Summary
Cardiale genexpressie profielen te analyseren tijdens zebravis ontwikkeling van het hart, heeft totaal RNA worden geëxtraheerd uit geïsoleerde harten. Hier presenteren we een protocol voor het verzamelen van functionele / kloppende harten door snelle handmatige dissectie van de zebravis embryo's tot cardiale-specifieke mRNA te verkrijgen.
Abstract
De zebravis embryonale hart is samengesteld uit slechts een paar honderd cellen, die slechts een klein deel van de gehele embryo. Daarom, om de cardiale transcriptoom van wordt gemaskeerd door het wereldwijde embryonale transcriptoom voorkomen, moet voldoende harten voor verdere analyse te verzamelen. Zoals zebravis hartontwikkeling snel verloopt, hart inzameling en RNA winningsmethoden moet snel zijn om de homogeniteit van de monsters te verzekeren. Hier presenteren we een snelle handleiding dissectie protocol voor het verzamelen van functionele / kloppende harten van de zebravis embryo's. Dit is een essentiële voorwaarde voor verdere cardiaal-specifieke RNA-extractie cardiale genexpressie te bepalen door transcriptoom analyse, zoals kwantitatieve real-time polymerase-kettingreactie (RT-qPCR). De methode is gebaseerd op differentiële klevende eigenschappen van de zebravis embryonale hart in vergelijking met andere weefsels; Dit maakt een snelle PHYsieke scheiding van cardiale van extracardiale weefsel door een combinatie van vloeibare dwarskracht verstoring stapsgewijze filtratie en handmatige verzameling van transgene fluorescent gelabelde harten.
Introduction
Zebravis (Danio rerio) wordt veel gebruikt in ontwikkelingsbiologie in organogenese in vivo te bestuderen vanwege zijn snelle, transparante en buitenbaarmoederlijke embryonale ontwikkeling, in combinatie met de geringe omvang en de beschikbaarheid van transgene reporter lijnen met weefsel-specifieke expressie van fluorescerende eiwitten. Dit kleine gewervelde is bijzonder geschikt voor hartontwikkeling studeren, omdat oxygenatie van de vroege zebravis embryo niet afhankelijk hartslag en bloedstroom; Deze functies zijn toegelaten de karakterisering van grote aantallen cardiovasculaire mutanten 1,2 en de zebravis is nu algemeen erkend modelorganisme hartziekten 3 bestuderen.
Om de genexpressie te bestuderen tijdens de embryonale ontwikkeling, zijn transcripties vaak geanalyseerd door geheel-mount in situ hybridisatie (WISH) 4, RT-qPCR 5, microarrays 6, of next generation sequencing (RNA-Seq) 7. TerwijlWISH kan een ruimtelijk-temporele analyse van genexpressie in het gehele embryo worden transcript niveaus gewoonlijk bepaald door RT-qPCR, microarrays of RNA-Seq benaderingen. Deze werkwijzen vereisen weefsel verrijking voor genexpressie profilering.
Omdat het zebravis embryonale hart slechts een klein deel van de gehele embryo, transcriptoom studies gedurende cardiale ontwikkeling vereist een protocol voor dissectie en verrijking van harten. Bovendien fysiologisch relevante gegevens te verkrijgen, is het belangrijk om de cardiale weefsel volledig functioneel tot RNA-extractie behouden. We beschrijven hier een protocol voor het snel isoleren fysiologisch normaal en kloppende harten van honderden zebravis embryo's van hoge kwaliteit RNA monsters efficiënt te krijgen voor verdere analyses. De onderhavige werkwijze is gebaseerd op het protocol beschreven door Burns en MacRae, 2006 8. Voor verrijking van hartweefsel beide methoden een transgene myocardiale reporter lijnen profiteer van de differentiële hechting eigenschappen van de zebravis embryonale harten versus andere weefsels. Kort pipetteren veel embryo en neer door een smalle pipetpunt, harten gelijktijdig vrijkomen uit embryonale organen en vervolgens gescheiden uit embryonale puin in twee stappen snel filtreren; fluorescent gelabelde harten worden vervolgens handmatig gesorteerd blijft vuil en verzameld voor verdere verwerking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol volgt de verzorging van dieren richtlijnen van de Duitse en Berlijn staat de wet; zebravis administratiekosten werd gecontroleerd door de lokale autoriteiten voor de bescherming van dieren (LaGeSo, Berlin-Brandenburg).
