Summary
Herzgenexpressionsprofile bei Zebrafisch Herzentwicklung zu analysieren, wurde Gesamt-RNA aus isolierten Herzen gewonnen werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll für das Sammeln von Funktions / klopfenden Herzen durch schnelle manuelle Dissektion von Zebrafischembryonen zu herzspezifischen mRNA zu erhalten.
Abstract
Der Zebrafisch embryonalen Herzens wird von nur wenigen hundert Zellen bestehen, nur einen geringen Bruchteil des gesamten Embryos. Deshalb, um die Herz Transkriptom nicht durch die globale embryonale Transkriptom maskiert zu verhindern, ist es notwendig, eine ausreichende Zahl von Herzen für weitere Analysen zu sammeln. Darüber hinaus, wie Zebrafisch-Herz-Entwicklung schreitet schnell voran, Herz Sammlung und RNA-Extraktionsmethoden müssen schnell sein, um die Homogenität der Proben zu gewährleisten. Hier präsentieren wir eine schnelle manuelle Dissektion Protokoll zum Sammeln Funktions / schlagenden Herzen von Zebrafischembryonen. Dies ist eine wesentliche Voraussetzung für die nachfolgende herzspezifischen RNA-Extraktion zur herzspezifischen Genexpression bestimmen, durch Transkriptom-Analysen, wie die quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Das Verfahren basiert auf Differentialhafteigenschaften des Zebrafisch embryonalen Herzens im Vergleich zu anderen Geweben beruhen; Dies ermöglicht eine schnelle physical Trennung von Herzgewebe aus extra durch eine Kombination von Fluidscherkraft Unterbrechungen schrittweise Filtration und manuelle Sammlung von transgenen fluoreszierend markierten Herzen.
Introduction
Zebrafisch (Danio rerio) ist weit verbreitet in der Entwicklungsbiologie zur Organogenese in vivo zu untersuchen, durch die schnelle, transparente und extrauterine embryonalen Entwicklung, verbunden mit geringen Größe und der Verfügbarkeit von transgenen Reporter Linien mit gewebespezifische Expression von fluoreszierenden Proteinen. Dieses kleine Wirbeltiere ist besonders gut geeignet, um Herzentwicklung zu studieren, weil die Sauerstoffversorgung des frühen Zebrafischembryo nicht von Herzschlag und Blutfluss verlassen; Diese Eigenschaften haben die Charakterisierung einer großen Anzahl von kardiovaskulären Mutanten 1,2 erlaubt und der Zebrafisch ist nun eine anerkannte Modellorganismus an Herzkrankheiten 3 untersuchen.
Die Genexpression während der Embryonalentwicklung zu untersuchen, werden Transkripte häufig von ganz-mount in situ Hybridisierung (WISH) 4 analysiert, RT-qPCR 5, Microarrays 6 oder Next Generation Sequencing (RNA-Seq) 7. WährendWISH ermöglicht eine räumlich-zeitliche Analyse der Genexpression im gesamten Embryo werden Transkriptniveaus üblicherweise durch RT-qPCR, Mikroarrays oder RNA-Seq Ansätze beurteilt. Allerdings erfordern diese Verfahren Gewebe Bereicherung für spezifische Gene Expression Profiling.
Da der Zebrafisch embryonalen Herzen einen kleinen Teil des gesamten Embryo, Transkriptom-Studien während der Herzentwicklung erfordern ein Protokoll für die Präparation und Anreicherung von Herzen. Darüber hinaus, um physiologisch relevante Daten zu erhalten, ist es wichtig, das Herzgewebe voll funktionsfähig, bis die RNA-Extraktion zu erhalten. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung schnell physiologisch normal und schlagenden Herzen von Hunderten von Zebrafischembryonen, qualitativ hochwertige RNA-Proben effizient zu erhalten für weitere Analysen. Das vorliegende Verfahren basiert auf dem Protokoll, das von Burns und MacRae 2006 8 ausgewiesen ist. Zur Anreicherung von Herzgewebe, beide Methoden verwenden eine transgene myokardialen Reporter Linienund profitieren Sie von den differentiellen Hafteigenschaften der Zebrafisch embryonalen Herzen gegenüber anderen Geweben. Kurz gesagt, durch Pipettieren viele Embryonen nach oben und unten durch einen schmalen Pipettenspitze, Herzen gleichzeitig von embryonalen Körper freigesetzt und anschließend aus embryonalen Ablagerungen in zwei schnelle Filtrationsschritte voneinander getrennt sind; fluoreszenzmarkierte Herzen werden dann manuell von den restlichen Verunreinigungen sortiert und für die weitere Verarbeitung gesammelt.
