Summary
מאמר זה מתאר שיטות לסינתזה ותיוג ניאון של חלקיקים (NPS). הצירופים ויושמו בניסויי דופק מרדף לתייג מערכת אנדו-lysosomal של תאים האיקריוטים. מניפולציה של מערכת אנדו-lysosomal על ידי פעילויות של enterica סלמונלה הפתוגן תאיים היו במעקב על ידי הדמיה תא החי ולכמת.
Abstract
חלקיקי ניאון (NPS) עם כימי רצוי, תכונות אופטיות ומכאניות הם כלים מבטיחים לתייג אברונים תוך-תאיים. כאן, אנו מציגים שיטה באמצעות זהב-BSA-rhodamine צירופים ולתייג את מערכת אנדו-lysosomal של תאים האיקריוטים ולעקוב אחר מניפולציות של מסלולים סלולריים מארח ידי enterica סלמונלה הפתוגן תאיים. הצירופים והופנמו בקלות על ידי תאי הלה ומקומיים בendosomes / lysosomes מאוחר. זיהום סלמונלה מושרה סידור מחדש של שלפוחית והצטברות של צירופים ובמבני קרום Salmonella- מושרה. אנחנו פרסנו את חבילת תוכנת Imaris לניתוחים כמותיים של תמונות מיקרוסקופיה confocal. מספר האובייקטים והתפלגות גודלם בתאים הנגועים שאינם היו שונים מאלה בתאי -infected סלמונלה, המציין מאוד שיפוץ של מערכת אנדו-lysosomal ידי WT סלמונלה.
Introduction
חלקיקי ניאון (NPS), כוללים צירופים ומתכת, נקודות קוונטיות, צירופים ופולימר, צירופים וסיליקה, נקודות פחמן, וכו ', משכו תשומת לב רבה במהלך העשורים האחרונים 1,2. בהשוואה לצבעים אורגניים מסורתיים, צירופים וניאון להראות כימיים, תכונות אופטיות ומכאניות רצויות, כגון עוצמת אות חזקה, התנגדות לphotobleaching ו3,4 biocompatibility גבוה. יתרונות אלה הופכים אותם לשיטת בחירה של חישה תאית והדמיה תא חי. יתר על כן, מגוון רחב של צירופים ואלקטרון-צפוף גלוי על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים (EM), המאפשר את השימוש בם לניתוח מיקרוסקופי מתואם, המאפשר שילוב של תא חי מעקב עם מיקרוסקופ אור (LM) ורזולוציה גבוהה יותר ברמת ultrastructural עם EM 5. לדוגמא, צירופים וזהב היו זמן רב ביעילות משמש כחיישנים ביולוגיים בתאים חיים לאבחון רגיש, כמו גם בתחום אימונו-תיוג 6. ים האחרוןtudies עולה כי צירופים וזהב עם גודל וצורה שונים יכול להיות בקלות ספיגה על ידי מגוון גדול של שורות תאים ובאופן שיגרתי להעביר דרך מסלול endosomal, ולכן יש לי יצור פוטנציאל גדול הגיש בקשה למעקב תחבורה השלפוחית תאית ותיוג מערכת אנדו-lysosomal 7,8 .
פתוגנים חיידקים, כגון סלמונלה enterica, flexneri Shigella וחיידקים ליסטריה, פיתחו מנגנונים שונים כדי לפלוש תאי מארח שאינו phagocytic 9. לאחר שהפנים, פתוגנים, מקומי או בcytosol או מוחרם בתאי קרום נכנסים, אינטראקציה נרחבת עם סביבות המארח שלהם ולווסת את אלה לטובת ההישרדות שלהם 10. לדוגמא, enterica סלמונלה מתגורר ומשכפל בתוך תא phagosomal תאית המכונה vacuole המכיל סלמונלה (SCV) על זיהום 11. SCV ההתבגרותtraffics כלפי מערכת גולג'י, עוברים אינטראקציות רציפות עם מסלול endocytic, וגורם להיווצרות של מבנים נרחבים צינורי, כגון חוטי -induced סלמונלה (SIF), מיון tubules nexin, 3 tubules סלמונלה מוביל הפרשת -induced חלבון קרום (SCAMP3), וכו ' . 12-14. לומדים איך חיידקים פתוגנים אלה לתפעל מסלולי מארח תאים חיוני להבנת מחלה זיהומית.
