Summary
כדי לנתח פרופילי ביטוי גני לב במהלך התפתחות לב דג הזברה, רנ"א הכל יש להיעקר מלב מבודד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיסוף לבבות פונקציונליים / מכות על ידי נתיחה במדריך מהירה מעוברי דג הזברה להשיג mRNA לב ספציפי.
Abstract
הלב העוברי דג הזברה מורכב מרק כמה מאה תאים, המייצג רק חלק קטן של כל העובר. לכן, כדי למנוע transcriptome הלב מלהיות רעול פנים על ידי transcriptome העוברית הגלובלית, יש צורך לאסוף כמות מספקת של לבבות לניתוח נוסף. יתר על כן, כהתפתחות לב דג הזברה ממשיכה במהירות, אוסף לב ושיטות מיצוי RNA צריכים להיות מהיר כדי להבטיח אחידות של הדגימות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה במדריך מהיר לאיסוף לבבות פונקציונליים / מכות מעוברי דג הזברה. זהו תנאים הכרחיים להפקת RNA לב ספציפית שלאחר מכן כדי לקבוע את רמות ביטוי גני לב ספציפיות על ידי transcriptome ניתוחים, כגון תגובה בזמן אמת כמותי שרשרת של פולימראז (RT-qPCR). השיטה מבוססת על מאפיינים דבקים ההפרש של הלב העוברי דג הזברה בהשוואה לרקמות אחרות; זה מאפשר לPHY המהירהפרדת sical של לב מרקמת extracardiac על ידי שילוב של הפרעה fluidic כוח הגזירה, סינון בשלבים ואיסוף ידני של לבבות שכותרתו fluorescently מהונדסים.
Introduction
דג הזברה (Danio rerio) נעשתה שימוש נרחב בביולוגיה התפתחותית ללמוד organogenesis in vivo בשל התפתחותה מהירה, שקופה וextrauterine העוברית, בשילוב עם גודל קטן ואת הזמינות של קווי כתב מהונדסים עם ביטוי רקמות הספציפיות של חלבוני ניאון. חוליות קטנות זה היא גם מתאים במיוחד ללמוד פיתוח לב כי חמצון של עובר דג הזברה המוקדם אינו מסתמך על קצב לב וזרימת דם; תכונות אלה אפשרו את האפיון של מספר רב של מוטציות לב וכלי דם 1,2 והדג הזברה היא עכשיו אורגניזם מודל להכרה רחבה ללמוד מחלות לב 3.
ללמוד ביטוי גנים במהלך התפתחות עוברית, תעתיקים מנותחים בדרך כלל על ידי כל הר הכלאה באתר (רוצה) 4, RT-qPCR 5, 6 microarrays, או רצף הדור הבא (RNA-Seq) 7. בעודמאחלים מאפשר ניתוח של מרחב וזמן של ביטוי גנים בכל העובר, רמות תמליל בדרך כלל הוערכו על ידי RT-qPCR, microarrays או גישות RNA-Seq. עם זאת, שיטות אלו דורשות העשרת רקמה לפרופיל ביטוי גנים ספציפי.
מאז הלב העוברי דג הזברה מייצג חלק קטן מכל העובר, מחקרי transcriptome במהלך התפתחות לב דורשים פרוטוקול לנתיחה והעשרה של לבבות. בנוסף, כדי לקבל נתונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, חשוב לשמור על רקמת הלב מתפקדת במלואה עד מיצוי RNA. כאן, אנו מתארים פרוטוקול למהירות בידוד מבחינה פיזיולוגית נורמלי ולבבות פועמים ממאה עוברי דג הזברה להשיג דגימות RNA באיכות גבוהה ביעילות לניתוח נוסף. השיטה הנוכחית מתבססת על הפרוטוקול שדווח על ידי ברנס וMacRae, 2006 8. להעשרת רקמת לב, שתי השיטות להשתמש בקו כתב שריר לב מהונדסולנצל את תכונות הידבקות ההפרש של לב עוברי דג הזברה לעומת רקמות אחרות. בקצרה, על ידי pipetting עוברים רבים מעלה ומטה באמצעות פיפטה קצה צר, לבבות משתחררים בו-זמנית מגופים עובריים ולאחר מכן הופרדו מעוברית פסולת בשני שלבי סינון מהירים; לבבות שכותרתו fluorescently מכן מסודרים באופן ידני מפסולת שנותרה ושנאספו לעיבוד נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה כדלקמן הנחיות טיפול בבעלי החיים של החוק הגרמני ומדינת ברלין; טיפול דג הזברה היה פיקוח על ידי הרשות המקומית להגנה על בעלי חיים (LaGeSo, ברלין-ברנדנבורג).