1. Het verkrijgen van zebravis embryo's voor Hart Extraction
- Kruis cardiale reporter zebravis, zoals de Tg (myl7: EGFP) twu34 transgene lijn 9 om embryo's te verkrijgen met hart-specifieke GFP expressie.
- Handhaving van de embryo's in ei water bij 28,5 ° C tot de gewenste embryonale fase 10,11. Zorg ervoor dat de verzamelde embryo bevolking homogeen is zowel genetisch en door ontwikkelingsstadium om variaties in genexpressie te beperken.
- Dechorionate de embryo's handmatig.
2. Ontleden de zebravis embryonale Hearts
OPMERKING: Houd alle oplossingen op het ijs. Indien mogelijk, doe teamwork: één persoon ontleedt de harten van de EMBzelfgerolde sigaretten toe terwijl een ander sorteert de harten onder de fluorescentie stereomicroscoop. Dit maakt de verwerking van verscheidene honderden embryo's in een paar uur.
- Breng ongeveer 100 embryo's in een 1,5 ml centrifugebuis. Verdoven de embryo's met tricaïne (0,16 mg / ml in medium E3). Tijd na de embryo duidelijk verdoofd (en niet zwemmen en sediment naar de bodem van de buis, maar hun hart nog kloppen).
- Verwijder de tricaïne / E3 oplossing en was het embryo eenmaal met 1 ml L-15/10% FBS medium en op ijs handhaven.
OPMERKING: De L-15/10% FBS medium belang organen en cellen in leven gedurende de gehele dissectie totdat de harten werden overgebracht naar RNAlater of Trizol. - Voeg 1 ml L-15/10% FBS medium om de embryo's en pipet op en neer 5-8 keer met een Round Gel Laden Tip totdat de dooier volledig wordt verstoord. Pipetteer de embryo druppelsgewijs op het oppervlak van de oplossing, zodat de druppel barsten ende embryo's worden voorzichtig verstoord.
OPMERKING: Hoe krachtig en hoe vaak de embryo's hebben om te worden gepipetteerd en neer hangt af van het ontwikkelingsstadium van het embryo, dat wil zeggen meer pipetteren nodig is op de late stadia (bijvoorbeeld bij 56 HPF). - Voor de eerste partij ontleed embryo, beoordeelt de integriteit van het embryo en de hoeveelheid ontleed harten onder een stereomicroscoop, aangezien sommige harten blijven aan het embryo als ook voorzichtig gepipetteerd. Pas de wijze van pipetteren de volgende rondes van dissectie dienovereenkomstig.
OPMERKING: Gebruik een lage retentie pipet tips en microcentrifugebuisjes om de harten vast te houden aan het plastic te minimaliseren. - Breng het monster op een 100 um filter geplaatst op een 50 ml centrifugebuis; Spoel 1,5 ml buis met 1 ml L-15/10% FBS medium en breng dit op de filter om verlies van monster te minimaliseren (sommige harten kunnen kleven aan de wanden van de buis). Was het filter tweemaal met 1 ml L-15 / 10% FBS. In deze stap het hart door het filter en worden verzameld in de 50 ml buis.
- Breng de doorstroming op een 30 urn filter geplaatst op een 15 ml centrifugebuis en spoel de filter eenmaal met 1 ml L-15/10% FBS medium. In deze tweede filtratiestap, worden de harten vastgehouden in de filter en kleinere vuil wordt weggespoeld.
- Draai het filter ondersteboven en spoel de harten uit de filter in een 1% agarose gecoate petrischaal door toepassing van drie opeenvolgende wassingen met 1 ml L-15/10% FBS.
- Handmatig scheiden GFP-positieve harten van de fluorescent embryonale vormt (zoals ooglenzen) met een pincet onder een fluorescentie stereomicroscoop en ze te concentreren in het midden van de schaal. Verzamel ze volgens stap 3.
OPMERKING: Als de embryo's ouder zijn dan 24 HPF, moet de harten te kloppen, wat aangeeft dat de weefsels nog fysiologisch normaal.
