Summary
Para analisar os perfis de expressão de genes cardíacos durante o desenvolvimento do coração de peixe-zebra, o RNA total foi de ser extraído do coração isolado. Aqui, apresentamos um protocolo para a coleta / corações batendo funcionais por um rápido esvaziamento manual a partir de embriões de peixes-zebra para obter mRNA específico cardíaca.
Abstract
O coração embrionário do peixe-zebra é composta de apenas algumas centenas de células, o que representa apenas uma pequena fracção de todo o embrião. Portanto, para evitar o transcriptoma cardíaca de ser mascarado pelo transcriptoma embrionário global, é necessário recolher um número suficiente de corações para análises posteriores. Além disso, como o desenvolvimento do peixe-zebra cardíaca processe rapidamente, a recolha do coração e métodos de extracção de ARN precisa de ser rápido, a fim de assegurar homogeneidade das amostras. Aqui, apresentamos um protocolo de dissecção Manual rápido para a coleta / corações batendo funcionais a partir de embriões de peixes-zebra. Este é um pré-requisito essencial para a extração de RNA cardíaca específica posterior para determinar os níveis de expressão de genes específicos cardíaca por análises de transcriptoma, como em tempo real reação em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR). O método baseia-se nas propriedades adesivas diferenciais do coração embrionário do peixe-zebra em comparação com outros tecidos; esta permite a rápida physeparação de Sical cardíaca a partir de tecido extracardiac por uma combinação de fluídico rompimento força de cisalhamento, filtração por etapas e coleta manual de transgênicos corações marcados com fluorescência.
Introduction
Peixe-zebra (Danio rerio) é amplamente usada na biologia do desenvolvimento para estudar a organogénese in vivo, devido à sua rápida, transparente e extra-uterina do desenvolvimento embrionário, combinada com o tamanho pequeno e a disponibilidade de linhas repórter transgénicos com expressão específica para um tecido de proteínas fluorescentes. Este pequeno vertebrado é particularmente adequado para estudar o desenvolvimento do coração, já que oxigenação do embrião de peixe-zebra cedo não depende de batimento cardíaco e fluxo sanguíneo; esses recursos permitiram a caracterização de um grande número de mutantes cardiovasculares 1,2 e o peixe-zebra é agora um organismo modelo amplamente reconhecido para estudar doenças cardíacas 3.
Para estudar a expressão de genes durante o desenvolvimento embrionário, as transcrições são comumente analisados por todo o monte de hibridização in situ (DESEJO) 4, RT-qPCR 5, 6 microarrays, ou sequenciamento de próxima geração (RNA-Seq) 7. EnquantoDESEJO permite uma análise espacial-temporal da expressão gênica dentro de todo o embrião, níveis de transcrição são geralmente avaliada por RT-qPCR, microarrays ou abordagens de RNA-Seq. No entanto, estes métodos requerem enriquecimento tecido específico para perfil de expressão gênica.
Uma vez que o coração embrionário do peixe-zebra representa uma pequena fracção da totalidade do embrião, estudos transcriptoma durante o desenvolvimento cardíaco requerem um protocolo de dissecção e enriquecimento de corações. Além disso, para obter dados fisiologicamente relevantes, é importante para manter o tecido cardíaco totalmente funcional até a extracção de ARN. Aqui, descrevemos um protocolo para isolar rapidamente fisiologicamente normal e corações batendo de centenas de embriões de peixes-zebra para se obter eficiência amostras de RNA de alta qualidade para análises posteriores. O presente método é baseado no protocolo descrito por Burns e MacRae, 2006 8. Para o enriquecimento de tecido cardíaco, ambos os métodos de usar uma linha de miocárdio repórter transgénicoe tirar vantagem das propriedades de adesão diferencial de corações de peixes-zebra embrionários contra outros tecidos. Resumidamente, por pipetagem muitos embriões cima e para baixo através de uma ponteira estreita, corações são simultaneamente lançado a partir de corpos embrionárias e, posteriormente, separados dos restos embrionários em duas etapas de filtração rápida; corações marcados com fluorescência são então classificadas manualmente a partir de detritos remanescentes e recolhidos para posterior processamento.