1. קבלת עוברי דג הזברה ללב Extraction
- דג הזברה צלב לב כתב כגון Tg (myl7: EGFP) twu34 קו מהונדס 9 על מנת לקבל עוברים עם ביטוי לב ספציפי GFP.
- שמור את העוברים במי ביצה על 28.5 מעלות צלזיוס עד השלב העוברי הרצוי 10,11. ודא שאוכלוסיית העובר שנאסף היא הומוגנית מבחינה גנטית והן על ידי שלב ההתפתחותי להגביל שינויים בביטוי גנים.
- Dechorionate את העוברים באופן ידני.
2. לבבות עובריים דג הזברה ביתור
הערה: שמור את כל הפתרונות על קרח. במידת האפשר, לעשות עבודת צוות: אדם אחד מנתח את לבם מEMBryos ואילו אדם אחר ממיין את לבם תחת סטראו הקרינה. זה מאפשר העיבוד של כמה מאות עוברים בכמה שעות.
- העבר כ -100 עוברים לתוך צינור 1.5 מיליליטר צנטריפוגה. להרדים את העוברים עם tricaine (0.16 מ"ג / מיליליטר במדיום E3). המשיכו פעם אחת את העוברים בבירור מורדמים (הם לא יודעים לשחות ומשקעים לחלק התחתון של הצינור, אבל בלבם עדיין מכה).
- הסר את הפתרון / E3 tricaine ולשטוף את העוברים פעם אחת עם L-15/10% בינוניים FBS 1 מ"ל ולשמור על קרח.
הערה: הבינוני FBS L-15/10% חשוב לשמור איברים ותאי חיים במהלך ההליך כולו לנתיחה עד הלב הועבר לRNAlater או Trizol. - הוספת L-15/10% בינוניים FBS 1 מיליליטר לעוברים ופיפטה למעלה ולמטה 5-8 פעמים עם טעינת ג'ל טיפ עגול עד החלמון משתבש לחלוטין. פיפטה עוברי ירידה מבחינת על פני השטח של הפתרון, כך שהירידה תתפוצץ והעוברים הם שיבשו בעדינות.
הערה: כיצד מרץ ובאיזו תדירות יש לי העוברים להיות pipetted למעלה ולמטה תלוי בשלב ההתפתחותי של העוברים, יש צורך בכלומר יותר pipetting בשלבים מאוחר (למשל בגיל 56 hpf). - למנה הראשונה של עוברים גזורים, להעריך את היושרה של העוברים וחלקם של לבבות גזורים תחת סטראו, שכן חלק לבבות עשויים להישאר מחובר לעוברים אם pipetted מדי בעדינות. התאם את אופן pipetting לסיבובים הבאים של נתיחה בהתאם.
הערה: השתמש בעצות פיפטה השמירה נמוכות וצינורות microcentrifuge כדי למזער את לב דבק הפלסטי. - החל המדגם על מסנן 100 מיקרומטר מונח על שפופרת 50 מיליליטר צנטריפוגה; לשטוף את צינור 1.5 מיליליטר עם מדיום FBS L-15/10% מיליליטר 1 ולאחר מכן ליישם את זה למסנן כדי להקטין את איבוד של המדגם (כמה לבבות אפשר להידבק לקירות של הצינור). שטוף את המסנן פעמיים עם 1 מיליליטר L-15 / 10% FBS. בשלב זה את לבם עובר דרך המסנן ונאסף בצינור 50 מיליליטר.