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Protocol
Dieses Protokoll folgt den Tierschutzvorschriften des deutschen und Berliner Landesrecht; Zebrafisch-Handling wurde von der lokalen Behörde für Tierschutz (LAGeSo, Berlin-Brandenburg) überwacht.
1. Gewinnung Zebrafischembryonen für Herz-Extraktion
- Kreuz Herz Reporter Zebrafisch wie der Tg (myl7: EGFP) twu34 transgenen Linie 9 um Embryonen mit herzspezifischen GFP-Expression zu erhalten.
- Pflegen Sie die Embryonen im Ei Wasser bei 28,5 ° C, bis die gewünschte Embryonalstadium 10,11. Stellen Sie sicher, dass die gesammelten Embryo Bevölkerung ist homogen sowohl genetisch und durch Entwicklungsstadium, um Variationen in der Genexpression zu begrenzen.
- Dechorionate die Embryonen manuell.
2. Dissecting Zebrafisch Embryonale Herz
HINWEIS: Bewahren Sie alle Lösungen auf Eis. Wenn möglich, Teamarbeit: eine Person seziert die Herzen der embRYOS während eine andere Person sortiert die Herzen unter dem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Dies ermöglicht die Verarbeitung von mehreren hundert Embryonen in ein paar Stunden.
- Übertragen ungefähr 100 Embryonen in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. Anesthetize die Embryonen mit Tricaine (0,16 mg / ml in E3 Medium). Gehen Sie einmal die Embryonen deutlich narkotisiert (sie nicht schwimmen und Sediment auf den Boden der Röhre, aber ihr Herz noch schlägt).
- Entfernen Sie die Tricaine / E3-Lösung und waschen Sie die Embryonen einmal mit 1 ml L-15/10% FBS-Medium und zu warten auf Eis.
HINWEIS: Die L-15/10% FBS-Medium ist wichtig, Organe und Zellen während der gesamten Dissektion Verfahren am Leben zu erhalten, bis die Herzen wurden in RNAlater oder Trizol übertragen. - 1 ml L-15/10% FBS-Medium zu den Embryonen und Pipette auf und ab 5-8 mal mit einer Runde Spitze für Gel, bis das Eigelb vollständig zerstört. Pipettieren die Embryonen tropfenweise auf die Oberfläche der Lösung, so dass der Tropfen platzen unddie Embryonen werden vorsichtig aufgebrochen.
HINWEIS: Wie stark und wie oft die Embryonen müssen nach oben und unten pipettiert werden, hängt vom Entwicklungsstadium des Embryos, dh mehr Pipettieren in späten Stadien (zB bei 56 HPF) benötigt. - Für die erste Charge von sezierten Embryonen, beurteilen die Integrität der Embryonen und der Anteil der eingeschnittenen Herzen unter einem Stereomikroskop, da einige Herzen können zu den Embryonen befestigt bleiben, wenn sie zu leicht pipettiert. Stellen Sie die Art und Weise der Pipettieren für die nächsten Runden der Präparation entsprechend.
HINWEIS: Verwenden Sie Low Retention Pipettenspitzen, Reaktionsgefäße, die Herzen das Festhalten an dem Kunststoff zu minimieren. - Tragen Sie die Probe auf ein 100 um-Filter auf einem 50 ml Zentrifugenröhrchen platziert; spülen Sie die 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml L-15/10% FBS-Medium und wenden diese auf den Filter, um den Verlust der Probe zu minimieren (einige Herzen haften evtl. an den Wänden der Röhre). Den Filter waschen zweimal mit 1 ml L-15/10% FBS. In diesem Schritt werden die Herzen passieren den Filter und werden in der 50 ml-Röhrchen gesammelt.