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Protocol
Este protocolo segue as diretrizes de cuidados de animais da lei alemã e estado de Berlim; manuseio do peixe-zebra foi monitorada pela autoridade local para a protecção dos animais (LaGeSo, Berlin-Brandenburg).
1. A obtenção de embriões Zebrafish para Coração Extração
- Peixe-zebra repórter cardíaca transversal tal como a Tg (myl7: EGFP) twu34 linha transgénica 9, a fim de se obter os embriões com expressão específica do coração GFP.
- Manter os embriões em água ovo a 28,5 ° C, até a fase embrionária pretendida 10,11. Certifique-se de que a população embrião coletado é homogênea tanto geneticamente e por estágio de desenvolvimento para limitar as variações na expressão gênica.
- Dechorionate os embriões manualmente.
2. Dissecando Zebrafish embrionárias Corações
NOTA: Mantenha todas as soluções em gelo. Se possível, fazer o trabalho em equipe: uma pessoa disseca os corações do embtabaco de enrolar enquanto outra pessoa classifica os corações sob a lupa de fluorescência. Isto permite que o tratamento de várias centenas de embriões em algumas horas.
- Transferir cerca de 100 embriões para um tubo de centrifugação de 1,5 ml. Anestesiar os embriões com tricaína (0,16 mg / ml em meio de E3). Continuar uma vez que os embriões são claramente anestesiados (eles não nadar e sedimentos para o fundo do tubo, mas os seus corações são ainda batendo).
- Remover a solução / E3 tricaina e lavar os embriões, uma vez com 1 ml de L-15/10% de FBS e manter em gelo.
NOTA: O meio com FBS a L-15/10% é importante para manter os órgãos e células vivos durante todo o procedimento de dissecção até que os corações foram transferidos para RNAlater ou Trizol. - Adicionar 1 ml L-15/10% de FBS para os embriões e pipeta cima e para baixo 5-8 vezes com uma rodada Gel Carregando Dica até que a gema é completamente interrompido. Pipetar os embriões gota a gota sobre a superfície da solução, de modo que a queda vai rebentar eos embriões são suavemente interrompido.
NOTA: Como vigorosamente e quantas vezes os embriões têm de ser pipetados cima e para baixo depende do estágio de desenvolvimento dos embriões, ou seja, mais de pipetagem é necessária em estágios finais (por exemplo, a 56 hpf). - Para o primeiro lote de embriões dissecados, avaliar a integridade dos embriões e a proporção de corações dissecados sob microscópio estereoscópico, uma vez que alguns corações podem permanecer solidários com os embriões se pipetaram muito gentilmente. Ajuste o modo de pipetagem para as próximas rodadas de dissecção de acordo.
NOTA: Use baixos dicas retenção pipetas e tubos de microcentrífuga para minimizar corações degola ao plástico. - Aplicar a amostra para um filtro de 100 um colocado em um tubo de 50 ml de centrifugação; enxaguar o tubo de 1,5 mL com 1 mL de meio L-15/10% de FBS e, em seguida, aplicar essa para o filtro, a fim de minimizar a perda da amostra (alguns corações pode ser aderente às paredes do tubo). Lavar o filtro duas vezes com 1 ml de L-15 / 10% de FBS. Neste passo os corações passar através do filtro e são recolhidas no tubo de 50 ml.
- Aplicar o fluxo de passagem para um filtro de 30 mm colocada sobre um tubo de centrifugação de 15 mL e lavar o filtro uma vez com 1 ml de L-15/10% de FBS. Neste segundo passo de filtração, os corações são retidas no filtro e pequenos detritos é lavado.
- Ligue o filtro de cabeça para baixo e lavar os corações para fora do filtro para um 1% de agarose revestidos por placa de Petri por aplicação de três lavagens consecutivas com 1 ml de L-15/10% de FBS.
- Separar manualmente corações GFP positivas a partir dos detritos embrionário não fluorescente (por exemplo, lentes oculares) com um par de pinças sob um estereomicroscópio fluorescência e concentrá-las no centro do prato. Recolha-os de acordo com a etapa 3.