- החל הזרימה דרך על מסנן 30 מיקרומטר ממוקם על צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר ולשטוף את המסנן פעם אחת עם 1 מיליליטר L-15/10% בינוניים FBS. בשלב הסינון השני, הלב נשמרים במסנן והפסולת קטנה היא לשטוף.
- הפעל את המסנן הפוך ולשטוף את הלבבות מתוך המסנן לתוך 1% צלחת פטרי מצופה agarose על ידי יישום שלושה שוטף רצוף עם FBS L-15/10% 1 מיליליטר.
- באופן ידני להפריד לבבות GFP חיובי מפסולת nonfluorescent העוברית (למשל עדשות העין) עם זוג המלקחיים תחת סטראו הקרינה ולרכז אותם במרכז הצלחת. לאסוף אותם על פי שלב 3.
הערה: אם העוברים הם בנים יותר מ 24 hpf, הלב צריך להיות מכות, מצביע על כך שהרקמות עדיין מבחינה פיזיולוגית נורמליות.
3. בידוד mRNA מDissecלבבות טד
- לאסוף את הלבבות בהיקף הקטן ביותר האפשרי (למשל 10 μl) וטפטף לתוך צינור 1.5 מיליליטר מכיל 0.75 מיליליטר RNAlater (על קרח). ודא שאין לבם להישאר בקצה פיפטה על ידי הצגתו תחת סטראו הקרינה.
- לחלופין, אם מכסה המנוע כימי זמין בסביבתו הקרובה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי, להעביר את לבם נאסף לתוך Trizol (זהירות) מתחת למכסת המנוע הכימי. זה עוקף את האובדן האפשרי של לבבות דבק בקצה פיפטה וגם במהלך צנטריפוגה של הלב (שלבים 3.4, 3.5 ו -3.7). בריכת הלבבות מכמה סיבובים של בידוד לתוך הצינור עם Trizol ולעבור ישירות לשלב 3.8; הנפח הסופי לא יעלה על 10% מהמקורי Trizol הנפח.
הערה: קרא את גיליון Trizol נתונים על בטיחות חומרים (MSDS) לפני השימוש. ידית מגיב Trizol מתחת למכסת מנוע ובלאי מומלץ ציוד מגן אישי. יש להימנע ממגע עם עור, עיניים וclothing. הסר את כל מקורות הצתה. - בריכת לבבות מכמה סיבובים של בידוד לתוך הצינור עם RNAlater (על קרח), כיעילות של בידוד RNA משתפרת עם כמות הרקמה שנאספו. אם נפח הדגימה הכולל עולה על 10% מRNAlater המקורי הנפח, להשתמש בצינור נוסף עם 0.75 מיליליטר RNAlater לאחסון (על קרח).
- צנטריפוגה הדגימות ב15,700 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C משקע הלבבות.
- תחת סטראו הקרינה, לאסוף בזהירות כמה שיותר supernatant ככל האפשר לתוך 1% צלחת פטרי מצופה agarose המכילה L-15/10% בינוניים FBS 3 מיליליטר, אבל לא להפריע את לבם משקע בחלק התחתון של צינור צנטריפוגה. מאז עד 15% מהלב יכולים להישאר בsupernatant בשל הצמיגות הגבוהה של RNAlater, לשלוף אותם כמתואר בשלב 3.7.
- מתחת למכסת מנוע כימי, להוסיף 0.5 מיליליטר Trizol לצינור המכיל את לבם משקעים ולשמור על קרח.
