD45）的组合后FACS积极选择CXCR4 + / CD56 +肌细胞中。然而，虽然此过程能够产生高度富集的生肌人口，它比这里详述的方法相当冗长，包含有更多的连续的步骤和结果在纯化肌细胞每克组织的下部的下屈服。
在最近的另一项研究中，人类胎儿肌肉通过FACS使用多个标记和Castiglioni兄弟32孤立的肌纤维相关细胞发现，CD34 - / CD56 + / +表达Pax7细胞（原型卫星细胞）可以表现成骨以及生肌血统势的人，但在一般的协议与我们的工作不显示脂肪形成潜力。这些作者还发现，CD34 + / PAX7 -细胞非生肌，但有能力成脂和成骨分化。 CD90表达的CD34 +非生肌馏分（肌成纤维细胞33的标志物）的富集表明，这些细胞的相当大的比例可以具有被成纤维细胞，其已经被证明是脂肪细胞在成人骨骼肌的主要来源培养物（参考图5和图2）。无论是肌成纤维细胞还具有成骨分化潜能值得进一步调查。
不像卡斯蒂格尼32的方法中，我们的方法只需要一种抗体（而不是7）可重复地获得纯的肌原细胞培养物中的产量高，并且可以在层流罩的无菌条件内迅速地进行。进一步methodologica升不同的是，这些作家直接从分离的肌肉分离细胞，然后按照这些文化，而我们最常培养细胞1周前，整理和培养。在我们手中这种方法是通过细胞耐受性更好。重要的是，在培养的总时间是这两种方法之间基本上相等。此外，考虑到胎儿骨骼肌正在进行增生和肥大性肌肉生长34，这并不奇怪，当相比于成年肌肉生肌前体的产率是从胎儿肌肉组织更大
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | Must be filter sterilized before use |
| Trypsin/EDTA | (Gibco) Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 μm cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Sigma, Dorset, UK | C8919 | |
| Minisart SRP15 syringe filter (0.2 μm) | Sartorius | 17573ACK | Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane |
| CD56 human Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-050-401 | Be aware of the limited shelf life of microbeads |
| Anti- fibroblast Microbeads, human | Miltenyi Biotech | 130-050-601 | |
| 40 μm Pre-separation filters | Miltenyi Biotech | 130-041-407 | |
| Large Cell Collumns | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here. |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MiniMacs Seperator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | This separator fits the large cell column but not the LS column. |
| MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| BSA | Sigma | Must be filter sterilized before use | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Triethyl phosphate | Sigma | 538728 | |
| Whatman Paper | Sigma | Z241121-1PAK | No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Molecular Probes, Invitrogen | P36930 | This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence. |
| AxioVision | Carl Zeiss | Contact Zeiss | |
| Adobe Photoshop CS5 Extended | Adobe (purchased from Pugh Computers) | ADPH16982* |
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