- Tragen Sie die Durchfluss auf einen 30 um-Filter auf ein 15 ml Zentrifugenröhrchen platziert und spülen Sie den Filter einmal mit 1 ml L-15/10% FBS-Medium. In diesem zweiten Filtrationsschritt werden die Herzen in den Filter zurückgehalten und kleinere Bruch abgewaschen.
- Drehen Sie den Filter auf den Kopf und spülen das Herz aus dem Filter in einem 1% igen beschichtete Petrischale, indem drei aufeinanderfolgenden Waschungen mit 1 ml L-15/10% FBS.
- Manuell trennen GFP-positive Herzen der nichtfluoreszierenden embryonalen Schmutz (zB Augenlinsen) mit einer Pinzette unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop und konzentrieren sie in der Mitte der Schale. Sammeln Sie gemäß Schritt 3.
HINWEIS: Wenn die Embryonen sind älter als 24 HPF, sollten die Herzen schlagen werden, was darauf hinweist, dass die Gewebe sind noch physiologisch normal.
3. Isolieren von mRNA aus Dissected Herzen
- Sammeln, die Herzen in der kleinstmöglichen Volumen (zB 10 ul) und Pipette in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 0,75 ml RNAlater (auf Eis). Stellen Sie sicher, dass keine Herzen bleiben in der Pipettenspitze von unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop betrachten es.
- Alternativ, wenn eine chemische Kapuze ist in unmittelbarer Nähe des Fluoreszenzmikroskops zur Verfügung, übertragen Sie die gesammelten Herzen in Trizol (VORSICHT) unter der chemischen Abzugshaube. Dies umgeht den möglichen Verlust der Herzen Kleben in der Pipettenspitze und auch während der Zentrifugation der Herzen (Schritte 3.4, 3.5 und 3.7). Bündeln die Herzen von mehreren Runden der Isolierung in der gleichen Röhre mit Trizol und gehen Sie direkt zu Schritt 3.8; Das Endvolumen sollte 10% des ursprünglichen Trizol Volumen nicht überschreiten.
HINWEIS: Lesen Sie die Trizol Sicherheitsdatenblatt (MSDS) vor dem Gebrauch. Griff Trizolreagenz unter einer Haube und Verschleiß empfohlenen Schutzausrüstung. Kontakt mit Haut, Augen und clothi vermeidenng. Alle Zündquellen entfernen. - Bündeln die Herzen von mehreren Runden der Isolierung in der gleichen Röhre mit RNAlater (auf Eis), wie die Effizienz der RNA-Isolierung verbessert sich mit der Menge des Gewebes gesammelt. Wenn das Gesamtprobenvolumen 10% des ursprünglichen RNAlater Volumen überschreitet, verwenden Sie ein weiteres Rohr mit 0,75 ml RNAlater für die Lagerung (auf Eis).
- Zentrifugiere die Proben bei 15.700 g 20 min bei 4 ° C, um das Herz zu sedimentieren.
- Unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop, sammeln sorgfältig soviel Überstand wie möglich in einem 1% Agarose-beschichtete Petrischale mit 3 ml L-15/10% FBS-Medium, aber nicht der sedimentierten Herzen in der Unterseite des Zentrifugationsröhrchen stören. Da bis zu 15% der Herzen können im Überstand aufgrund der hohen Viskosität von RNAlater bleiben, rufen sie, wie in Schritt 3.7 beschrieben.
- Unter einer chemischen Abzugshaube, 0,5 ml Trizol an das Rohr, das die sedimentiert Herzen und auf Eis halten.
