Summary
この記事では、合成とナノ粒子（NPS）の蛍光標識するための方法を説明します。 NPは、真核細胞のエンドリソソーム系を標識するために、パルスチェイス実験に適用した。細胞内病原体サルモネラ·エンテリカの活動によって、エンド-リソソームシステムの操作は、ライブセルイメージングが続き、定量化した。
Abstract
望ましい化学的、光学的および機械的特性を有する蛍光ナノ粒子（NPが）、細胞内小器官を標識するための有望なツールである。ここでは、真核細胞のエンド-リソソームシステムにラベルを付け、細胞内病原体サルモネラ·エンテリカによりホスト細胞経路の操作を監視するために金-BSA-ローダミンNPSを使用する方法を紹介します。 NPは容易に後期エンドソーム/リソソームにHeLa細胞によって内在して局在していた。 サルモネラ感染症はSalmonella-誘起膜構造における小胞およびNPの蓄積の再配置を誘導した。我々は、共焦点顕微鏡画像の定量分析のためのIMARISソフトウェアパッケージを展開。非感染細胞内のオブジェクトの数とそれらのサイズ分布は、WT サルモネラによってエンドリソソーム系の非常にリモデリングを示す、 サルモネラ感染細胞におけるものとは異なっていた。
Introduction
金属などのNP、量子ドット、ポリマーのNP、シリカNPは、カーボンドットを含む、蛍光ナノ粒子（NPは）、過去数十年の間、1,2-かなりの注目を集めている。従来の有機染料に比べて、蛍光性NPは、このような強力な信号強度、光退色に対する抵抗性及び生体適合性の高い3,4のような望ましい化学的、光学的および機械的特性を示す。これらの利点は、それらの細胞内のセンシングと生細胞イメージングのための選択の方法にする。さらに、電子密度の高いNPの様々な生細胞の組み合わせは、光学顕微鏡（LM）とEM 5と超微細構造レベルでのより高い分解能でトラッキングすることができ、相関顕微鏡分析のためのそれらの使用を容易にする、電子顕微鏡（EM）から見える。例えば、金NPは、効率的に感受性の診断のための生細胞におけるバイオセンサーとして、ならびに免疫標識6の分野で使用される長い時間であった。最近のStudiesは、異なるサイズおよび形状を有する金NPが容易に大きな電位が細胞内小胞輸送の追跡およびエンドリソソーム系標識7,8を申請しているため、細胞株の大様々な取り込みおよび日常エンドソーム経路を介して輸送され得ることを示す。
そのようなサルモネラ·エンテリカ 、 赤痢菌およびリステリアなどの微生物病原体は、非食宿主細胞9に侵入するために異なるメカニズムを開発しました。内在化された後に、病原体のいずれかのサイトゾルに局在または膜結合区画に隔離は、それらのホスト環境で広範囲に相互作用して、自分の生存10を優先するように、これらを調節する。例えば、 サルモネラ·エンテリカは、細胞内ファゴソーム区画内に存在し、複製し、感染11上にサルモネラ含有液胞（SCV）と呼ばれる。成熟SCVエンドサイトーシス経路で連続的相互作用を受けてゴルジ装置に向かうトラフィック、およびサルモネラ誘発フィラメント（SIF）などの大規模な管状構造の形成を誘導するが、ネキシン細管ソート、 サルモネラ、分泌キャリア膜タンパク質3（SCAMP3）細管など誘発。12-14。これらの細菌性病原体が宿主細胞の経路を操作する方法勉強する感染症を理解するために不可欠です。
ここで、金BSA-ローダミンNPは、宿主細胞のエンドリソソーム系を標識するために流体トレーサーとして使用し、ヒトの胃腸病原体サルモネラ·エンテリカ血清型ネズミチフス菌（ サルモネラ ）と病原体の相互作用を研究するためのモデル菌として使用したエンドサイトーシス経路をホストします。 WT サルモネラまたは突然変異株を感染させた非感染細胞と細胞の細胞内の金BSA-ローダミンNPを、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）で画像化した。その後IMARISソフトウェアはサルモネラ感染がエンドソーム/リソソームの極端な再配列を誘導したことを示す、NPの分布を定量した。この方法の説明に続いて、類似の実験は、内在化NPの長期の運命を追跡し、真核細胞のエンドサイトーシス経路上の様々な外因性物質または内因性因子の影響を調査するために設計することができる。
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Protocol