3. Het isoleren van mRNA uit Dissected Hearts
- Verzamel de harten in het kleinst mogelijke volume (bijvoorbeeld 10 pi) en pipet in een 1,5 ml buis met 0,75 ml RNAlater (op ijs). Controleer of er geen harten blijven in de pipet door het bekijken van het onder een fluorescentie stereomicroscoop.
- Als alternatief, als een chemische kap is verkrijgbaar in de onmiddellijke nabijheid van de fluorescentie microscoop, de overdracht van de verzamelde harten tot Trizol (LET) onder de chemische motorkap. Dit omzeilt het mogelijke verlies van harten steken in de pipet tip en ook tijdens het centrifugeren van de harten (stappen 3.4, 3.5 en 3.7). Bundelen de harten van verschillende rondes van isolatie in dezelfde buis met Trizol en ga direct naar stap 3.8; het eindvolume niet meer dan 10% van het oorspronkelijke TRIzol volume.
LET OP: Lees de Trizol Material Safety Data Sheet (MSDS) voor gebruik. Handvat Trizol reagens onder een kap en slijtage persoonlijke veiligheidsuitrusting is aanbevolen. Contact met de huid, ogen en clothi voorkomenng. Verwijder alle ontstekingsbronnen. - Verzamel de harten van verscheidene rondes van isolatie in dezelfde buis met RNAlater (op ijs), de efficiëntie van RNA isolatie verbetert de hoeveelheid weefsel verzameld. Als de totale steekproef volume van meer dan 10% van de oorspronkelijke RNAlater volume, gebruik dan een extra buis met 0,75 ml RNAlater voor opslag (op ijs).
- Centrifugeer de monsters bij 15.700 xg gedurende 20 min bij 4 ° C om de harten sedimenteren.
- Onder een fluorescentie stereomicroscoop, verzamel voorzichtig zoveel supernatant mogelijk in een 1% agarose gecoate petrischaal die 3 ml L-15/10% FBS medium, maar de gesedimenteerde harten niet verstoren de bodem van de centrifugebuis. Aangezien tot 15% van de harten in de supernatant blijven vanwege de hoge viscositeit van RNAlater, halen ze als beschreven in stap 3.7.
- Onder een chemische motorkap, voeg 0,5 ml Trizol aan de buis met het bezonken harten en blijf op ijs.
- Onder de fluorescerende Micrpe, breng de harten (uit stap 3.5) van de 1% agarose gecoate schaaltje met het RNAlater / L-15/10% FBS oplossing in een 1% agarose gecoate schaal met 3 ml L-15/10% FBS te verdunnen uit de RNAlater. Verzamel de harten in het midden van de petrischaal en overbrengen in een klein volume in de buis gesedimenteerd harten in Trizol onder een chemische kap.
- Vortex 1,5 ml buis met de harten in Trizol het hart verstoren en incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
- Onder een chemische motorkap, voeg 100 ul chloroform (LET), meng en breng de Trizol / chloroform oplossing in een 1,5 ml voorgevulde gesponnen PLG buis (centrifuge 30 sec bij maximale snelheid voor gebruik). Incubeer gedurende 3 min bij kamertemperatuur.
LET OP: Lees de chloroform MSDS voor gebruik. Handvat chloroform reagens onder een kap en slijtage persoonlijke veiligheidsuitrusting is aanbevolen. Vermijd contact met de huid, ogen en kleding. Uit de buurt van onverenigbare houden zoals metalen, basen. - Centrifugalege het monster bij 15.700 xg gedurende 15 min bij 4 ° C en breng de waterige fase naar een nieuwe buis van 1,5 ml.
- Voeg 5-10 gg glycogeen en 250 pl voorgekoeld (bij -20 ° C) isopropanol; Meng goed en incubeer overnacht bij -20 ° C.
- Centrifugeer het monster bij 15.700 xg gedurende 30 min bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof.
- Was de pellet met 1 ml 75% ethanol, centrifugeer bij 15.700 xg gedurende 15 min bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof.
- Laat het ethanol verdampen door drogen de pellet bij kamertemperatuur totdat deze wit (bijv 10-15 min).