- Unter dem Fluoreszenz microscope, übertragen die Herzen (von Schritt 3.5) von der 1% Agarose-beschichtete Schale mit dem RNAlater / L-15/10% FBS-Lösung in eine andere 1% Agarose-beschichtete Schale mit 3 ml L-15/10% FBS zu verdünnen aus dem RNAlater. Sammeln Sie die Herzen in der Mitte der Petrischale und übergeben sie in einem kleinen Volumen in das Rohr von sedimentiert Herzen in Trizol unter einer chemischen Abzugshaube.
- Vortex die 1,5-ml-Röhrchen, das die Herzen in Trizol, um die Herzen zu stören und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
- Unter einer chemischen Abzugshaube, fügen Sie 100 ul Chloroform (VORSICHT), gut mischen und übertragen Sie die Trizol / Chloroform-Lösung in einer 1,5 ml vorge gesponnen PLG Rohr (Zentrifuge 30 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit vor der Verwendung). Inkubieren für 3 min bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Lesen Sie die Chloroform MSDS vor dem Gebrauch. Griff Chloroform Reagenz unter einem Abzug und tragen empfohlenen Schutzausrüstung. Kontakt mit Haut, Augen und Kleidung vermeiden. Weg von inkompatiblen halten, wie Metalle, Alkalien. - Centrifuge die Probe bei 15.700 xg für 15 min bei 4 ° C und übertragen die wässrige Phase in ein neues 1,5-ml-Röhrchen.
- Hinzufügen 5-10 ug Glykogen und 250 ul vorgekühlte (-20 ° C) Isopropanol; gut mischen und Inkubation über Nacht bei -20 ° C.
- Zentrifugieren Sie die Probe bei 15.700 · g für 30 min bei 4 ° C und den Überstand verwerfen.
- Waschen Sie das Pellet mit 1 ml 75% Ethanol, Zentrifuge bei 15.700 · g für 15 Minuten bei 4 ° C und den Überstand verwerfen.
- Lassen Sie das Ethanol verdampft durch Trocknen der Pellets bei Raumtemperatur, bis es weiß wird (zB für 10-15 min).
- Mit 20 & mgr; l RNase-freies ddH 2 O zu dem Pellet und Inkubation für 10-15 Minuten bei 55 ° C, um die RNA zu lösen; dann auf Eis zu halten.
- Beurteilen Sie die RNA-Konzentration und Reinheit durch Absorptionsmessung. Beurteilen Sie die RNA-Integrität, indem Sie die Probe auf einem 1% igen Agarosegel.
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Representative Results
Hier beschreiben wir einen repräsentativen Herz Dissektion Experiment unter Verwendung des Zebrafisch-Tg (myl7: GFP) twu34 transgenen Linie 9, die das grün fluoreszierende Protein (GFP) drückt ausschließlich im Myokard (Abb. 1). Wir sammelten sowohl die zergliederten Herzen und den Embryonen von denen sie abgeleitet wurden, um die Reinheit des Herzens Probe zu beurteilen. Kurz gesagt, die homozygot Tg (myl7: GFP) wurden twu34 Zebrafisch 9 mit dem Wildtyp, so dass alle embryonalen Herzen wurden GFP-markierten kreuzt. Rund 500 Embryonen (56 HPF) wurden in 1,5-ml-Röhrchen (ca. je. 100 Embryonen) (Abb. 1A1, 1B) übertragen. Jedes Röhrchen wurde nach dem Protokoll Abschnitt (Schritt 2) und in 1A beschrieben verarbeitet. Die Herzen wurden durch Auf- und Abpipettieren mehrmals (Abb 1A2.) Veröffentlicht und dann auf eine 100-um-Filter (Abb. 1A3) angewendet. Große Stücke von embryonalem Gewebe wurden in dieser Filter zurückgehalten; Diese Fraktion wurde entnommen und in Trizol gesetzt for RNA-Extraktion, um einen "Embryo ohne Herz" RNA-Probe (Abb. 1A3) zu erhalten. Der Durchlauf, die Herz wurde dann auf eine 30 um-Filter (Abb. 1A4), die die Herzen und Gewebetrümmer von ähnlicher Größe beibehalten angewendet. GFP-positive Herzen wurden aus dem Filter in eine Agarose-beschichtete Petrischale (Fig. 1A5, 1C), in der Mitte der Schale unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop schnell gesammelt und in 0,75 ml RNAlater (Fig. 1A6) überspült. In diesem Rohr mit RNAlater, gebündelt wir Herzen von 5 Dissektion Runden abgeleitet (ca. 300 Herzen von 500 Embryonen, die eine Extraktionsausbeute von etwa 60%). Ein Vergleich der Herzproben vor der Sortierung der Schutt aus Embryonen bei 56 hpf (Fig. 1C) gegenüber 36 hpf (Fig. 1C) ist in Figur 1 mit 56 hpf gezeigt, die Störung der Embryonen ergaben mehr embryonalen Trümmern ( wie Linsen, Pfeilspitze, Fig. 1C), als bei 36 hpf nach der 30 & mgr; m Filtration Schritt (Fig. 1C).