- תחת microsco הניאוןPE, להעביר את לבם (משלב 3.5) מהצלחת מצופה agarose 1% המכיל את פתרון FBS RNAlater / L-15/10% למנה אחרת מצופה agarose 1% עם FBS L-15/10% 3 מיליליטר לדלל את RNAlater. לאסוף את הלב במרכז צלחת פטרי ולהעביר אותם בנפח קטן לתוך הצינור של לבבות משקעים בTrizol מתחת למכסת מנוע כימית.
- מערבולת צינור 1.5 מיליליטר המכיל את הלבבות בTrizol לשבש את לבם ואת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר.
- מתחת למכסת מנוע כימי, להוסיף כלורופורם 100 μl (זהירות), ומערבב היטב ולהעביר את הפתרון / כלורופורם Trizol לצינור 1.5 מיליליטר PLG-הסתחרר מראש (צנטריפוגות 30 שניות במהירות המרבית לפני השימוש). דגירה של 3 דקות בטמפרטורת חדר.
הערה: קראו את MSDS כלורופורם לפני השימוש. ידית מגיב כלורופורם מתחת למכסת מנוע ובלאי מומלץ ציוד מגן אישי. יש להימנע ממגע עם עור, עיניים ובגדים. הרחק מincompatibles כגון מתכות, בסיסים. - Centrifuge המדגם ב15,700 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C ולהעביר את השלב המימי לתוך צינור 1.5 מיליליטר חדש.
- להוסיף 5-10 גליקוגן מיקרוגרם ו -250 μl precooled (ב -20 ° C) isopropanol; מערבב היטב ודגירה במשך הלילה ב -20 ° C.
- צנטריפוגה המדגם ב15,700 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant.
- שטוף את הכדור עם 1 מיליליטר אתנול 75%, צנטריפוגות ב 15,700 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant.
- בואו להתאדות אתנול על ידי ייבוש גלולה בטמפרטורת חדר עד שהוא הופך לבנה (לדוגמא במשך 10-15 דקות).
- להוסיף DDH RNase ללא 20 μl 2 O לגלולה ודגירה של 10-15 דקות ב 55 ° C לפזר RNA; אז לשמור על קרח.
- להעריך את ריכוז RNA וטהרה על ידי מדידת הספיגה. להעריך את שלמות RNA על ידי הפעלת המדגם על 1% agarose ג'ל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן אנו מתארים ניסוי נתיחת לב נציג באמצעות דג הזברה Tg (myl7: GFP) twu34 קו מהונדס 9, המבטא את החלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) אך ורק בתוך שריר הלב (איור 1).. אספנו שני לבבות גזורים ועובר ממנה הם נגזרו על מנת להעריך את טוהר של מדגם הלב. בקצרה, Tg הומוזיגוטים (myl7: GFP) דג הזברה twu34 9 היו outcrossed עם wild-type, כך שכל הלבבות העובריים תויגו GFP. 500 עוברים כמה (56 hpf) הועברו לתוך צינורות 1.5 מיליליטר (כ. 100 עוברים בכל אחד) (איור. 1A1, 1B). כל צינור היה מעובד כמתואר בסעיף Protocol (שלב 2) ובאיור 1 א. לבבות שוחררו על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים (איור. 1A2) ולאחר מכן להחיל על מסנן 100 מיקרומטר (איור. 1A3). חתיכות גדולות של רקמה עוברית נשמרו במסנן זה; חלק זה יוחזר ולשים בTrizol foהפקת RNA r להשיג "עובר ללא לב" מדגם RNA (איור. 1A3). הזרימה דרך מכילים לבבות היה לאחר מכן להחיל על מסנן 30 מיקרומטר (איור. 1A4), אשר שמר את פסולת לב ורקמה בגודל דומה. לבבות GFP החיובי היו סמוקים מהמסנן לצלחת מצופה agarose פטרי (איור. 1A5, 1C), התאסף במהירות באמצע הצלחת תחת stereomicroscope ניאון והועבר ל0.75 מיליליטר RNAlater (איור. 1A6). בתוך הצינור הזה עם RNAlater, אנחנו נקוו לב נגזר מ5 סיבובי דיסקציה (כ. 300 לבבות בין 500 עוברים המייצגים את יעילות מיצוי של כ -60%). השוואה של דגימות לב לפני המיון מהפסולת מעוברים בגיל 56 hpf (איור. 1C) לעומת 36 hpf (איור. 1 ג ') מוצגת באיור 1. בhpf 56, השיבוש של עוברים הניב עוברי יותר פסולת ( כגון עדשות, ראש חץ, איור. 1C) מאשר בגיל 36 hpf הבא צעד סינון 30 מיקרומטר (איור. 1 ג ').