כאן, צירופים וזהב-BSA-rhodamine שמשו כקליעים נותבים נוזל לתייג מערכת אנדו-lysosomal הסלולרית המארח, והפתוגן עיכול Typhimurium serovar enterica אדם סלמונלה (Salmonella) שימש כחיידק מודל ללמוד את יחסי הגומלין של הפתוגן עם לארח מסלול endocytic. צירופים וזהב-BSA-rhodamine תאיים בתאים הנגועים באי ותאים נגועים בסלמונלה WT או זנים מוטנטים היו צילמו על ידי מיקרוסקופ confocal לייזר סריקה (CLSM).אז תוכנת Imaris שימשה לכמת את ההפצה של צירופים ו, מצביע על כך שזיהום סלמונלה מושרה סידור מחדש קיצוני של endosomes / lysosomes. לאחר התיאור של שיטה זו, יכולים להיות מתוכנן ניסויים מקבילים כדי לעקוב אחר גורל לטווח הארוך של צירופים והמופנמים ולחקור את ההשפעה של חומרים אקסוגניים שונים או גורמים במשק על מסלול endocytic של תאים האיקריוטים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. סינתזה של 10 ננומטר זהב חלקיקים (זהב NPS) 15
- הכן פתרון: להוסיף 2 מיליליטר 1% כלוריד זהב המימי ל160 מיליליטר מילי- Q, או מזוקק פעמיים, מים.
- הכן הפתרון B: להוסיף 8 מיליליטר 1% ציטראט x 2 H תלת-נתרן 2 O ו -160% μl 1 חומצה טאנית ל -32 מיליליטר מילי- Q, או מזוקק פעמיים, מים.
- לחמם את הפתרון A ו- B ל- 60 ° C ומערבבים אותם תוך ערבוב. שים לב בצבע כחול כהה באופן מיידי. שים לב צבע אדום לאחר כ -15 דקות. לאחר מכן לחמם עד 95 מעלות צלזיוס, לשמור על 5 דקות ולקרר את הפתרון לRT.
- הוסף טיפה של ההשעיה NP על פחמן רשת מצופה ולאפשר לו להתייבש באוויר. בדוק את הגודל ומורפולוגיה של צירופים ועל ידי מיקרוסקופ אלקטרונים החודר.
2. ציפוי של צירופים וזהב עם BSA ותיוג עם Rhodamine N-hydroxysuccinimidyl אסתר (NHS) 16
- להוסיף 900 μl צירופים וזהב לתוך צינור Eppendorf 1.5 מיליליטר, צנטריפוגות ב 15,000 XG למשך 30 דקות. אופtionally, להכין צינורות מרובים עשויים בבת אחת.
- בטל supernatant, מחדש להשעות את גלולה ב900 μl מעוקר המים מילי- Q ולהוסיף 100 μl 2 מ"ג / מיליליטר BSA / PBS, לערבב במערבולת ב 800 סל"ד במשך 30 דקות.
- כדי להסיר BSA העודף, צנטריפוגות ההכנה ב15,000 XG במשך 60 דקות.
- בטל supernatant, מחדש להשעות הצירופים והזהב-BSA ב125 μl PBS, להוסיף 12.5 μl של יקרבונט 1 M.
- מייד לפני השימוש, להכין פתרון 10 מ"ג / מיליליטר של rhodamine NHS / DMSO, להוסיף 30 μl של פתרון / DMSO rhodamine NHS ל1ml של ההשעיה זהב-BSA הצירופים. דגירה התגובה לשעה 2 (או O / N) ב RT במהלך 800 ערבוב סל"ד, הימנעות מחשיפה לאור.
- לטהר את הצירופים וזהב-BSA-rhodamine באמצעות דיאליזה נגד PBS בºC 4 עם 5 חיץ שינויים על פני תקופת 36-48 שעות.
- כדי לייצב צירופים ו, להוסיף 10 μl של 200 מ"ג / BSA / PBS מיליליטר לכל 1 מיליליטר צירופים וזהב-BSA-rhodamine. כדי להסיר את צנטריפוגות בחינם או שוחררה BSA-rhodamine, בגיל 15,000 XG במשך 60 דקות. Resuspend גלולה ב 2 מ"ג / מיליליטר BSA / PBS, למדוד OD 520, ולאחסן ב 4 ° C, הימנעות מחשיפה לאור.
- לדלל את הפעמים הצירופים 10 עם מילי- Q או מים מזוקקים פעמיים, להוסיף טיפה על רשת מצופה פחמן, ולאפשר לו להתייבש באוויר. בדוק את הגודל ומורפולוגיה של צירופים ועל ידי מיקרוסקופ אלקטרונים החודר (TEM).
הערה: כל החומרים המשמשים להכנת NP עוקרו והמבצע שנערך במכסת מנוע תרבית תאים או על ספסל ליד להבה.
3. תרבות של תאי הלה
- תאי הלה באופן קבוע להביע LAMP1-GFP בתרבית DMEM עם סרום 10% עגל עוברי (FCS) וגדלתי על 37 מעלות צלזיוס באווירה המכילה 5% CO 2.
- זרעי התאים בצפיפות של 50,000 לכל גם בתא שקופית 8 היטב (Ibidi) ודגירת O / N.