10nmの金ナノ粒子（ゴールドNPS）15の1の合成
- 溶液Aを準備します160ミリリットルミリQ、または再蒸留水に2ミリリットル1％水溶液塩化金を追加します。
- 溶液Bを準備します32ミリリットルミリQ、または再蒸留水に8ミリリットル、1％のトリクエン酸ナトリウム×2、H 2 Oおよび160μlの1％タンニン酸を追加します。
- 60℃に溶液A及びBをウォームアップし、攪拌しながら、それらを混合する。すぐに濃い青色を観察します。約15分後に赤色を観察します。その後、95℃まで加熱し5分間保持し、RTに溶液を冷却する。
- カーボンコーティングされたグリッド上にNP懸濁液のドロップを追加し、空気中で乾燥させる。透過型電子顕微鏡によってNPの大きさや形態を確認してください。
ローダミンN-ヒドロキシエステル（NHS）とBSAとラベリングゴールドNPの2コーティング16
- 、1.5mlのエッペンドルフチューブに900μlの30分間15000×gで遠心機を金NPSを追加します。オペアンプtionally月一度に複数のチューブを準備します。
- 、900μlのペレットに滅菌ミリQ水を再懸濁し、100μlの2mg / mlのBSA / PBSを追加し、上清を捨て、30分間、800rpmでボルテックスに混ぜる。
- 過剰のBSAを除去するために、60分間15000×gで準備を遠心する。
- 上清を捨て、そして125μlのPBS中の金-BSA NPSを再サスペンド、1M重炭酸塩の12.5μlを添加する。
- 使用直前に、金-BSA NPの懸濁液1ミリリットルするローダミンNHS / DMSO溶液30μlを添加、ローダミンNHS / DMSOの10 mg / mlの溶液を調製。光への暴露を避け、800rpmで混合中に室温で2時間（またはO / N）のための反応をインキュベートします。
- 48時間 - 36の期間にわたって5バッファ変更で4ºCでPBSに対して透析41612-BSA-ローダミンNPSを精製する。
- NPSを安定させるために、各1ミリリットル金-BSA-ローダミンのNPに200 mg / mlのBSA / PBSの10μlを添加する。 15で、無料またはBSA-ローダミンリリース遠心分離機を削除するには、60分間、000×gで。光への暴露を避け、4℃でOD 520、およびストアを測定する、2 mg / mlのBSA / PBSにペレットを再懸濁する。
- 、ミリQまたは二重蒸留水でNPを10倍に希釈炭素被覆グリッド上にドロップを追加し、空気中で乾燥させる。透過型電子顕微鏡（TEM）によるNPのサイズ及び形態を確認する。
NOTE：NPの調製のために使用されるすべての材料は、滅菌した操作は、細胞培養フード内または火炎横ベンチを行った。
ヒーラ細胞の3文化
- 永久LAMP1-GFPを発現するHeLa細胞を、10％ウシ胎児血清（FCS）を含むDMEM中で培養し、5％CO 2を含む雰囲気中で37℃で増殖させている。
- 8ウェルチャンバースライド（Ibidi）においても50,000の密度で細胞を播種し、O / Nインキュベートする。
細菌の4。文化
- 使用サルモネラ·エンテリカ血清型TyphimuriumのNCTC 12023ウィルd軸型（WT）株。比較のために、SIFのキーエフェクターSIFAを欠いSPI2-T3SSとΔSIFAにおける欠損変異株のΔssaVを使用しています。強化されたGFPの構成的発現のためのプラスミドpFPV25.1を保有する菌株を使用してください。
注：細菌株は、50μg/ mlのカルベニシリンおよび/ または50μg/ mlのカナマイシン（ΔssaV、ΔSIFAを追加してルリア-ベルターニの50μg/ mlのカルベニシリン（WT）を添加した培養液（LB）とLB中で日常的に培養され、 ）プラスミドを維持するために必要である。 - 適切な抗生物質で3ミリリットルのLB中の細菌の単一コロニーを接種し、新鮮なLBで1：31に希釈し、3.5時間のために成長を続ける、その後、通気のための条件をとうしながら37ºCでO / Nを育てる。この時点で、培養物を後期対数期に達し、細菌は非常に侵襲的である。 「ローラードラムは「通気試験管培養物をインキュベートするのが便利である。
によるHeLa細胞の感染5。サルモネラとゴールド-BSA-ローダミンNPは、チェース·ラベリングパルス（スキームについては図1を参照）