כדי לקבוע את טוהר של מדגם "הלב" 56 hpf, השווינו את רמות הביטוי של לב לעומת תמלילים נוספים-לב ב" לב "ו-" עובר ללא לב "דגימות על ידי RT-qPCR. לשם כך, אנו חילוץ mRNA משתי דגימות אלה והערכנו את איכות RNA על ג'ל agarose (איור 2 א) וכמות ידי מדידת הספיגה (טבלת 1), כמתואר בסעיף הפרוטוקול (שלב 3). כ. 300 לבבות הניבו 660 RNA ng. בשלב הבא, cDNA היה מסונתז באמצעות H M-MLV RNase transcriptase ההפוך (-) וhexamers האקראית בהתאם להוראות Manufacturer's, והניסויים RT-qPCR בוצעו כמתואר 12. רמות ביטוי גנים יחסי חושבו עבור סמני רקמות ספציפיות שונים כגון פוליפפטיד שרירן אור 7 [myl7, סמן שריר לב] 9, קולט תחום הוספת קינאז כמו [kdrl, אנדותל / סמן endocardial] 13, בטא המוגלובין עוברי-1.1 [hbbe1.1, סמן כדורית אדומה] 14, crystallin-אלפא [cryaa, סמן עדשת העין] 15, וחלבון fibrillary גליה חומצי [GFAP, סמן מערכת עצבים מרכזי] 16 (איור 2). גורם ייזום תרגום דג הזברה אוקריוטים 1B [eif1b] 12 שימש כגן התייחסות פנימי (ראה טבלה 2 למספרי GenBank ID, רצפי פריימר, גדלי מוצר PCR וסגוליות רקמה עבור כל גן). כצפוי, myl7 היה מועשר במדגם "הלב" בהשוואה ל" העובר ללא לב "מדגם (איור. 2 ב). Kdrl סמן תא אנדותל נמצא להיות מועשר במתינות במדגם הלב, כצפוי (כ -40% מתאי הלב בגיל 56 hpf הם kdrl -expressing תאי endocardial) (איור. 2 ב). Hbbe1.1 הסמן כדורית אדומה היה ייצוג יתר במדגם "הלב", למרות שהלב היה stמכות חולים לאחר נתיחה, שאמור לגרש תאי דם אדומים מהלב (איור. 2 ב). בניגוד לכך, רמות הביטוי של מערכת העצבים המרכזית וסמני עדשה (GFAP וcryaa, בהתאמה) היו נמוכות ביותר במדגם "לב" (איור. 2 ב). בסך הכל, אנו מסיקים כי איכות תשואות פרוטוקול נתיחת לב גבוהה וRNA לב ספציפי מעוברי דג הזברה שלמים.