4. תרבות של חיידקים
- serovar enterica השימוש סלמונלה Typhimurium NCTC 12,023 wild-סוג מתח (WT). לשם השוואה, להשתמש זנים מוטנטים Δ ssaV פגומים בSPI2-T3SS וΔ SIFA חסר מפעיל מפתח SIFA לSIF. השתמש בזני חסת פלסמיד pFPV25.1 לביטוי מכונן של ה- GFP המשופר.
הערה: זני חיידקים באופן שיגרתי בתרבית במרק לוריא-Bertani (LB) עם תוספת של 50 מיקרוגרם / מיליליטר carbenicillin (WT) וLB עם תוספת של 50 מיקרוגרם / מיליליטר carbenicillin ו / או 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin (Δ ssaV, Δ SIFA ) של הנדרש כדי לשמור על פלסמידים. - לחסן מושבה אחת של חיידקים ב 3 מיליליטר LB עם אנטיביוטיקה מתאימה ולגדול O / N ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים רועדים לאוורור, ואז לדלל 01:31 בLB הטרי ולהמשיך את הצמיחה תמורת 3.5 שעות. בנקודה זמן זו, התרבויות להגיע השלב מאוחר יומן וחיידקים הם פולשני מאוד. "תוף הרים 'הוא נוח לדגירת תרבויות מבחנה עם אוורור.
5. זיהום של תאי הלה על ידיסלמונלה וזהב-BSA-Rhodamine צירופים וPulse צ'ייס תיוג (ראה תרשים 1 לערכה)
- למדוד OD 600 של החיידקים תת תרבות ולדלל את OD 600 = 0.2 ב 1 מיליליטר PBS (~ 3 CFU × 10 8 / מיליליטר), להוסיף כמויות מתאימות של חיידקים לתאי הלה בשקופיות קאמריות 8 היטב כדי להשיג ריבוי זיהום (משרד הפנים) של 100.
- דגירה למשך 30 דקות בחממת התא, לשטוף 3 פעמים עם PBS להסיר חיידקים שאינם מופנמים (זמן נקודה זו נקבעה כלאחר זיהום 0 שעה, או 0 pi hr). להוסיף 300 μl של מדיום תרבות הטרי המכיל 100 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין ולשמור עבור שעה 1. לאחר מכן להחליף בינוני עם בינוני טרי המכיל גנטמיצין / מיליליטר 10 מיקרוגרם לשארית זמן הדגירה.
- לאחר הדגרה עם מדיום תרבות המכיל גנטמיצין / מיליליטר 100 מיקרוגרם לשעה 1, הבינוני הוא הוחלף על ידי הדמיה בינונית (הנשרים MEM ללא FCS, L-גלוטמין, ביקרבונט האדום ונתרן פנול, עם 30 מ"מ HEPES, pH 7.4) במשותףntaining 10 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין. צירופים וזהב-BSA-rhodamine מתווספים לתאי הלה להשיג ריכוז סופי של OD 520 = 0.1.
הערה: צירופים וזהב-BSA-rhodamine יכול להיות גם הוסיפו לתאים לפני ההדבקה, או בpi נקודות הזמן השונים - לאחר הדגירה 1 שעה, להסיר את המדיום, לשטוף 3 פעמים עם PBS, ולהוסיף 300 μl של מדיום הדמיה טרי המכיל 10% FCS וגנטמיצין / מיליליטר 10 מיקרוגרם לשארית זמן הדגירה.
הערה: משך הדגירה עשוי להשתנות בהתאם לריכוז של צירופים ושורות תאים בשימוש. למקרופאגים RAW264.7, שמה לב שדגירת דקות 30 עם צירופים ובריכוז של OD 520 = 0.05 אפשר הפנמה מספקת.
6. הדמיה
- השתמש במערכת הדמיה confocal כגון לייזר סריקת confocal (CLSM) או מיקרוסקופ דיסק מסתובב (SD) עם תא סביבת humidified להדמיה ברזולוציה גבוהה בזמן נקודות שונות.
- לעבור על ג הטמפרטורהontrol מערכת ולחכות עד שהוא יציב. למטב את הגדרות ההדמיה כגון הגדלה, מהירות סריקה, רזולוציה, Z-ערימה וכו 'השתמש בהגדרות עירור / פליטה מתאימות לGFP וצירופים וזהב-BSA-rhodamine. לפרוטוקול זה, השתמש 400 הרץ מהירות סריקה, ברזולוציה של 512 x 512 פיקסלים וגודל Z-צעד של 0.25 מיקרומטר. Excite GFP וזהב-BSA-rhodamine באמצעות לייזר Ar (488 ננומטר) וליזר HeNe (543 ננומטר), בהתאמה. כולל בהיר שדה ערוץ (BF) להתבוננות בדמותם של התאים. למערכות אחרות במיקרוסקופ ותנאי זיהום, ההגדרה צריכה להיות בהתאם.