- 継代培養した細菌のOD 600を測定し、OD 600に希釈= 0.2mlの1 PBS（〜3×10 8 cfu / mlで）、多数のを達成するために、8ウェルチャンバースライド中のHeLa細胞への細菌の適切な量を追加100の感染（MOI）。
- （この時点を0時間感染後、0時間のπとした）の非内在化細菌を除去するためにPBSで3回洗浄し、細胞インキュベーター中で30分間インキュベートする。 100μg/ mlのゲンタマイシンを含有する新鮮な培養液の300μl添加し、1時間維持する。その後、インキュベーション時間の残りのための10μg/ mlのゲンタマイシンを含有する新鮮な培地で培地を交換してください。
- 1時間、100μg/ mlのゲンタマイシンを含有する培地とのインキュベーション後、培地を同時（30mMのHEPES、pH7.4で、FCS、L-グルタミン、フェノールレッド、および炭酸水素ナトリウムなしイーグルMEM）培地を撮像して置換されている10μg/ mlのゲンタマイシンをntaining。金BSA-ローダミンNPはOD 520 = 0.1の最終濃度を得るために、HeLa細胞に添加される。
NOTE：金BSA-ローダミンNPはまた、感染の前に、または種々の時点のπで細胞に添加してもよい - 1時間のインキュベーション後、培地を除去し、PBSで3回洗浄し、インキュベーション時間の残りの10％のFCSおよび10μg/ mlのゲンタマイシンを含有する新鮮な画像形成媒体の300μlを添加する。
注意：インキュベーションの時間は、使用のNPおよび細胞株の濃度に依存して変化し得る。 RAW264.7マクロファージに関しては、十分な内在許可OD 520 = 0.05の濃度のNPとその30分のインキュベーションを観察した。
6.イメージング
- 共焦点レーザー走査（CLSM）またはスピニングディスク共焦点イメージングシステムの異なる時点での高分解能イメージングのための加湿環境チャンバーと（SD）顕微鏡を使用する。
- 温度Cに切り替えontrolシステム、それが安定するまで待ちます。そのような倍率、スキャン速度、分解能、ZスタックなどGFPのために適切な励起/発光の設定を使用し、金-BSA-ローダミンNPのような画像の設定を最適化します。このプロトコルのために、512×512ピクセルの400 Hzのスキャン速度、分解能および0.25μmのZ-ステップサイズを使用。それぞれ、Arレーザ（488 nm）をHeNeレーザー（543 nm）を用いて、GFPと金-BSA-ローダミンエキサイト。セルの形状を観察するための明視野（BF）のチャンネルを含める。他の顕微鏡システムおよび感染条件については、設定に応じて調整されなければならない。
NOTE：BFチャネル信号の光源がフォトマルチプライヤ（PMT）検出器で検出されたのと同じArレーザを使用する。 - 指示された時点のPIでは、顕微鏡ステージと記録画像に感染した細胞を含む8ウェルチャンバースライドをマウントします。
画像の7.分析
- 顕微鏡画像解析ソフトウェアを使用して（参照
注：あるいは、このようなImageJのかFIJIなどのオープンソース·ソフトウェア·パッケージは、定量的画像解析に使用することができる。 - アイコンにビューを突破クリックのオブジェクトツールバーで
新しい表面アイテムを追加します。上をクリック
（次）。 - 関心領域（ROI）を選択し、セグメントROIを分析する。表示エリアには、画像に重ね矩形ボーダー部にROIを表している。対応するX軸、Y軸、Z-フィールドに値を入力するか、直接ROIのサイズと位置を変更するために、プレビューの長方形の矢印をクリックしてください。クリック
= "/ファイル/ ftp_upload / 52058 / 52058icon2.jpg" />（次へ）。
- ソースチャネルとして、セレクトチャンネル3（ゴールド-BSA-ローダミンNPのための信号）。結果の面積の滑らかさを設定するには、円滑なオプションをチェックします。手動で値を定義するか、自動的に生成された値を受け入れます。しきい値の、絶対強度オプションを選択します。
- 閾値調整のために、手動オプションを選択して、値を設定します。視域では、表面閾値プレビューは灰色で表示されている。
- タブ分類表面に得られた表面は、様々な基準によってフィルタリングすることができます。デフォルトのフィルタは「> 10ボクセルの数」、および他のフィルタは、「追加」をクリックして含めることができている。フィルタリングが必要でない場合は、[削除]ボタンをクリックして、すべてのフィルタを削除します。クリック （次）。