איור חילוץ לב 1. מעוברי דג הזברה. Scheme () המתאר את הליך מיצוי לב. כ -100 עוברים חיים נאספים בצינור 1.5 מיליליטר (A1, B, B '), בהרדמה ולאחר מכן pipetted למעלה ולמטה כמה פעמים דרך קצה צר פיפטה כדי לשחרר את הלב (A2). הפתרון שהתקבל מכיל רקמות העוברית (A2) מוחל אז על מסנן 100 מיקרומטר (A3). רקמות עובריים ללא חלמון וhearts, ופסולת עוברית גדולה יישארו במסנן (A3). הזרימה דרך נאסף בצינור 50 מיליליטר (A3) ולאחר מכן להחיל על מסנן 30 מיקרומטר (A4). הלבבות וקטן פסולת נשמרים במסנן 30 מיקרומטר והועברו לתוך צלחת מצופה agarose קטן פטרי (A5, C, C "). EGFP לב שכותרת (C, C '; חץ) מסודרים באופן ידני מהפסולת שנותרה, כמו עדשות (C, ראש חץ), ונאסף בRNAlater (A6). הליך זה חוזר על עצמו לפחות 5 פעמים וכל הלב הם אספו יחד לעיבוד נוסף. "כיסוי של הקרינה (EGFP בירוק) ודסק"ש תמונות של Tg החי המהונדס (myl7: EGFP) twu34 עוברים על 56 hpf (B, C) ו- 36 hpf (B (BC) ', ג') בשני שלבים של הלב הליך נתיחה: לפני לנתיחת עובר (B, B ') ורק אחרי שטיפה ממסנן 30 מיקרומטר, לפני מיון הלבבות מהפסולת בצלחת פטרי (C, C). בר סולם: 500 מיקרומטר.
איור 2. ניתוח של איכות RNA וטהרה על ידי אלקטרופורזה וRT-qPCR, בהתאמה. () סה"כ RNA ממדגם "לב" (2 μl) ומ" העובר ללא לב "מדגם (μl 1), הנגזר מ56 עוברי hpf, החליטו על 1% agarose ג'ל. להקות הבולטות S18 וS28 rRNA מצביעות על כך שRNAs אינו מושפלים. (B) רמות ביטוי יחסית של myl7 הסמנים ספציפיים רקמה (שריר לב), kdrl (האנדותל), hbbe1.1 (אריתרוציטים), cryaa (עדשה), וGFAP (CNS), כפי שנקבע על ידי RT-qPCR למדגם "לב" מנורמל "העובר ללא לב" מדגם. ניסויי RT-qPCR בוצעו כtriplicates טכני וניתנים נתונים כאמצעי ± SEM. ניתוח מבחן t מזווג בוצע. **** P <0,0001; ** P <0005. נ"ב, זוג בסיס.
| מזהה מדגם | ng / μl | A260 | A280 | 260/280 | 260/230 | סמן שרירי בטן. | 340 גלם |
| לבבות | 32.97 | 0.82 | 0.41 | 2.01 | 0.35 | 2.355 | 0.031 |
| עוברים ללא לבבות | 568.82 | 14.22 | 7.00 | 2.03 | 2.04 | 6.965 | 0.018 |
טבלת 1. כמות ואיכות RNA על ידי מדידת spectrophotometric. הכמות והאיכות של RNA של "הלב" ו- "עובר ללא לב" דגימות שהתקבלו מ -56 hpf עוברים כפי שהיא נמדדת על ידי spectrophotometry.