הערה: השתמש באותה הלייזר Ar כמקור האור של ערוץ BF ואות זוהה עם גלאי מכפיל תמונה (PMT). - בpi נקודות הזמן שצוין, הר השקופיות קאמריות 8-היטב המכילות תאים נגועים על הבמה מיקרוסקופ ותמונות שיא.
7. ניתוח של תמונות
- השתמש בתוכנת ניתוח תמונה מיקרוסקופית (ראה
הערה: לחלופין, חבילות תוכנת קוד פתוחות כגון ImageJ או פיג'י עשויות לשמש לתמונת ניתוחים כמותיים. - בסרגל הכלים האובייקטים של קליק לעלות מבט על הסמל
כדי להוסיף פריט שטח חדש. לחץ על 
(הבא). - כדי לנתח אזור של העניין (ROI), מגזר בחר ROI. באזור תצוגה, סעיף-גובל מלבן מעולף על תמונה המייצג את ההחזר על ההשקעה. הזן את הערכים בקואורדינטות x המקבילות, y-, ושדות Z-, או ישירות לחץ על החצים במלבן התצוגה המקדימה לגודל ומיקום של ההחזר על ההשקעה לשנות. לאחר מכן לחץ על
= "/ קבצים / ftp_upload / 52,058 / 52058icon2.jpg" /> (הבא).
- כערוץ מקור, ערוץ בחר 3 (אות לזהב-BSA-Rhodamine NPS). בדוק את האפשרות החלקה להגדיר את החלקות באזור וכתוצאה מכך. להגדיר ערך באופן ידני או לקבל את הערך שנוצר באופן אוטומטי. לסף, בחר באפשרות העוצמה מוחלטת.
- להתאמת הסף, בחר באפשרות הידנית ולהגדיר ערך. באזור התצוגה, תצוגה מקדימה סף משטח מוצגת באפור.
- על המשטחים לסווג כרטיסיית פני השטח וכתוצאה ניתן לסנן לפי קריטריונים שונים. מסנן ברירת מחדל הוא 'מספר voxels> 10', ומסננים אחרים יכול להיכלל גם על ידי לחיצה על "הוספה". אם סינון אין צורך, ולאחר מכן למחוק את כל המסננים על ידי לחיצה על כפתור המחיקה. לחץ (הבא).
- כדי להשלים את יצירת Surface, לחץ על/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg "/> (Finish). ברשימת האובייקט, עכשיו את הסימון בתיבה לVolume הפריט והמשטח שנוצר חדש מוצג בשטח צפייה.
- לייצא את הנתונים הסטטיסטיים. עכשיו, בתצוגה לעלות את הצבע של הנושאים משתנים מסגול לאדום בהתאם לאזור שלהם. והשולחן 'פינת מספרי מגרש' מציג את המידע הסטטיסטי (למשל, מספר תעודת זהות ושטח של אובייקטים). לייצא את כל הנתונים הסטטיסטיים של משטח 1 לקובץ Excel על ידי לחיצה
(שמור).
כדי להוסיף פריט שטח חדש. לחץ על 
(הבא). 
(שמור). Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
צירופים וזהב שהופקו באמצעות שיטה מבוססת היטב באמצעות הפחתה של חומצת chloroauric ידי ציטראט וחומצה טאני. כפי שניתן לראות באיור 2 א, הצירופים והזהב מסונתזים היו מעין-כדוריים בצורה בגודל של כ -10 ננומטר. BSA-הציפוי וrhodamine תיוג לא השפיעו המורפולוגיה שלהם או גודל (איור 2).
זה כבר דווח כי צירופים וזהב ניתן לקחת בקלות על ידי תאי יונקים שונים ובסופו במערכות endocytic 7. בהתאם לעבודות קודמות, אותות הקרינה אדומים בהירים נצפו בתאי הלה לאחר דגירה שעה 1 עם צירופים וזהב-BSA-rhodamine (איור 3, WT 5 pi hr), המצביעים על הפנמה יעילה של הצירופים ועל ידי תאים. רוב האותות האדומים נמצאו colocalized עם אותות ירוקים, שהראה כי הצירופים ונכלאו בendosomes או lysosomes מאוחר. עם זאת, בניגוד להתפלגות אחידה של צירופים ובendosomes / lysosomes מאוחרבתאים נגועים שאינם (איור 3, מדומה), שאתריהם מחדש במידה רבה בתאי -infected WT סלמונלה. בשלב המוקדם של זיהום (איור 3, WT 5 pi hr), סלמונלה משכפל בתוך SCV וSIF לעבור סיומת מהירה או תנועת התכווצות. בנקודה זו בזמן, כל חלק של הצירופים ונמצא בSCV וSIF, ואילו חלק אחר עדיין נמצא בendosomes / lysosomes מאוחר חופשי. בשעת 8 בpi שעות (איור 3, WT 8 pi hr), רשת התייצבה של SIF הוקמה, ורוב הצירופים ונמצאו שנצברו בתוך המבנים צינוריים, בעוד שרק חלק קטן מאוד נשאר ממוקם בendosomes / lysosomes מאוחר חופשי. הזנים מוטנטים Δ Δ ssaV וSIFA הציגו התנהגויות שונות. כפי שניתן לראות באיור 3 (Δ ssaV), בשעה 8 בpi שעה, Δ ssaV היה מרותק בתוך SCV בעוד אין מבני SIF נוצרו. צירופים וכמה נצפו סביב סלמוןella בתוך SCV, אבל הרוב המכריע של צירופים ועדיין נמצאו בendosomes / lysosomes מאוחר חופשי. עבור זן Δ SIFA (איור 3, Δ SIFA), בריחה של סלמונלה לציטופלסמה התרחשה, ואין קשר בין צירופים וחיידקים נצפה.