NOTA: Se os embriões são mais velhos do que 24 hpf, o coração deve ser de bater, o que indica que os tecidos ainda estão fisiologicamente normal.
3. Isolamento de mRNA a partir de dissecçãoted Corações
- Recolha os corações no menor volume possível (por exemplo, 10 ul) e pipeta em um tubo de 1,5 ml contendo 0,75 ml RNAlater (no gelo). Verifique se não há corações permanecer na ponta da pipeta por vê-lo sob um microscópio estereoscópico fluorescência.
- Como alternativa, se um capuz químico está disponível nas imediações de um microscópio de fluorescência, transferir os corações coletados em Trizol (CUIDADO) sob o capô química. Isto evita a possível perda de corações que furam na ponta da pipeta e também durante a centrifugação dos corações (passos 3.4, 3.5 e 3.7). Reúnem-se os corações de várias rodadas de isolamento no mesmo tubo com Trizol e ir diretamente para a etapa 3.8; o volume final não deve exceder 10% do volume inicial de Trizol.
NOTA: Leia a Ficha de Segurança Trizol Produto (FDSP) antes do uso. Pega reagente Trizol sob um capuz e desgaste recomendado Equipamento de Proteção Individual. Evitar o contacto com a pele, olhos e clothing. Remova todas as fontes de ignição. - Reúnem-se os corações de várias rondas de isolamento no mesmo tubo com RNAlater (em gelo), como a eficiência de isolamento de ARN aumenta com a quantidade de tecido recolhido. Se o volume total da amostra for superior a 10% do volume inicial RNAlater, utilizar um tubo adicional com 0,75 ml RNAlater para armazenamento (em gelo).
- Centrifuga-se as amostras a 15.700 xg durante 20 min a 4 ° C para sedimentar os corações.
- Sob um microscópio estereoscópico de fluorescência, recolher cuidadosamente, tanto sobrenadante quanto possível num revestidos por placa de Petri de agarose 1% contendo 3 ml de L-15/10% de FBS, mas não perturbe os corações sedimentadas no fundo do tubo de centrifugação. Uma vez que até 15% dos corações pode permanecer no sobrenadante devido à elevada viscosidade do RNAlater, recuperá-los, tal como descrito na etapa 3.7.
- Dentro de uma câmara química, adicionar 0,5 ml de Trizol para o tubo contendo os corações sedimentadas e manter em gelo.
- Sob o microsco fluorescentepe, transferir os corações (a partir do passo 3.5) a partir do 1% de agarose revestidas de prato contendo solução de FBS RNAlater / L-15/10% em outro prato revestido de agarose a 1% com 3 ml de L-15/10% de FBS para diluir a RNAlater. Recolher os corações no centro da placa de petri e transferi-las num volume pequeno para o tubo de corações sedimentados em Trizol sob uma coifa química.
- Vortex o tubo de 1,5 ml contendo os corações em Trizol para interromper o coração e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
- Dentro de uma câmara química, adicione 100 clorofórmio ul (CUIDADO), misturar bem e transferir a solução / clorofórmio Trizol em um 1,5 ml pré-fiado tubo PLG (centrífuga 30 segundos a velocidade máxima antes de usar). Incuba-se durante 3 minutos à temperatura ambiente.
NOTA: Leia as MSDS clorofórmio antes de usar. Pega reagente clorofórmio, sob um capuz e desgaste recomendado Equipamento de Proteção Individual. Evitar o contacto com a pele, olhos e vestuário. Manter longe de incompatíveis, como os metais, álcalis. - Centrifuge a amostra a 15.700 xg durante 15 min a 4 ° C, e transferir a fase aquosa para um novo tubo de 1,5 ml.
- Junte 5-10 ug de glicogénio e 250 pi pré-arrefecida (-20 ° C) isopropanol; misturar bem e incubar durante a noite a -20 ° C.
- Centrifuga-se a amostra a 15.700 xg durante 30 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante.