- Voeg 20 ul RNase-free DDH 2 O tot de pellet en incubeer gedurende 10-15 min bij 55 ° C om het RNA te lossen; dan blijven op ijs.
- Beoordeel de RNA-concentratie en zuiverheid door absorptie meting. Beoordeel de RNA integriteit door het uitvoeren van het monster op een 1% agarosegel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We beschrijven hier een representatief hart dissectie experiment met behulp van de zebravis Tg (myl7: GFP) twu34 transgene lijn 9, die groen fluorescerend eiwit (GFP) drukt uitsluitend binnen het myocard (afb. 1). We verzamelden zowel ontleed hart en de embryo's waarvan ze zijn afgeleid om de zuiverheid van het hart monster beoordelen. In het kort, homozygote Tg (myl7: GFP) twu34 zebravis 9 werden outcrossed met wild-type, zodat alle embryonale harten werden GFP geëtiketteerd. Ongeveer 500 embryo's (56 HPF) werden overgebracht naar 1,5 ml buisjes (ong. 100 embryo's per) (fig. 1A1, 1B). Elke buis werd verwerkt zoals beschreven in de paragraaf Protocol (stap 2) en in figuur 1A. Harten werden vrijgegeven door en neer te pipetteren meerdere malen (figuur 1A2.) En daarna aangebracht op een 100 pm (fig. 1A3). Grote stukken van embryonaal weefsel werden behouden in dit filter; Deze fractie werd opgehaald en gebracht in Trizol for RNA-extractie om een "embryo zonder hart" RNA-monster (afb. 1A3) te verkrijgen. De doorstroom bevattende hart werd vervolgens aangebracht op een 30 urn (fig. 1A4), die de harten en weefselafval van vergelijkbare grootte behouden. GFP-positieve harten werden gespoeld uit de filter in een met agarose gecoate petrischaal (fig. 1A5, 1C), snel verzameld in het midden van de schotel onder een fluorescerende stereomicroscoop en overgebracht in 0,75 ml RNAlater (fig. 1A6). Binnen deze buis met RNAlater we samengevoegd hart verkregen uit 5 dissectie rondes (ong. 300 harten van 500 embryo's die een extractie-efficiëntie van ongeveer 60%). Een vergelijking van het hart monsters voorafgaande aan het sorteren van afval van embryo op 56 hpf (fig. 1C) versus 36 HPF (fig. 1C) wordt getoond in figuur 1. 56 HPF, verstoring van embryo leverde meer embryonale vuil ( zoals lenzen, pijlpunt, Fig. 1C) dan 36 hpf na 30 urn filtratie (fig. 1C).
Om de zuiverheid van de 56 HPF "hart" monster te bepalen, vergeleken we de expressie van cardiale versus extra-cardiale transcripten in "hart" en "embryo zonder hart" monsters door RT-qPCR. Daartoe we geëxtraheerd mRNA van deze twee monsters en beoordeeld RNA kwaliteit op een agarosegel (Figuur 2A) en hoeveelheid absorptiemeting (Tabel 1) zoals beschreven in de paragraaf protocol (stap 3). De ca. 300 harten leverde 660 ng RNA. Vervolgens werd cDNA gesynthetiseerd met M-MLV reverse transcriptase RNase H (-) en willekeurige hexameren volgens de instructies van de fabrikant en RT-qPCR experimenten werden uitgevoerd zoals beschreven 12. Relatieve genexpressie niveaus werden berekend voor verschillende weefsel-specifieke merkers zoals myosine lichte polypeptide 7 [myl7, een myocard marker] 9, kinase insert domein receptor zoals [kdrl, een endotheliale / endocardiale marker] 13, hemoglobine beta embryonale-1.1 [hbbe1.1, een erythrocyt marker] 14, crystalline-alfa A [cryaa, een ooglens marker] 15, en gliale fibrillaire zuur eiwit [GFAP, een centraal zenuwstelsel marker] 16 (figuur 2B). De zebravis eukaryotische translatie initiatie factor 1B [eif1b] 12 werd gebruikt als een interne referentie gen (zie Tabel 2 voor GenBank ID-primersequenties, PCR product afmetingen en weefselspecificiteit voor elk gen). Zoals verwacht, werd myl7 sterk verrijkt in het "hart" steekproef in de "embryo zonder hart" sample (fig. 2B). De endotheelcel merker kdrl bleek matig worden verrijkt in het hart monster, zoals verwacht (ongeveer 40% van de hartcellen 56 hpf worden kdrl expressie brengen endocardiale cellen) (Figuur 2B.). De erytrocyten marker hbbe1.1 oververtegenwoordigd was in het "hart" sample, hoewel de harten waren stziek afstraffing na de sectie, die rode bloedcellen moeten verdrijven uit het hart (Fig. 2B). In tegenstelling, de expressieniveaus van het CZS en lens markers (respectievelijk GFAP en cryaa,) waren zeer laag in het "hart" sample (fig. 2B). Al met al kunnen we concluderen dat het hart dissectie protocol levert hoge kwaliteit en cardiaal-specifieke RNA uit hele zebravis embryo's.