במחקר הקודם שלנו נמצא כי מאפייני תצוגת SIF דינמיים מאוד בשלב המוקדם של זיהום (3-5 שעות pi), אבל הפך התייצבו בתקופה המאוחרת יותר (> 8 pi hr) 12. לכן, אנחנו תוהים אם יש לי סלמונלה בשלבים מוקדמים ומאוחרים של זיהום יכולת להשוות לארגן מחדש הפצה של צירופים ותאיים. כפי שניתן לראות באיור 4, צירופים וזהב הודגרו עם תאי הלה O / N לפני הזיהום, או בנקודתי זמן שונות לאחר ההדבקה (1 - שעה pi 7) במשך שעה 1, בכל המקרים רוב הצירופים והפנימו נצפו נצברו ב SCV או SIF.
observ המיקרוסקופיations גילה כי זיהום על ידי תוצאות סלמונלה בהתארגנות מסיבית של מערכת אנדו-lysosomal של תאי מארח. כצעד הבא, השתמשנו בחבילת תוכנת Imaris לנתח פנוטיפים התא מארח -induced סלמונלה באופן כמותי. שימוש בדמותו של הלה תא נגוע אחד בשעה 8 pi hr כדוגמא, הוראת צעד-אחר-צעד לניתוח כמותי מתוארת באיור 5. באמצעות סף עוצמה של 15 ו'מספר voxels> 10 'מסנן, 3D חפצים שהוצאו מקובץ התמונה המקורי. החפצים הייתם אמורים להיות מבנים תאיים שבי הזהב-BSA-rhodamine הצירופים וממוקמים ב. בדוגמא זו, 67 חפצים הוצאו בסך הכל, בשטח סיכם כ1,974.64 מיקרומטר 2. העצם הגדול ביותר, שcolocalized עם רשת SIF, יש שטח של 1,836.23 מיקרומטר 2, בעוד האחרים הם קטנים יותר מ -50 מיקרומטר 2. לשם השוואה, דוגמא אחת המראה את קוואנטתוצאת ניתוח itative של תאים הלא-נגועים ניתנה ב. הנה, 431 חפצים הוצאו בסך הכל, שבתוכו הערך הממוצע של האזור הוא 5 מיקרומטר 2 ויש לו את העצם הגדול ביותר על שטח של 34 מיקרומטר 2. האזור סיכם של האובייקטים הוא 2,252 מיקרומטר 2, אשר ניתן להשוות את התא הנגוע באיור 4 (1,975 מיקרומטר 2). עם זאת, מספר האובייקטים הוא הרבה יותר גדול מהשני (431 ו 67 אובייקטים, בהתאמה), המצביע על היתוך מידה רב של שלפוחית עם המבנים צינוריים -induced סלמונלה.