- Lava-se a pelete com 1 ml de etanol a 75%, centrifugar a 15.700 xg durante 15 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante.
- Deixe evaporar o etanol por secagem do sedimento à temperatura ambiente até se tornar branco (por exemplo, para 10-15 min).
- Adicionar 20 ul de ARNase isento de ddH2O para o sedimento e incubar durante 10-15 min a 55 ° C para dissolver o ARN; em seguida, manter em gelo.
- Avaliar a concentração de ARN e pureza por medição de absorvância. Avaliar a integridade do RNA por a execução da amostra sobre um gel de agarose a 1%.
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Representative Results
Aqui, descrevemos uma experiência representativa dissecção do coração utilizando o peixe-zebra Tg (myl7: GFP) twu34 linhagem transgênica 9, que expressa a proteína fluorescente verde (GFP) exclusivamente dentro do miocárdio (Fig. 1). Foram coletadas ambos os corações dissecados e dos embriões a partir da qual eles foram derivados a avaliar a pureza da amostra coração. Resumidamente, homozigoto Tg (myl7: GFP) twu34 peixe-zebra 9 foram outcrossed com o tipo selvagem de modo a que todos os corações embrionários foram GFP marcado. Cerca de 500 embriões (56 HPF) foram transferidas para tubos de 1,5 ml (aprox. 100 embriões em cada) (Fig 1A1., 1B). Cada tubo foi processado tal como descrito na secção de protocolo (passo 2) e na Figura 1A. Corações foram liberados por pipetagem cima e para baixo várias vezes (Fig. 1A2) e, em seguida, aplicada sobre um 100 um filtro (Fig. 1A3). Grandes pedaços de tecido embrionário foram retidos neste filtro; essa fração foi recuperado e colocado em Trizol foextração de RNA r para obter um "embrião sem coração" amostra de RNA (Fig. 1A3). O fluxo através contendo-coração foi então aplicada sobre um filtro de 30 um (Fig. 1A4), que manteve o coração e tecido detritos de tamanho semelhante. Corações positivas para GFP foram lavadas para fora do filtro para uma placa de Petri revestidas com agarose (Fig. 1A5, 1C), recolheu rapidamente no meio do prato sob um estereomicroscópio fluorescente e transferida para 0,75 ml RNAlater (Fig. 1A6). Dentro desse tubo com RNAlater, nós reunidas corações derivados de 5 rounds de dissecação (aprox. 300 corações de 500 embriões representando uma eficiência de extração de cerca de 60%). Uma comparação das amostras do coração antes da triagem dos detritos a partir de embriões em 56 hpf (Fig. 1C) contra 36 hpf (Fig. 1C ') é apresentada na Figura 1. Aos 56 hpf, o rompimento de embriões produziram mais detritos embrionário ( tais como lentes, de ponta de seta, Fig. 1C) do que aos 36 hpf seguindo o passo de filtração de 30 um (Fig. 1C).