- サーフェス作成を完了するには、上をクリック/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg "/>（仕上げ）を。オブジェクトのリストで、現在、アイテム·ボリュームと新しい作成表面について、未チェックボックスが表示領域に表示されます。
- 統計情報をエクスポートします。さて、突破ビューで被験者の色は、その面積に応じて紫から赤に変わる。そして、「プロット番号エリア」テーブルには、統計情報（ 例えば、ID番号とオブジェクトの面積）を示している。クリックでExcelファイルに面1のすべての統計情報をエクスポート
（保存）。
新しい表面アイテムを追加します。上をクリック
（次）。 
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Representative Results
金NPは、クエン酸、タンニン酸による塩化金酸の還元を介して、十分に確立された方法により作製した。 図2Aに示すように、合成された金NPは、約10nmのサイズを有する形状に準球形であった。 BSA-コーティングおよびローダミン標識は、それらの形態や大きさ（ 図2B）に影響しませんでした。
これは、金NPは容易に種々の哺乳動物細胞により取り込まれ、エンドサイトーシスシステム7で終わったことが報告されている。以前の研究によれば、明るい赤色の蛍光シグナルは、細胞によるNPの効果的な内部移行を示す、金BSA-NPはローダミン（ 図3、WT 5時間のπ）で1時間のインキュベーション後にHeLa細胞において観察された。赤の信号のほとんどは、NPのが後期エンドソームまたはリソソーム中に閉じ込められたことを示し、緑のシグナルと共局在が認められた。しかし、後期エンドソーム/リソソームにおけるNPの一様分布とは異なり、非感染細胞（ 図3、モック）で、その場所は、主に、WT サルモネラ感染細胞に再配置された。 （ 図3、WT 5時間のPI）感染の初期段階では、 サルモネラは SCV内複製し、SIFが速い伸縮運動を受ける。別の画分がまだ空い後期エンドソーム/リソソームに位置しながら、この時点で、NPの画分は、SCVおよびSIF中で発見された。 8時間のパイ（ 図3の WT 8時間π）で、SIFの安定化されたネットワークを形成し、そしてごくわずかな部分を自由に後期エンドソーム/リソソームに位置したままでいる間、ほとんどのNPは、管状構造内に蓄積が認められた。変異株ΔssaVとΔSIFAは、異なる挙動を示した。 図3（ΔssaV）に示すように、全くSIF構造が形成されなかったが、8時間のパイで、ΔssaVは SCV内部に閉じ込められた。いくつかのNPは、 サーモンを囲む観察されたSCV内部エラが、NPの大部分は、まだ空き後期エンドソーム/リソソームに位置していた。 ΔSIFA株 （ 図3、ΔSIFA）の場合は、細胞質へのサルモネラの脱出が発生し、NPのと細菌の間に関連は認められなかった。
我々の以前の研究では、感染の初期段階におけるSIFディスプレイ非常に動的な性質が見出された（3から5時間のPI）が、後の期間（> 8時間のパイ）12で安定になる。したがって、我々は、感染の初期および後期段階におけるサルモネラ細胞内NPの分布を再配置に匹敵する能力を持っているかどうかを疑問に思っている。全ての場合において内在化NPのほとんどが中に蓄積が観察された、 - （7時間のπ1）1時間、図4に示すように、金のNPは、O / N感染前または感染後の異なる時点でのHeLa細胞とインキュベートしたSCVまたはSIF。
微視的observ管理ポイントは、宿主細胞のエンドリソソーム系の大規模な再配列でサルモネラ菌の結果により、感染を明らかにした。次のステップとして、定量的にサルモネラ誘導性宿主細胞の表現型を分析するためにIMARISソフトウェアパッケージを使用した。一例として、8時間のπに一つ感染HeLa細胞の画像を用いて、定量分析のためのステップバイステップの命令は、 図5に示されている15の強度閾値および「ボクセル数> 10 'フィルタ、3Dを通じてオブジェクトは、元の画像ファイルから抽出した。オブジェクトはと共に配置の金-BSA-ローダミンNPの細胞内構造であることになっていた。