איור Scheme 1. להכנת תאי הלה הדמיה תא חי. תאי הלה היו זורעים בשקופיות קאמריות, מדומה נגוע, או נגוע בסלמונלה זנים שונים למשך 30 דקות, שטף 3 פעמים עם PBS, אז incubat ed עם מדיום המכיל גנטמיצין / מיליליטר 100 מיקרוגרם לשעה 1. בהמשך לכך, הבינוני הוחלף על ידי הדמיה בינונית מכיל 10 ננומטר צירופים וזהב-BSA-rhodamine (OD 520 = 0.1) ו -10 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין, טופח במשך שעה 1, ולאחר מכן רדף אחרי בינוני NP-חופשי למנוחה של הניסוי . הדמיה תא חי בוצעה בנקודות זמן שונות לאחר זיהום (PI). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. תמונות TEM של צירופים וזהב colloidal לפני (א) ולאחר התיוג (ב). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Remodeling איור 3. במערכת אנדו-lysosomal הסלולרית המארח על ידי תאי סלמונלה. הלה תאיים היה, או נגוע בסלמונלה WT, Δ ssaV או Δ SIFA זנים מוטנטים ודופק / מרדף עם צירופים וזהב-BSA-rhodamine 10 ננומטר נגוע מדומה ( OD 520 = 0.1) בוצע כפי שתואר באיור 1. תחזיות בעוצמה מקסימליים של Z-ערימות CLSM מוצגות. ברים סולם, 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. נגישות של מערכת אנדו-lysosomal בשלבים שונים של זיהום סלמונלה. הלהתאים היו פעמו עם צירופים וזהב-BSA-rhodamine 10 ננומטר (OD 520 = 0.1) O / זיהום לפני N, או לשעה 1 בpi נקודות הזמן השונים כפי שצוין. הדמיה תא חי בוצעה ב8-9 תחזיות בעוצמה מקסימלי pi שעות של Z-ערימות CLSM מוצגות. ברים סולם, 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור שלב 5. על ידי הוראת צעד לניתוח כמותי על ידי Imaris באמצעות דמותו של הלה תא נגוע בשעה 8 pi hr כדוגמא. (א) פתח את הנתונים על-ידי לחיצה על 'פתח' ובחירת הקובץ. (ב) בסרגל הכלים האובייקטים של התצוגה לעלות להוסיף פריט שטח חדש. (ג) כדי לנתח את ההחזר על ההשקעה, ולאחר מכן בחר קטע ROI. (D) הזן את הערכים בקואורדינטות x המקבילות, y-, וz-שדות או (E) ישירות לחצו על החצים במלבן התצוגה המקדימה כדי לשנות את הגודל והמיקום של ההחזר על ההשקעה. בדוגמא זו, החזר על השקעה לא צריך ואת התמונה כולה נותחה. (F) כערוץ מקור לבחור את ערוץ 3 (האות של הזהב-BSA-Rhodamine NPS). בדוק את האפשרות החלקה להגדיר את החלקות באזור וכתוצאה מכך. להגדיר ערך באופן ידני או לקבל את הערך שנוצר באופן אוטומטי. הנה, היה בשימוש 0.1 מיקרומטר. עבור 'סף', בחר באפשרות "העוצמה מוחלטת". (G) להתאמת הסף בחר באפשרות הידנית ולהגדיר ערך (בדוגמא זו 15 היה בשימוש). באזור התצוגה מקדים סף משטח מוצג באפור. (H) בכרטיסייה 'לסווג המשטחים' פני השטח וכתוצאה ניתן לסנן לפי קריטריונים שונים. מסנן ברירת מחדל הוא 'מספר voxels> 10'.מסנן יכול להיות מותאם על ידי הזן ערך חדש וניתן להוסיף מסננים אחרים. בדוגמא זו, אנחנו כל הזמן "מספר voxels> 10 'המסנן. (I) כדי להשלים לחיצת יצירה וציור על 'סיום'. ברשימת Object עכשיו את הסימון בתיבה לVolume הפריט והמשטח שנוצר חדש מוצגת בשטח צפייה באדום. (J) בתצוגה לעלות את הצבע של הנושאים משתנה מסגול לאדום בהתאם לאזור שלהם. (K) השולחן "מספרי מגרש פינת 'מציג את המידע הסטטיסטי. סטטיסטיקת יצוא לקובץ אקסל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. תוצאת ניתוח כמותי של תאים הלא-נגועים. (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מערכת אנדו-lysosomal של תאי יונקים שולטת בתהליכים פיסיולוגיים חשובים, כוללים מזין קליטה, הולכים אותות בתיווך הורמון, מעקב חיסוני, והצגת אנטיגן 17. עד עכשיו, מגוון רחב של סמנים שימש במשך תיוג של לימודי מסלול ומעקב endocytic. לדוגמא, בדיקות Lysotracker הן בדיקות ניאון acidotropic שפותחו על ידי בדיקות מולקולריות (Life Technologies, ארה"ב) לתיוג הליזוזום, אשר באופן סלקטיבי יכולה להצטבר בתאים סלולריים עם pH הפנימי נמוך ויעילות לתייג תאי חיים בריכוזים של ננו-מולר 18. עם זאת, דגירה זמן רב של בדיקות Lysotracker עם תאים עלולה לגרום לעלייה בחומציות lysosomal ולהוביל לשינויים פיסיולוגיים פוטנציאל של lysosomes 19. כמה מולקולות ביולוגיות גדולות, כגון dextrans fluorophore שכותרתו, גם משמשות לעתים קרובות לאנדוזום / lysosomes תיוג. עם זאת, נמוכה photostability, חיים במחזור קצרים, וpשמירת oor במהלך הקיבעון לעכב את היישומים שלהם בתחום ההדמיה תא חי לטווח הארוך ומיקרוסקופ הגומל לומד 16,19. כאן, צירופים וזהב-BSA-rhodamine שמשו כקליעים נותבים נוזל לתייג מערכת אנדו-lysosomal הסלולרית המארח. יעילות ספיגה גבוהה ואותות הקרינה תוך-תאיים חזקים נצפו. Colocalization כמעט המוחלט של צירופים ועם LAMP1 גליקופרוטאין lysosomal, אשר מועשר בקרום של endosomes / lysosomes מאוחר, אימת תיוג תקין של מערכת אנדו-lysosomal ידי הצירופים ו. שילוב השימוש בצירופים והניאון עם סמנים האחרים כגון Lysotracker עשוי לספק מידע משלים לגבי סחר לפוחי תא מארח והתבגרות.