Um die Reinheit der 56 hpf "Herz" Probe zu bestimmen, verglichen wir die Expression von Herz gegen extraHerz Transkripte in "Herz" und "Embryo ohne Herz" Proben durch RT-qPCR. Zu diesem Zweck extrahiert man mRNA aus diesen beiden Proben und bewertete Qualität der RNA wurden auf einem Agarose-Gel (2A) und Menge durch Absorptionsmessung (Tabelle 1), wie in dem Protokoll Abschnitt (Schritt 3) beschrieben. Die ca. 300 Herzen ergab 660 ng RNA. (-) Nächstes cDNA wurde unter Verwendung von M-MLV Reverse-Transkriptase RNaseH synthetisiert und zufälligen Hexameren gemäß Herstelleranweisungen und RT-qPCR-Experimente wurden wie beschrieben 12 durchgeführt. Relative Genexpression wurden für unterschiedliche gewebespezifische Marker wie Myosin-Leicht Polypeptid 7 [myl7, einer Herzmuskelmarkierung] 9, Kinaseinsertdomänenrezeptor wie [kdrl, eine endotheliale / endokardialen Marker] 13, Hämoglobin-beta embryonalen-1 berechnet.1 [hbbe1.1 ein Erythrozyten-Markierung] 14, Kristallin-alpha A [CRYAA, eine Augenlinse Marker] 15, und saure Gliafaserprotein [GFAP, ein zentrales Nervensystem Marker] 16 (2B). Der Zebrafisch eukaryontischen Translationsinitiationsfaktor 1B [eif1b] 12 wurde als interne Referenz-Gen verwendet (siehe Tabelle 2 für GenBank ID-Nummern, Primer-Sequenzen, PCR-Produktgrößen und Gewebespezifität für jedes Gen). Wie erwartet, wurde myl7 stark in das "Herz" Probe angereichert im Vergleich zum "Embryo ohne Herz" Probe (Abb. 2B). Die endothelialer Zellmarker kdrl wurde gefunden, mäßig im Herzen Probe angereichert werden, wie zu erwarten (ca. 40% der Herzzellen bei 56 hpf sind kdrl -exprimierenden endokardiale Zellen) (Fig. 2B). Die Erythrozyten-Markierung hbbe1.1 wurde in das "Herz" Probe überrepräsentiert, auch wenn die Herzen waren stkrank schlagen nach der Sektion, die roten Blutkörperchen aus dem Herzen (Abb. 2B) zu vertreiben sollte. Im Gegensatz dazu waren die Expressionsniveaus des ZNS und Objektiv Marker (GFAP und CRYAA, respectively) in das "Herz" Probe (Fig. 2B) extrem niedrig. Insgesamt schließen wir, dass die Herz-Dissektion Protokoll Erträge hohe Qualität und herzspezifischen RNA aus ganzen Zebrafischembryonen.