Figuur 1. Hart extractie uit zebravis embryo's. (A) Regeling beeltenis van het hart extractie procedure. Ongeveer 100 levende embryo's worden opgevangen in een 1,5 ml buis (A1, B, B '), verdoofd en vervolgens op en neer gepipetteerd verscheidene keren over een smalle pipet tip om de harten los (A2). De resulterende oplossing die de embryonale weefsels (A2) wordt vervolgens aangebracht op een 100 pm filter (A3). Embryonale weefsels zonder dooier en hearts, en grote embryonale puin blijven in het filter (A3). De doorstroom wordt in een 50 ml buis (A3) verzameld en vervolgens aangebracht op een 30 urn filter (A4). De harten en gruis worden vastgehouden in de 30 urn filter en overgebracht in een kleine-agarose gecoate petrischaal (A5, C, C '). EGFP gelabeld harten (C, C "; pijl) worden handmatig gesorteerd van de overige afval, zoals lenzen (C, pijlpunt) en verzameld in RNAlater (A6). Deze procedure wordt ten minste 5 keer herhaald en alle harten worden samengevoegd voor verdere verwerking. (BC) Overlay van fluorescentie (EGFP in groen) en DIC beelden van de live transgene Tg (myl7: EGFP) twu34 embryo op 56 HPF (B, C) en 36 HPF (B ', C') op twee stappen van het hart dissectie procedure: voorafgaand aan de embryo dissectie (B, B ') en net na het spoelen van de 30 pm filter, voorafgaand aan het sorteren van de harten van het puin in de petrischaal (C, C'). Schaal bar: 500 micrometer.
Figuur 2. Analyse van RNA kwaliteit en zuiverheid door respectievelijk elektroforese en RT-qPCR,. (A) Totaal RNA van het "hart" monster (2 pi) en van de "embryo zonder hart" monster (1 pl), afgeleid van 56 HPF embryo, gescheiden op een 1% agarosegel. Prominente S18 en S28 rRNA bands geven aan dat RNA's niet worden afgebroken. (B) relatieve expressieniveaus van de weefselspecifieke merkers myl7 (myocardium), kdrl (endotheel), hbbe1.1 (erytrocyten), cryaa (lens) en GFAP (CNS) zoals bepaald met RT-qPCR voor het "hart" sample genormaliseerd naar de "embryo zonder hart" monster. De RT-qPCR experimenten werden uitgevoerd zoals technische triplo's en gegevens worden gegeven als gemiddelden ± SEM. Een ongepaarde t-test-analyse werd uitgevoerd. **** P <0,0001; ** P <0,005. bp, basenparen.
| monster ID | ng / ul | A260 | A280 | 260/280 | 260/230 | cursor abs. | 340 ruwe |
| harten | 32.97 | 0.82 | 0,41 | 2.01 | 0.35 | 2.355 | 0,031 |
| embryo's zonder hart | 568,82 | 14.22 | 7.00 | 2.03 | 2.04 | 6,965 | 0,018 |
Tabel 1. RNA kwantiteit en kwaliteit door spectrofotometrische meting. De kwantiteit en kwaliteit van het RNA van het "hart" en "embryo zonder hart" monsters verkregen uit 56 HPF embryo's zoals gemeten door spectrofotometrie.