ראוי להזכיר כי הפנמה סלולרית של צירופים ותלויה מאוד בממדים הפיזיים שלהם ומרכיבים כימיים. בדקנו צירופים וזהב-BSA-rhodamine עם גודל של ננומטר 5, 10 ננומטר, 15 ננומטר ו -30 ננומטר, והפצה תאית דומה בתאי הלה צד נצפו (תוצאות לא מוצגות). אנחנו השתמשנו בתאי הלה כקו תא נוח ללימודי זיהום סלמונלה. עם זאת, צירופים וזהב-BSA-rhodamine יכולים גם להיות מופנם בקלות על ידי שורות תאים שונות ותאים ראשוניים ניתנים. לדוגמא, אנו נצפו סלמונלה -induced מבנים ותיוג צינורי ידי NP בCHO, COS-7, CaCo2, או 3T3 תאים, כמו גם בתאי אינטרפרון-מגורה γ RAW264.7 כמו מקרופאג-קו סלולארי או מקרופאגים עכבריים ראשוניים ו תאים דנדריטיים. עם זאת, כל שורת תא תדרוש התאמה של הזיהום ופרוטוקולי דופק / מרדף.
זה כבר דווח כי צירופים וסיליקה בפח צבע יכול לשמש כחיים ארוכים ביולוגית, וסמן הליזוזום photostable ביותר 19, ואנחנו גם בהשוואה ההתנהגות של צירופים וסיליקה-מסומם rhodamine עם גודל משתנה (30 - 1,000 ננומטר). תיוג נכון של endosomes / lysosomes מאוחר על ידי הצירופים וסיליקה בתאים הנגועים באי והצטברות של צירופים ובSקורות החיים וSIF בתאי -infected סלמונלה נצפו. עם זאת, עקב היווצרות של אגרגטים של צירופים ואו הגודל הגדול של צירופים וסיליקה אחת, הפצה של צירופים ויחד עם מבנים צינוריים -induced סלמונלה לא היה אחיד (מידע לא מוצג).
מאפיין של SCV כמו גם SIF הוא נוכחותם של גליקופרוטאינים lysosomal הנרחבים ביותר כגון LAMP1 12. כאן, שורת תאי הלה ביציבות להביע LAMP1-GFP שימשה לנוחיות הדמיה תא החי של מערכת אנדו-lysosomal ומבני SCV וSIF. זני סלמונלה constitutively להביע GFP המשופר שמשו בניסויי הזיהום כדי לציין מיקום של חיידקים . בשל גודלו וצורה האחיד של החיידקים תוך-התאיים, חיידקי GFP הקרינה באופן כללי היא בקלות להבחין בין תווית GFP על קרומי אנדו-lysosomal. עם זאת, לניסויים עתידיים שבי ניאון אות מחיידקים ויחסי ציבור קרוםoteins צריך להיות, חלבונים דווקא לבדל אחרים היתוך ניאון, למשל, mTurquoise, מומלצים להיות משולב. זה, עם זאת, תוצאות בסבבים נוספים של תאורה ורכישת תמונה, הנושאות את הסיכון של תמונה-נזק גבוה יותר בניסויי תא חיים.
כדי לגלות את הגנים ומנגנונים חיוניים לחיידקים פתוגנים לתפעל מסלולי מארח תאים, מוטציות רבות צריכה להיות שנוצרו וההופעות שלהם צריכים להיות בהשוואה זהירות. לדוגמא, זנים מוטנטים סלמונלה Δ Δ ssaV וSIFA הם נחלשו מאוד בארסיות מערכתית ושכפול תאיים 20,21. שני זני Δ Δ ssaV וSIFA לא מצליחים לגרום לSIF, ובנוסף Δ SIFA סלמונלה לאבד את קרום SCV במהלך הזיהום 12. השוואת פנוטיפים של WT וזנים מוטנטים היא סייעה בהבנת היכולת של סלמונלה לrתא מארח emodel תנועת לפוחי. בהתבסס על בדיקה מיקרוסקופית, ברור שWT סלמונלה לחתור תחת מסלולי endocytic סלולריים מארח להרבה יותר גבוהה במידה בהשוואה לזנים מוטנטים Δ Δ ssaV וSIFA. פונקציה זו עשויה לאפשר סלמונלה תאית להשיג יותר חומרים מזינים להישרדות תאית שלהם ושכפול.