| gene | # GenBank | רצף פריימר | גודל מוצר ה- PCR (נ"ב) | סמן רקמות ספציפיות |
| myl7 | BX248505 | F: 5'-ACAGCAAAGCAGACAGTGAA-3 " | 163 | שריר לב |
| R: 5'-TAACTCCATCCCGGTTCTGA-3 " | ||||
| kdrl | CR759732 | F: 5'-ACAACGACACTGGCATCTAC-3 " | 170 | האנדותל / endocardium |
| R: 5'-TGTTCTACAGGGGACCACAA-3 " | ||||
| GFAP | BX324157 | F: 5'-AGACAACTTGGCCTCAGAC-3 " | 247 | מערכת עצבים מרכזית |
| R: 5'-ATCCACATGAACCTGTTGGG-3 " | ||||
| cryaa | BX248514 | 190 | עדשת העין | |
| R: 5'-TCAGACCTCACCTCAGAGAC-3 " | ||||
| hbbe1.1 | BC095024 | F: 5'-TGGTTGTGTGGACAGACTTCGA-3 '8 | 102 | כַּדוּרִית אֲדוּמָה |
| R: 5'-CGATAAGACACCTTGCCAGAGC-3 '8 | ||||
| eif1b | BX323079 | F: 5'-CAGAACCTCCAGTCCTTTGATC-3 '12 | 195 | גן התייחסות |
| R: 5'-GCAGGCAAATTTCTTTTTGAAGGC-3 '12 |
Primers הטבלה 2. משמש לניסויי RT-qPCR. שם, מספר הצטרפות GenBank, רצף, גדלי מוצר PCR ורקמות-סגוליות מוצגים לכל הגנים ניתחו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מאפשר להעשרה המהירה של רקמת לב עוברית דג הזברה לביטוי גני מנתח. הכמות והאיכות של מדגם RNA לב הספציפי מאוד תלויה במספר צעדים חיוניים: ראשון, כמות המדגם הוא השתפר מאוד אם אובדן הלבבות נמנע בכל שלב של הפרוטוקול, מאז טיהור RNA תעבוד רק עם מספיק חומר מוצא. שנית, את הטוהר של המדגם, שתלוי לחלוטין בניסוי, נקבע על ידי מיון ואיסוף לבבות בתוך צלחת פטרי תוך הדרה מוחלטת רקמות אחרות. שלישי, איכות מדגם ביקורתית תלויה בהגבלת השפלה RNA שיכול להתרחש על שיבוש של העוברים; זו מושגת על ידי שימוש במדיום תרבית תאים, כדי למנוע מוות של תאים ועל ידי שמירה על הדגימות על קרח. השפלה RNA הוא נעצר פעם אחת את לבם הועבר לRNAlater או Trizol. שהלבבות פועמים בצלחת פטרי מדגים בעוצמה שלא לבהבעיה היא פיזיולוגי נורמלית לאחר ניתוח.
אנו ממליצים להתחיל עם לפחות 300 לבבות (כלומר סביב 500 עוברים), שממנו מספיק RNA יכול בבטחה זירז (יחד עם 5-10 גליקוגן מיקרוגרם). עם זאת, אנחנו לא יכולים להוציא יותר מפחות לבבות יספיקו לניסויים בקנה מידה קטנה. זה פשוט חשוב שיהיה RNA מספיק כדי לקבוע את הריכוז, טוהר ויושר של המדגם. אנא, שימו לב כי תוכן RNA יכול להשתנות בהתאם לשלב ההתפתחותי ועל הרקע הגנטי של העובר (למשל במקרה של מוטציות עם לב נורמלי). לפיכך, הסכום המינימלי של עוברים הנדרשים לניסוי יצטרך להיקבע בכל מקרה ומקרה.
ישנם הבדלים טכניים בין כמה פרוטוקול זה ופרוטוקול קודם לכן על ידי ברנס וMacRae, ואנחנו לא חושבים שיש הבדל משמעותי ביעילות או במהירות בין שני הפרוטוקולים.עם זאת, יש לנו הצגנו שיפורים: והכי חשוב, אנו מציעים את השימוש בפתרון ייצוב RNAlater. זה חשוב משתי סיבות: ראשית, כדי לאסוף RNA באיכות גבוהה עבור ניסויים נוספים כגון RT-qPCR על ידי הפחתת השפלה RNA למינימום, כRNAlater מנטרל מייד RNases ומייצב RNA בתוך רקמות או תאים. שנית, RNAlater חיוני הלמאפשר את איסוף הלבבות בימים שונים, וזה חשוב כאשר מספר העוברים הוא גורם מגביל. זה גם מאפשר איגום הלב שייתכן שיהיה צורך לקבל כמות מספקת של חומר מוצא לבידוד יעיל של RNA באיכות גבוהה עם Trizol. העברת הלבבות ישירות לתוך Trizol תעקוף את השימוש בRNAlater, עם זאת, בשל סכנות בריאותיות, צעד זה היית צריכה להתבצע מתחת למכסת מנוע כימי, שלא ניתן להניח להיות ממוקם בקרבת הישירה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי לכל הנסיינים .