| gene | GenBank # | primersequentie | PCR productgrootte (bp) | Weefsel-specifieke marker |
| myl7 | BX248505 | F: 5'-ACAGCAAAGCAGACAGTGAA-3 ' | 163 | myocard |
| R: 5'-TAACTCCATCCCGGTTCTGA-3 ' | ||||
| kdrl | CR759732 | F: 5'-ACAACGACACTGGCATCTAC-3 ' | 170 | endotheel / endocard |
| R: 5'-TGTTCTACAGGGGACCACAA-3 ' | ||||
| GFAP | BX324157 | F: 5'-AGACAACTTGGCCTCAGAC-3 ' | 247 | centraal zenuwstelsel |
| R: 5'-ATCCACATGAACCTGTTGGG-3 ' | ||||
| cryaa | BX248514 | 190 | ooglens | |
| R: 5'-TCAGACCTCACCTCAGAGAC-3 ' | ||||
| hbbe1.1 | BC095024 | F: 5'-TGGTTGTGTGGACAGACTTCGA-3 '8 | 102 | erytrocyten |
| R: 5'-CGATAAGACACCTTGCCAGAGC-3 '8 | ||||
| eif1b | BX323079 | F: 5'-CAGAACCTCCAGTCCTTTGATC-3 '12 | 195 | referentiegen |
| R: 5'-GCAGGCAAATTTCTTTTTGAAGGC-3 '12 |
Tabel 2. Primers gebruikt voor de RT-qPCR experimenten. Naam, GenBank, volgorde, PCR-product maten en weefsel-specificiteit worden getoond voor alle genen geanalyseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol maakt de snelle verrijking van de zebravis embryonale hartweefsel voor genexpressie analyses. De kwantiteit en kwaliteit van de cardiale-specifieke RNA-monster is sterk afhankelijk van een aantal cruciale stappen: eerst wordt de hoeveelheid van het monster sterk verbeterd als het verlies van de harten wordt voorkomen bij elke stap van het protocol, omdat RNA zuivering werkt alleen met voldoende uitgangsmateriaal. Ten tweede, de zuiverheid van het monster, die volledig afhankelijk is van de experimentator, wordt bepaald door het sorteren en verzamelen harten in de petrischaal met strikte uitsluiting van andere weefsels. Ten derde, kwaliteit van het monster kritisch afhankelijk van het beperken van RNA degradatie die kan optreden bij verstoring van de embryo's; Dit wordt bereikt door celkweekmedium celdood voorkomen en houden de monsters op ijs. RNA afbraak wordt gestopt zodra de harten werden overgebracht naar RNAlater of Trizol. Dat de harten worden verslagen in de petrischaal krachtig toont aan dat de cardiale tprobleem is fysiologisch normaal na dissectie.
Wij adviseren om te beginnen met minstens 300 hartjes (dwz ongeveer 500 embryo's), waaruit genoeg RNA veilig kan worden neergeslagen (samen met 5-10 ug glycogeen). We kunnen echter niet uitsluiten dan minder harten zou volstaan voor kleinschalige experimenten. Het is alleen belangrijk voldoende RNA concentratie, zuiverheid en integriteit van het monster te bepalen. Let erop dat RNA inhoud kan variëren afhankelijk van het ontwikkelingsstadium en op de genetische achtergrond van het embryo (bijvoorbeeld in het geval van mutanten met abnormale harten). Daarom zou de minimale hoeveelheid embryo vereist een experiment hebben elk individueel geval te bepalen.
Er zijn weinig technische verschillen tussen dit protocol en een eerdere protocol door Burns en MacRae, en we denken niet dat er een significant verschil in efficiëntie of de snelheid tussen de twee protocollen.We hebben echter verbeteringen geïntroduceerd: Het belangrijkste is, raden we het gebruik van RNAlater stabilisatie oplossing. Dit is om twee redenen: ten eerste, hoge kwaliteit RNA voor verdere experimenten zoals RT-qPCR verzamelen doordat RNA afbraak tot een minimum, zoals RNAlater inactiveert onmiddellijk RNasen en stabiliseert RNA in weefsels of cellen. Tweede RNAlater cruciaal voor waardoor de verzameling van harten op verschillende dagen, wat belangrijk is wanneer het aantal embryo een beperkende factor. Ook kan bundeling van de harten die nodig zijn om een voldoende hoeveelheid uitgangsmateriaal voor efficiënte isolatie van hoge kwaliteit RNA met Trizol verkrijgen. Direct overbrengen van de harten in Trizol zou het gebruik van RNAlater omzeilen, echter, als gevolg gezondheidsgevaren deze stap zou onder een chemische kap, die niet kan worden aangenomen dat in de directe nabijheid van de fluorescentie microscoop voor onderzoekers te voeren .