תמונות מיקרוסקופיה Confocal הראו בבירור את שיפוץ של מערכת אנדו-lysosomal סלולארי מארח על ידי חיידקים תוך תאיים. עם זאת, ניתוח כמותי של התמונות נדרש להשוואה מדויקת. בשיטה המתוארת כאן, תוכנת Imaris משמשת לחילוץ 3D אובייקטים שיש להם עוצמת הקרינה בערוץ 3> 15 ומספר voxels> 10. אובייקטים אלה אמורים להיות מבני קרום תאיים המכילים זהב-BSA-Rhodamine צירופים. ניתן להגדיר סף עוצמת הקרינה והמסננים לפי איכות תמונות, אבל שאולד להישמר קבוע להשוואת תנאים או זנים שונים. המוצגים כאן הם דוגמאות של תאים שאינם נגועים ותא WT סלמונלה -infected בשעה 8 pi שעות, עם 431 ו 67 חפצים שחולצו, בהתאמה. למרות ההבדל הברור, זה לא הגיוני להשוות רק את מספר האובייקטים, מאז גודל התאים הם לא אותו הדבר. פתרון אחד הוא לנרמל את מספר האובייקטים לאזור סיכם (בדוגמא זו, 2,252 מיקרומטר 2 ו1,975 מיקרומטר 2, בהתאמה) או הסכום של עוצמות ניאון של האובייקטים בתוך תאים. לחלופין, אפשר גם לעקוב אחר תא אחד לפני ההדבקה ובpi נקודות זמן שונה על מנת להשוות את חלוקת הצירופים ובשלבים שונים של זיהום.
לסיכום, בשיטה זו צירופים וזהב-BSA-rhodamine יושמו לתייג מערכת אנדו-lysosomal של תאים האיקריוטים. המניפולציה של מערכת אנדו-lysosomal הסלולרי המארח ידי intracellulaהפתוגן r נצפה על ידי CLSM תא החי ותוצאות ניתוח כמותי הצביע שחלופים קיצוניים של endosomes מאוחר / lysosomes ידי WT סלמונלה. סלמונלה שימש כמחולל מחל מודל במחקר זה, אבל התנהגות תאית של חיידקים פתוגנים אחרים, כגון Shigella flexneri וחיידקים ליסטריה יכול גם להיחקר שימוש בגישה זו. באופן עקרוני, צירופים ו- rhodamine זהב-BSA יכולים להיות מופנמים על ידי מגוון רחב של שורות תאים, ולכן, אתם מבטיחים מיושמים באופן נרחב במחקרים חוקרים אינטראקציה של מסלול endocytic עם חומרי אנדוגני או אקסוגני מסתעפים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| Tri-sodium citrate | Sigma | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| NHS-Rhodamine | Pierce | 46406 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Gentamicin | Applichem | A1492 | |
| Kanamcyin | Roth | T832 | |
| Carbenicillin | Roth | 6344 | |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80826 | tissue culture treated, sterile |
| Imaris Software | Bitplane | version 7.6 | various configurations available |
References
- Coto-Garcia, A. M. Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics. Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).
- Xie, J., Lee, S., Chen, X.
- Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. A. Fluorescent nanoparticles for intracellular sensing: a review. Anal. Chim. Acta. 751, 1-23 (2012).
- Wu, C., Chiu, D. T. Highly fluorescent semiconducting polymer dots for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 3086-3109 (2013).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nat. Methods. 2, 743-749 (2005).
- Kumar, D., Saini, N., Jain, N., Sareen, R., Pandit, V. Gold nanoparticles: an era in bionanotechnology. Expert Opin. Drug Deliv. 10, 397-409 (2013).
- Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells. Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).
- Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells. Nano Lett. 6, 662-668 (2006).
- Finlay, B. B., Cossart, P. Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens. Science. 276, 718-725 (1997).
- Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449, 827-834 (2007).
- Malik-Kale, P., et al. Salmonella - at home in the host cell. Front. Microbiol. 2, 125 (2011).
- Rajashekar, R., Liebl, D., Seitz, A., Hensel, M. Dynamic remodeling of the endosomal system during formation of Salmonella-induced filaments by intracellular Salmonella enterica. Traffic. 9, 2100-2116 (2008).
- Schroeder, N., Mota, L. J., Meresse, S.
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system. Traffic. 8, 212-225 (2007).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. Eur. J. Cell Biol. 38, 87-93 (1985).
- Zhang, Y., Hensel, M. Evaluation of nanoparticles as endocytic tracers in cellular microbiology. Nanoscale. 5, 9296-9309 (2013).
- Pollard, T. D., Earnshaw, W. C., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 22. Cell Biology. , (2007).
- LysoTracker and LysoSensor Probes. , Life Technologies Corporation. Carlsbad, CA. (2013).
- Shi, H., He, X., Yuan, Y., Wang, K., Liu, D. Nanoparticle-based biocompatible and long-life marker for lysosome labeling and tracking. Anal. Chem. 82, 2213-2220 (2010).
- Hensel, M. Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages. Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).
- Beuzon, C. R., et al. Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA. EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).