מצאנו tכובע נתיחת הלב עובדת היטב עם עוברים בין 20-72 hpf [12; נתונים שלא פורסמו במשך 72 hpf]. עם זאת, הליך השאיבה הופך להיות קשה יותר עם עלייה בגיל ואורך עובריים: נוסף וpipetting התקיף יותר נדרש להציג בהצלחה את העוברים לתוך הקצה הארוך ולהפריד את לבם מרקמות עובריים אחרות. כתוצאה מכך, יותר עוברית פסולת נמצאת בתוך הכנת המדגם (ראה איור 1 ג, ג ') והנסיין צריך להיות זהיר יותר במיון הלבבות בצלחת פטרי.
פרוטוקול נתיחת לב שהוצג כאן מאפשר ניתוח של כל פרופיל ביטוי לב סוגי תאים שונים, כוללים שריר לב וendocardium של. הפרדה נוספת של סוגי תאי לב יכולה להיות מושגת על ידי שימוש בקווי endocardial- ושריר לב ספציפי-כתב-[למשל Tg (myl7: GFP) twu34 וTg (kdrl: mCherry is5] 9, 17 להפקת לב בשילוב עם מיון FACS. בניגוד לשיטת תרגום ריבוזום זיקה הטיהור (TRAP) 18,19, המאפשרת ניתוח תעתיק רקמות ספציפיות ללא נתיחת רקמות, הגישה שלנו אינה מוגבלת לmRNAs באופן פעיל-מתורגם אלא גם כוללת mRNAs לא-פעיל-מתורגם או RNAs noncoding. יישום חלופה של הפרוטוקול לנתיחה לב הוא לנתח ביטוי חלבון בתוך לב: ניתן להעריך את רמות חלבון על ידי לוקליזציה כתם והחלבון מערבית יכולות להיות מנותחת על ידי אימונוהיסטוכימיה, כהאנטומיה של הלב נשמרה במהלך ההליך לנתיחה.
לסיכום, אנו מציגים כאן פרוטוקול מפורט ללנתח לבבות פונקציונליים / מכות מתוך מאות עוברים בזמן קצר, אשר יכול לשמש לקבלת דגימות לב ספציפי RNA (או חלבון) של טוהר גבוה לניתוח נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment for raising fish and collecting eggs | see the Zebrafish Book11 for details | ||
| Fluorescence stereomicroscope | |||
| Refrigerated Microcentrifuge | |||
| UV-Spectrophotometer | e.g. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Nucleic acid electrophoresis chamber | |||
| Petri dishes 4 cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium | |||
| Micropipettes and tips (P20, P100, P1000) | |||
| 1.5 ml centrifugation tubes | |||
| 15 ml and 50 ml centrifugation tubes | |||
| Pair of Dumont #5 forceps | |||
| ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Phase lock gel, heavy, 1.5 ml tubes | Prime | 2302810 | |
| Egg water medium | 60 μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue | ||
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | ||
| Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 mg/ml Tricaine stock solution, pH 7 |
| 1% agarose (in E3 medium) | |||
| 1% agarose gel (in TBE buffer) | |||
| Leibovitz´s L-15 medium | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 µg/µl in RNase-free water |
| chloroform | |||
| isopropanol | |||
| 75% ethanol (in DEPC-ddH2O) | |||
| Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O | |||
| Nucleic acid loading buffer | |||
| TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis |
References
- Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
- Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish. Development. 123, 293-302 (1996).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends Genet. 10, 73-74 (1994).
- Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001 (1996).
- Epstein, C. B., Butow, R. A. Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).
- Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics. OMICS. 18, 98-110 (2014).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. Biotechniques. 40, 274-278 (2006).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th, University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Veerkamp, J., et al. Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry). Dev Cell. 24, 660-667 (2013).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Brownlie, A., et al.
- Marvin, M., et al. Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins. Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).
- Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain. Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
- Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