We hebben thoed het hart dissectie werkt goed met embryo's tussen 20-72 HPF [12; ongepubliceerde gegevens voor 72 HPF]. De extractieprocedure moeilijker naarmate embryonale leeftijd en lengte: extra en krachtigere pipetteren moet het embryo succes introduceren in de lange tip en de harten van andere embryonale weefsels scheiden. Hierdoor meer embryonale vuil aanwezig is in het monster bereiding (zie figuur 1C, C) en de experimentator voorzichtiger sorteren van de harten in de petrischaal worden.
Het hart dissectie protocol hier gepresenteerde kan een analyse van het volledige cardiale expressieprofiel van verschillende celtypen, waaronder myocardium en endocardium. Verdere scheiding van cardiale celtypen kan worden bereikt door endocardial- en myocard-specifieke reporter lijnen [bijv Tg (myl7: GFP) twu34 en Tg (kdrl: mCherry IS5] 9, 17 voor hart extractie gecombineerd met FACS sorteren. In tegenstelling tot de werkwijze vertalen Ribosoom Affinity Purification (TRAP) 18,19, die weefselspecifieke transcriptionele analyse mogelijk maakt zonder weefseldissectie, is onze benadering niet beperkt actief getranslateerde mRNA maar ook niet-actief-getranslateerde mRNA of niet-coderende RNA's. Een alternatieve toepassing van het hart dissectie protocol eiwitexpressie in harten geanalyseerd: eiwitniveaus kunnen worden beoordeeld door Western blot en eiwit lokalisatie kan worden geanalyseerd door immunohistochemie, als de anatomie van het hart wordt behouden tijdens de dissectie procedure.
Samengevat, geven we hier een gedetailleerd protocol voor het ontleden functionele / kloppende harten uit honderden embryo's in een korte tijd, die kan worden gebruikt voor het hart-specifieke RNA (of eiwit) monsters van hoge zuiverheid voor verdere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment for raising fish and collecting eggs | see the Zebrafish Book11 for details | ||
| Fluorescence stereomicroscope | |||
| Refrigerated Microcentrifuge | |||
| UV-Spectrophotometer | e.g. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Nucleic acid electrophoresis chamber | |||
| Petri dishes 4 cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium | |||
| Micropipettes and tips (P20, P100, P1000) | |||
| 1.5 ml centrifugation tubes | |||
| 15 ml and 50 ml centrifugation tubes | |||
| Pair of Dumont #5 forceps | |||
| ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Phase lock gel, heavy, 1.5 ml tubes | Prime | 2302810 | |
| Egg water medium | 60 μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue | ||
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | ||
| Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 mg/ml Tricaine stock solution, pH 7 |
| 1% agarose (in E3 medium) | |||
| 1% agarose gel (in TBE buffer) | |||
| Leibovitz´s L-15 medium | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 µg/µl in RNase-free water |
| chloroform | |||
| isopropanol | |||
| 75% ethanol (in DEPC-ddH2O) | |||
| Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O | |||
| Nucleic acid loading buffer | |||
| TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis |
References
- Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
- Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish. Development. 123, 293-302 (1996).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends Genet. 10, 73-74 (1994).
- Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001 (1996).
- Epstein, C. B., Butow, R. A. Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).
- Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics. OMICS. 18, 98-110 (2014).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. Biotechniques. 40, 274-278 (2006).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th, University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Veerkamp, J., et al. Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry). Dev Cell. 24, 660-667 (2013).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Brownlie, A., et al.
- Marvin, M., et al. Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins. Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).
- Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain. Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
- Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