この例では、67のオブジェクトは、1,974.64ミクロン2とを合計面積の合計で抽出した。他人が50μm2よりも小さいながらSIFネットワークと共存最大の目的は、1,836.23ミクロン2の面積を有する。比較のために、一例定量を示す非感染細胞のitative分析結果に与えられた。ここで、431オブジェクトは合計で抽出し、その内の領域の平均値は5μm2であり、最大の目的は、34ミクロン2の面積を有する。オブジェクトの合計された領域は、 図4の感染細胞（1975ミクロン2）に匹敵する2252μm2である。しかし、オブジェクトの数が、サルモネラ誘発管状構造と小胞の大部分が融合を示す（それぞれ、431及び67オブジェクト）他方、よりもはるかに大きい。
生細胞イメージングのために、HeLa細胞を調製するための図1のスキーム。HeLa細胞は、その後、偽感染、チャンバースライドに播種し、30分間、様々なサルモネラ株を感染させ、PBSで3回洗浄したincubat 1時間、100μg/ mlのゲンタマイシンを含有する培地で編その後、培地を含む培地を撮像して置換された実験の残りのためにNPを含まない培地によって1時間インキュベートし、その後、追いかけ10nmの金BSA-NPはローダミン（OD 520 = 0.1）および10μg/ mlのゲンタマイシン、 。ライブセルイメージングは、異なる時点で実施した感染（PI）を投稿してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
（a）の前、（b）の標識した後、金コロイドNPの図2. TEM像。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
宿主細胞エンド-リソソーム細胞内サルモネラによるシステムの図3.改造。HeLa細胞は、偽感染、またはサルモネラWT、ΔssaVまたはΔSIFA変異株と10 nmのパルス/チェイス金-BSA-ローダミンNPを（に感染していたOD 520 = 0.1） は 、 図1で説明したように行った。CLSMのZ-スタックの最大強度投影が示されている。スケールバーは10μm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
サルモネラ感染症のさまざまな段階でのエンド-リソソームシステムの図4.アクセシビリティ。HeLa細胞示されるように、細胞を、種々の時点のπで10nmの金BSA-NPはローダミン（OD 520 = 0.1）O / Nの前感染、または1時間パルスした。 CLSMは、Zスタックの最大強度投影が示されている9時間のパイ - 生細胞イメージングを8で行った。スケールバーは10μm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
例として8時間のパイで感染HeLa細胞の画像を使用してIMARISによる定量分析のためのステップ命令により、図5のステップ。（A）は、「開く」をクリックし、ファイルを選択してデータを開きます。突破ビューのオブジェクトのツールバーで、（B）は、新しい表面項目を追加。 （C）セグメントのROIを選択し、ROIを分析するには。 （D）を直接サイズとROIの位置を変更するために、プレビューの長方形の矢印をクリックして、対応するX軸、Y軸、Zフィールドまたは（E）の値を入力します。この例では、ROIは必要ないし、画像全体を分析した。ソースチャネルとしての（F）は、チャネル3（ゴールド-BSA-ローダミンNPの信号）を選択します。結果の面積の滑らかさを設定するには、円滑なオプションをチェックします。手動で値を定義するか、自動的に生成された値を受け入れます。ここでは、0.1μmのものを用いた。 「しきい値」のために「絶対強度」オプションを選択します。閾値調整のために（G）手動オプションを選択して値を設定（この例では15を使用した）。視域における表面閾値プレビューは灰色で表示されている。タブで（H） '分類サーフェス」得られた表面は、様々な基準によってフィルタリングすることができます。デフォルトのフィルタは、 '> 10ボクセルの数」である。ザ·フィルタは、新しい値を入力することによって調整することができ、他のフィルタを追加することができる。この例では、フィルタ '> 10ボクセルの数」を保った。 （I）は 「完了」にサーフェス作成をクリックして完了します。オブジェクトのリストで、現在、アイテムのボリュームと新しい作成表面について、未チェックボックスが赤で表示領域に表示されます。 （J）は突破ビューでは被験者の色は、その面積に応じて紫から赤に変わる。 （K） 'プロット番号のエリア」テーブルには、統計情報が表示されます。 Excelファイルにエクスポート統計。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