Abbildung 1. Herz-Extraktion aus Zebrafischembryonen. (A) Schema, das den Herzextraktionsverfahren. Über 100 Live-Embryonen werden in einem 1,5-ml-Röhrchen (A1, B, B ') erhoben werden, betäubt und pipettiert nach oben und unten mehrere Male durch eine enge Pipettenspitze, um die Herzen zu lösen (A2) dann. Die resultierende Lösung, die die embryonale Gewebe (A2) wird dann auf eine 100-um-Filter (A3) angewendet. Embryonalem Gewebe ohne Eigelb und heARTS und große embryonalen Ablagerungen bleiben im Filter (A3). Der Durchlauf wird in einem 50 ml-Röhrchen (A3) gesammelt und dann auf einen 30 um-Filter (A4) angelegt. Die Herzen und kleine Abfallstücke werden in der 30 & mgr; m-Filter zurückgehalten und in einen kleinen Agarose-beschichtete Petrischale (A5, C, C ') übertragen wird. EGFP Herzen (C, C '; Pfeil) werden manuell aus dem verbleibenden Trümmer sortiert, wie Linsen (C, Pfeilspitze), und werden in RNAlater (A6) gesammelt. Diese Prozedur wird mindestens 5 mal wiederholt, und alle Herzen werden zur weiteren Verarbeitung zusammengeführt. (BC ') Überlagerung der Fluoreszenz (EGFP in grün) und DIC Bilder von Live-transgenen Tg (myl7: EGFP) twu34 Embryonen bei 56 HPF (B, C) und 36 HPF (B', C ') an zwei nicht von Herzen Dissektion Verfahren: vor der Embryo Dissektion (B, B ') und nur nach dem Spülen aus dem 30 um-Filter vor dem Sortieren der Herzen aus den Trümmern in der Petrischale (C, C'). Maßstabsbalken: 500 & mgr; m.
Abbildung 2. Analyse der RNA-Qualität und Reinheit durch Elektrophorese und RT-qPCR auf. (A) Gesamt-RNA aus dem "Herz" Probe (2 ul) und von der "Embryo ohne Herz" Probe (1 ul), ab 56 abgeleitet hpf Embryonen auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt. Prominent S18 und S28 rRNA-Banden zeigen, dass RNAs werden nicht abgebaut. (B) Relative Expression von gewebespezifischen Markern myl7 (Myokard), kdrl (Endothel), hbbe1.1 (Erythrozyten), CRYAA (Linse) und GFAP (ZNS), wie durch RT-qPCR für das "Herzstück" Probe bestimmt normiert auf den "Embryo ohne Herz" Probe. Die RT-qPCR-Experimente wurden als technische dreifach durchgeführt und die Daten werden als Mittelwert ± SEM angegeben. Ein ungepaarter t-Test-Analyse wurde durchgeführt. **** P <0,0001; ** P <0,005. bp Basenpaar.
| Proben-ID | ng / & mgr; | A260 | A280 | 260/280 | 260/230 | Cursor abs. | 340 raw |
| Herzen | 32,97 | 0.82 | 0.41 | 2.01 | 0,35 | 2,355 | 0,031 |
| Embryonen ohne Herz | 568,82 | 14,22 | 7.00 | 2.03 | 2.04 | 6,965 | 0,018 |
Tabelle 1 RNA-Menge und Qualität durch photometrische Messung. Die Quantität und Qualität der RNA des "Herz" und "Embryo ohne Herz" Proben aus 56 HPF Embryonen erhalten werden, wie spektrophotometrisch gemessen.