Para determinar a pureza do 56 hpf amostra "coração", comparamos os níveis de expressão de cardíacas versus transcrições extra-cardíacas no "coração" e "embrião sem coração" amostras por RT-qPCR. Para este fim, foram extraídas a partir de ARNm essas duas amostras e avaliada de qualidade de ARN num gel de agarose (Figura 2A) e quantidade por medição de absorvância (Tabela 1) tal como descrito na secção de protocolo (passo 3). A aprox. 300 corações rendeu 660 ng RNA. Em seguida, o ADNc foi sintetizado utilizando M-MLV de transcriptase reversa RNase H (-) e hexâmeros aleatórios de acordo com as instruções do fabricante, e experiências de RT-qPCR foram realizadas como descrito 12. Os níveis de expressão de genes relativos foram calculados para diferentes marcadores específicos de tecidos, como leve de miosina polipéptido 7 [myl7, um marcador do miocárdio] 9, receptor do domínio de inserção da quinase, como [kdrl, um / marcador endotelial endocárdica] 13, beta da hemoglobina embrionário-1.1 [hbbe1.1, um marcador de eritrócitos] 14, a cristalina alfa-A [cryaa, um marcador da lente do olho] 15, e proteína ácida fibrilar glial [GFAP, um marcador do sistema nervoso central] 16 (Figura 2B). O factor de iniciação da tradução eucariótica peixe-zebra 1B [eif1b] 12 foi usado como um gene de referência interna (ver Quadro 2 para os números de ID GenBank, as sequências dos primers de PCR, os tamanhos de produtos e especificidade de tecido para cada gene). Como esperado, myl7 foi altamente enriquecido na "coração" amostra em comparação com o "embrião sem coração" amostra (Fig. 2B). O marcador de células endoteliais kdrl foi encontrado para ser moderadamente enriquecido no centro da amostra, conforme o esperado (cerca de 40% das células cardíacas em 56 hpf são kdrl -expressing células do endocárdio) (Fig. 2B). O hbbe1.1 marcador eritrócitos foi super-representados no "coração" da amostra, mesmo que os corações estavam stbatimento doente após a dissecação, que devem expelir as células vermelhas do sangue a partir do coração (Fig. 2B). Em contraste, os níveis do SNC e marcadores de lente (GFAP e cryaa, respectivamente) de expressão eram extremamente baixos no "coração" de amostra (Fig. 2B). Ao todo, conclui-se que o rendimento do protocolo de dissecção cardíaca alta qualidade e RNA específico cardíaca a partir de embriões de peixes-zebra inteiras.
Figura 1. extração do coração a partir de embriões de peixes-zebra. (A) Esquema representando o procedimento de extração coração. Cerca de 100 embriões vivos são coletados em um tubo de 1,5 ml (A1, B, B '), anestesiados e depois pipetado cima e para baixo várias vezes através de uma ponteira estreita para libertar os corações (A2). A solução resultante contendo os tecidos embrionários (A2) é então aplicada sobre um filtro de 100 um (A3). Tecidos embrionários sem gema e hearts, e os detritos grandes embrionário permanecem no filtro (A3). O efluente é recolhido num tubo de 50 ml (A3) e, em seguida, aplicado sobre um filtro de 30 fim (A4). Os corações e pequenos detritos são retidos no filtro de 30 um e transferiu-se um pequeno-revestida de agarose placa de petri (A5, C, C '). EGFP corações marcados (C, C '; seta) são classificados manualmente a partir de detritos remanescentes, tais como as lentes (C, pontas de seta), e são recolhidas na RNAlater (A6). Este procedimento é repetido pelo menos 5 vezes e todos os corações são reunidas para posterior processamento. (BC ') Sobreposição de fluorescência (EGFP em verde) e DIC imagens de Tg transgênico ao vivo (myl7: EGFP) twu34 embriões a 56 hpf (B, C) e 36 hpf (B', C '), a dois passos do coração procedimento de dissecção: antes da dissecação de embriões (B, B ') e apenas após a lavagem do filtro de 30 mm, antes de classificar os corações de os detritos no prato de petri (C, C'). Barra de escala: 500? M.
Figura 2. Análise da pureza e qualidade do ARN por electroforese e RT-qPCR, respectivamente. (A) ARN total a partir do "coração" amostra (2 ul) e do "embrião sem coração" amostra (1 ul), derivado a partir de 56 embriões HPF resolvidos num gel de agarose a 1%. S18 e S28 proeminente rRNA bandas indicam que os ARN não são degradados. Os níveis de expressão relativos da myl7 marcadores específicos de tecidos (miocárdio), kdrl (endotélio), hbbe1.1 (eritrócitos), cryaa (lente) e GFAP (SNC) tal como determinado por RT-qPCR para o "centro" da amostra (B) normalizada para o "embrião sem coração" amostra. As experiências de RT-qPCR foram realizados como triplicados técnicas e os dados são dados como médias ± SEM. Uma análise de teste-t não emparelhado foi realizado. **** P <0,0001; ** P <0,005. bp, pares de bases.