非感染細胞の図6の定量解析結果。（
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Discussion
哺乳動物細胞のエンドリソソーム系は、栄養吸収、ホルモン媒介性シグナル伝達、免疫監視、および抗原提示17を含む重要な生理的過程を制御する。これまで、種々のマーカーは、エンドサイトーシス経路および追跡調査を標識するために使用されてきた。例えば、リソトラッカープローブは、選択的に低い内部pHの細胞区画に蓄積し、効果的にナノモル濃度18に住んで細胞を標識することができリソソーム標識に分子プローブ（ライフテクノロジーズ、米国）が開発した蛍光acidotropicプローブ、である。しかしながら、細胞とリソトラッカープローブの長時間のインキュベーションは、リソソームpHの上昇を誘導し、リソソーム19の潜在的な生理学的変化をもたらし得る。フルオロフォアで標識されたデキストランのようないくつかの大きな生体分子は、また、しばしば、エンドソーム/リソソームの標識に使用される。しかし、低光安定性、短い循環寿命、およびp定着時OOR保持が長期の生細胞イメージングでアプリケーションを妨げると相関顕微鏡は16,19を研究。ここで、金BSA-ローダミンNPは、宿主細胞のエンドリソソーム系を標識するために流体のトレーサーとして使用した。高い取り込み効率と強力な細胞内の蛍光シグナルが観察された。非常に後期エンドソーム/リソソームの膜上で濃縮されているリソソーム糖タンパク質LAMP1、とNPのほぼ完全な共局在は、NPSがエンド - リソソームシステムに関する表示の適正化を検証した。そのようなリソトラッカーなどの他のマーカーと蛍光NPの使用を組み合わせることにより、宿主細胞小胞輸送および成熟についての補足情報を提供してもよい。
それは、NPの細胞内在化は、その物理的な寸法と化学成分に大きく依存していることを言及する価値がある。我々は、5ナノメートル、10ナノメートル、15ナノメートルと30ナノメートルの大きさ、および類似の細胞内分布において、金-BSA-ローダミンNPをテストしたサイドHeLa細胞（結果は示されていない）が観察された。我々は、 サルモネラ感染症研究のための便利な細胞株としてHeLa細胞を使用した。しかし、金BSA-ローダミンNPはまた、容易に種々の他の細胞株によって内在化することができ、一次細胞が適している。例えば、我々はサルモネラ CHOでNP、COS-7たCaCo2、または3T3細胞による管状構造とラベリング誘発、ならびにインターフェロンγで刺激されたRAW264.7マクロファージ様細胞株の細胞または初代マウスマクロファージにおいて観察され樹状細胞。しかし、各細胞株は、感染およびパルス/追跡プロトコルの調整を必要とする。
これは、染料捕捉さシリカNPは、生体適合性、長期生活として使用できることが報告されており、高度に光安定リソソームマーカー19、我々はまた、変化するサイズのローダミンドープシリカNPの挙動を比較した（30 - 1000nmで）。非感染細胞とSにおけるNPの蓄積中のシリカNPSが後期エンドソーム/リソソーム品質表示の適正化サルモネラ感染細胞におけるCVとSIFが観察された。しかし、NPの凝集体の形成または単シリカNPのサイズが大きいため、 サルモネラ誘発管状構造と共にNPの分布（データは示さず）は、均一ではなかった。
特性SCVの特徴ならびにSIFは、LAMP1 12として非常に豊富リソソームの糖タンパク質の存在である。ここで、安定的にLAMP1-GFPを発現するHeLa細胞株は、エンドリソソーム系との生細胞イメージングの便宜上SCVおよびSIF構造を使用した。構成的に強化されたGFPを発現するサルモネラ株は、細菌の位置を示すために、感染実験に使用した。による細胞内細菌の均一なサイズ及び形状に、一般に細菌GFP蛍光はエンドリソソーム膜上のGFP標識から容易に区別可能である。しかし、細菌および膜PRからで蛍光シグナル将来の実験のためにoteinsを正確例えば 、他の蛍光融合タンパク質を区別する必要がある、mTurquoiseは、統合されることをお勧めします。しかし、これは、生細胞実験において高い光損傷の危険性を有する、照明および画像取得のさらなるラウンドになる。