| amostra ID | ng / ul | A260 | A280 | 260/280 | 260/230 | cursor abs. | 340 matéria- |
| corações | 32.97 | 0,82 | 0,41 | 2.01 | 0,35 | 2.355 | 0,031 |
| embriões sem corações | 568,82 | 14.22 | 7.00 | 2.03 | 2.04 | 6,965 | 0,018 |
Tabela 1. quantidade RNA e qualidade por espectrofotometria. A quantidade ea qualidade do RNA do "coração" e "embrião sem coração" amostras obtidas de 56 hpf embriões, medida por espectrofotometria.
| gene | GenBank # | sequência iniciadora | O tamanho do produto de PCR (pb) | Marcador específico para tecidos |
| myl7 | BX248505 | F: 5'-ACAGCAAAGCAGACAGTGAA-3 ' | 163 | miocárdio |
| R: 5'-TAACTCCATCCCGGTTCTGA-3 ' | ||||
| kdrl | CR759732 | F: 5'-ACAACGACACTGGCATCTAC-3 ' | 170 | endotélio / endocárdio |
| R: 5'-TGTTCTACAGGGGACCACAA-3 ' | ||||
| GFAP | BX324157 | F: 5'-AGACAACTTGGCCTCAGAC-3 ' | 247 | sistema nervoso central |
| R: 5'-ATCCACATGAACCTGTTGGG-3 ' | ||||
| cryaa | BX248514 | 190 | lente do olho | |
| R: 5'-TCAGACCTCACCTCAGAGAC-3 ' | ||||
| hbbe1.1 | BC095024 | F: 5'-TGGTTGTGTGGACAGACTTCGA-3 '8 | 102 | eritrócitos |
| R: 5'-CGATAAGACACCTTGCCAGAGC-3 '8 | ||||
| eif1b | BX323079 | F: 5'-CAGAACCTCCAGTCCTTTGATC-3 '12 | 195 | gene de referência |
| R: 5'-GCAGGCAAATTTCTTTTTGAAGGC-3 '12 |
Tabela 2. Iniciadores utilizados para as experiências de RT-qPCR. Nome, número de acesso GenBank, sequência de tamanhos de produtos de PCR e o tecido-especificidade são apresentadas para todos os genes analisados.
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Discussion
Este protocolo permite o rápido enriquecimento do tecido do coração embrionário do peixe-zebra por análises de expressão de genes. A quantidade e qualidade da amostra de RNA específico cardíaca depende muito de alguns passos cruciais: primeiro, a quantidade da amostra é muito melhor se a perda de corações é impedida em cada etapa do protocolo, uma vez que a purificação RNA só funcionará com suficiente material de partida. Em segundo lugar, a pureza da amostra, o que depende inteiramente do experimentador, é determinada pela recolha e triagem corações dentro da placa de Petri enquanto excluindo estritamente outros tecidos. Em terceiro lugar, a qualidade da amostra depende criticamente sobre a limitação degradação do RNA que pode ocorrer após a interrupção dos embriões; isto é alcançado através da utilização de meio de cultura de células para evitar a morte celular e, mantendo as amostras em gelo. Degradação do RNA é interrompido uma vez que os corações foram transferidos para RNAlater ou Trizol. Isso corações estão batendo na placa de Petri demonstra poderosamente que o t cardíacaquestão é fisiologicamente normal após dissecação.
Recomendamos começar com pelo menos 300 corações (ou seja, cerca de 500 embriões), a partir do qual RNA suficiente pode seguramente ser precipitados (juntamente com 5-10 mg de glicogênio). No entanto, não podemos excluir que menos corações seria suficiente para experimentos em pequena escala. É importante ter simplesmente de ARN suficientes para determinar a concentração, pureza e integridade da amostra. Notar que os conteúdos de RNA pode variar, dependendo da fase de desenvolvimento e no fundo genético do embrião (por exemplo, no caso de mutantes com corações anormais). Assim, a quantidade mínima de embriões necessários para uma experiência teria que ser determinada em cada caso individual.
Há poucas diferenças técnicas entre este protocolo e um protocolo anterior por Burns e MacRae, e nós não acho que há uma diferença significativa em termos de eficiência ou a velocidade entre os dois protocolos.No entanto, nós introduzimos melhorias: Mais importante ainda, sugerimos o uso de solução de estabilização RNAlater. Isto é importante por duas razões: em primeiro lugar, para recolher o ARN de alta qualidade para experiências adicionais, tais como RT-qPCR reduzindo a degradação de RNA para um mínimo, como RNAlater inactiva imediatamente RNases e estabiliza o ARN no interior de tecidos ou células. Em segundo lugar, RNAlater é crucial para permitir a recolha de corações em diferentes dias, o que é importante quando o número de embriões é um factor limitativo. Também permite a reunião dos corações que podem ser necessários para obter uma quantidade suficiente de material de partida para o isolamento eficiente de RNA de alta qualidade com Trizol. Transferir os corações directamente em Trizol iria contornar o uso de RNAlater, no entanto, devido aos riscos para a saúde, este passo tem de ser efectuado sob uma coifa química, que não pode ser considerado como estando situado na vizinhança directa de um microscópio de fluorescência para todos os experimentadores .
Encontramos tchapéu a dissecção coração funciona bem com embriões entre 20-72 hpf [12; dados não publicados para 72 hpf]. No entanto, o procedimento de extração torna-se mais difícil com o aumento da idade embrionária e comprimento: é necessário adicional e pipetagem mais enérgica para introduzir com sucesso os embriões para a ponta longa e para separar os corações de outros tecidos embrionários. Como resultado, os detritos mais embrionária está presente na preparação da amostra (ver Figura 1C, C ') e o analista tem que ter mais cuidado em separar os corações na placa de Petri.
O protocolo de dissecção cardíaca aqui apresentada permite uma análise de todo o perfil de expressão cardíaco de diferentes tipos de células, incluindo miocárdio e endocárdio. Além disso a separação dos tipos de células cardíacas poderia ser conseguido através da utilização de linhas endocardial- miocárdio e especificidade ao repórter [por exemplo, Tg (myl7: GFP) twu34 e Tg (kdrl: mCherry IS5] 9, 17 para a extração de coração combinado com FACS classificação. Em contraste com o método de purificação por afinidade Traduzindo Ribossoma (TRAP) 18,19, que permite a análise da transcrição específica para um tecido tecido sem dissecção, a nossa abordagem não está limitada a ARNm activamente-traduzidas mas também inclui os mRNAs não-traduzidas activamente ou RNAs não codificantes. Uma aplicação alternativa do protocolo de dissecção do coração é a analisar a expressão de proteína dentro de corações: os níveis de proteína pode ser avaliada por Western blot e proteína de localização pode ser analisada por imuno-histoquímica, como a anatomia do coração é preservada durante o procedimento de dissecção.
Em resumo, os autores apresentam um protocolo detalhado para dissecar / corações batendo funcionais a partir de centenas de embriões em um curto período de tempo, que podem ser utilizados para a obtenção de RNA (ou proteína) amostras específicas do coração de elevado grau de pureza para mais análises.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment for raising fish and collecting eggs | see the Zebrafish Book11 for details | ||
| Fluorescence stereomicroscope | |||
| Refrigerated Microcentrifuge | |||
| UV-Spectrophotometer | e.g. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Nucleic acid electrophoresis chamber | |||
| Petri dishes 4 cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium | |||
| Micropipettes and tips (P20, P100, P1000) | |||
| 1.5 ml centrifugation tubes | |||
| 15 ml and 50 ml centrifugation tubes | |||
| Pair of Dumont #5 forceps | |||
| ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Phase lock gel, heavy, 1.5 ml tubes | Prime | 2302810 | |
| Egg water medium | 60 μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue | ||
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | ||
| Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 mg/ml Tricaine stock solution, pH 7 |
| 1% agarose (in E3 medium) | |||
| 1% agarose gel (in TBE buffer) | |||
| Leibovitz´s L-15 medium | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 µg/µl in RNase-free water |
| chloroform | |||
| isopropanol | |||
| 75% ethanol (in DEPC-ddH2O) | |||
| Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O | |||
| Nucleic acid loading buffer | |||
| TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis |
References
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