細菌の病原体が宿主細胞経路を操作するための必須遺伝子とメカニズムを調べるには、多数の変異体が作成される必要があり、その性能を慎重に比較する必要がある。例えば、 サルモネラ菌変異株ΔssaVとΔSIFAは非常に全身毒性および細胞内複製20,21で減衰される。どちらもΔssaVとΔSIFA株はSIFを誘導するために失敗し、さらにΔSIFAサルモネラ感染 12の過程でSCV膜を失う。 WT及び変異株の表現型を比較すると、rにサルモネラ菌の能力を理解することに尽力しているemodel宿主細胞小胞輸送。顕微鏡検査に基づいて、WT サルモネラ菌がΔssaVとΔSIFA変異株に比べてはるかに高い程度にまで宿主細胞のエンドサイトーシス経路を覆すことは明らかである。この関数は、それらの細胞内生存と複製のためのより多くの栄養素を得るために、細胞内のサルモネラ菌を有効かもしれません。
共焦点顕微鏡画像は明らかに細胞内細菌によって宿主細胞のエンド - リソソーム系のリモデリングを実証する。しかし、画像の定量分析は、正確な比較のために必要とされる。ここに記載した方法において、IMARISソフトウェアはチャンネル3> 15ボクセル> 10の数で蛍光強度を持つ3Dオブジェクトを抽出するために使用されるこれらのオブジェクトは、金BSA-ローダミンのNPを含む細胞膜構造であることが想定される。蛍光強度閾値およびフィルタは画像の品質が、shoulに従って定義することができる異なる条件または株を比較するために一定に保つことがdは。ここに示され、それぞれ、抽出431と67のオブジェクトとの8時間のπで非感染細胞とWT サルモネラ感染した細胞の例は、である。細胞の大きさが同じではないので、明らかな違いにもかかわらず、それは、オブジェクトの数のみを比較する合理的ではない。一つの解決策は、（それぞれ、本例では、2252ミクロン2と1975ミクロン2）合計された領域にオブジェクトの数を正規化又は細胞内のオブジェクトの蛍光強度の和である。あるいは、感染の異なる段階でのNPの分布を比較するために、感染前と異なる時点のπに一つのセルを追跡することも可能である。
結論として、この方法では、金BSA-ローダミンNPは、真核細胞のエンドリソソーム系を標識するために適用した。 intracellulaによって宿主細胞のエンド - リソソームシステムの操作Rの病原体は、生細胞CLSMで観察したと定量分析の結果は、 サルモネラは 、本研究におけるモデル病原体として使用された。WT サルモネラによる後期エンドソーム/リソソームの極端な再配列を示したが、そのような赤痢菌およびリステリアなどの他の細菌性病原体の細胞内挙動また、このアプローチを使用して調査することができる。原理的には、金BSA-ローダミンNPは、したがって、広く発散内因性または外因性物質によるエンドサイトーシス経路の相互作用を調査する研究に適用されて期待されている、細胞株の多種多様によって内在化することができる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| Tri-sodium citrate | Sigma | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| NHS-Rhodamine | Pierce | 46406 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Gentamicin | Applichem | A1492 | |
| Kanamcyin | Roth | T832 | |
| Carbenicillin | Roth | 6344 | |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80826 | tissue culture treated, sterile |
| Imaris Software | Bitplane | version 7.6 | various configurations available |
References
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