| gene | GenBank # | Primer-Sequenz | PCR-Produkt Größe (bp) | Gewebespezifische Marker |
| myl7 | BX248505 | F: 5'-ACAGCAAAGCAGACAGTGAA-3 ' | 163 | Myokard |
| R: 5'-TAACTCCATCCCGGTTCTGA-3 ' | ||||
| kdrl | CR759732 | F: 5'-ACAACGACACTGGCATCTAC-3 ' | 170 | Endothel / Endokard |
| R: 5'-TGTTCTACAGGGGACCACAA-3 ' | ||||
| GFAP | BX324157 | F: 5'-AGACAACTTGGCCTCAGAC-3 ' | 247 | Zentralnervensystem |
| R: 5'-ATCCACATGAACCTGTTGGG-3 ' | ||||
| CRYAA | BX248514 | 190 | Augenlinse | |
| R: 5'-TCAGACCTCACCTCAGAGAC-3 ' | ||||
| hbbe1.1 | BC095024 | F: 5'-TGGTTGTGTGGACAGACTTCGA-3 '8 | 102 | Erythrozyten |
| R: 5'-CGATAAGACACCTTGCCAGAGC-3 '8 | ||||
| eif1b | BX323079 | F: 5'-CAGAACCTCCAGTCCTTTGATC-3 '12 | 195 | Referenz-Gen |
| R: 5'-GCAGGCAAATTTCTTTTTGAAGGC-3 '12 |
Tabelle 2. Die Primer für die RT-qPCR-Experimente verwendet. Name, GenBank-Zugangsnummer, Reihenfolge, PCR-Produktgrößen und Gewebespezifität für alle analysierten Gene gezeigt.
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Discussion
Dieses Protokoll ermöglicht die rasche Anreicherung von Zebrafisch embryonalen Herzgewebe für Genexpressionsanalysen. Die Quantität und Qualität der herzspezifischen RNA-Probe hängt stark von einigen wenigen entscheidenden Schritte: Zunächst wird die Menge der Probe stark verbessert, wenn Verlust der Herzen wird bei jedem Schritt des Protokolls verhindert, da RNA-Reinigung wird nur bei ausreichender arbeiten Ausgangsmaterial. Zweitens ist die Reinheit der Probe, die vollständig auf der Experimentator abhängt, wird durch Sortieren und Sammeln von Herz in der Petrischale unter strikter Ausschluß anderer Gewebe bestimmt. Drittens Probenqualität hängt entscheidend von RNA-Abbau zu begrenzen, die auf Unterbrechungen der Embryonen auftreten können; Dies wird durch Verwendung von Zellkulturmedium, um den Zelltod zu verhindern, und indem die Proben auf Eis gelöst. RNA-Abbau wird gestoppt, sobald die Herzen wurden in RNAlater oder Trizol übertragen. Das Herz ist in der Petrischale schlägt kraftvoll zeigt, dass die Herz tThema ist physiologisch normalen nach der Sektion.
Wir empfehlen, mit mindestens 300 Herz (dh etwa 500 Embryonen), von dem genug RNA kann sicher (zusammen mit 5-10 ug Glykogen) ausgefällt werden. Wir können jedoch nicht ausschließen, als weniger Herz würde für kleinere Experimente ausreichen. Es ist lediglich wichtig, dass genügend RNA, die Konzentration, die Reinheit und Integrität der Probe zu bestimmen. Bitte beachten Sie, dass die RNA-Gehalte in Abhängigkeit von der Entwicklungsstufe und den genetischen Hintergrund des Embryos (zB im Falle von Mutanten mit einer abnormalen Herzen) variieren. Daher wäre die minimale Menge von Embryonen zu einem Experiment erforderlich sind, in jedem Einzelfall bestimmt werden.
Es gibt einige technische Unterschiede zwischen diesem Protokoll und einem früheren Protokoll von Burns und MacRae, und wir glauben nicht, dass es einen signifikanten Unterschied in der Effizienz oder Geschwindigkeit zwischen den beiden Protokollen.Allerdings haben wir Verbesserungen eingeführt: Am wichtigsten ist, empfehlen wir die Verwendung von RNAlater Stabilisierungslösung. Dies ist aus zwei Gründen wichtig: erstens, um qualitativ hochwertige RNA für weitere Experimente, wie RT-qPCR durch Verringerung der RNA-Abbau auf ein Minimum, da RNAlater inaktiviert sofort RNasen und stabilisiert RNA in Geweben oder Zellen zu sammeln. Zweitens ist RNAlater gebend dafür, dass die Sammlung von Herzen an verschiedenen Tagen, was wichtig ist, wenn die Anzahl der Embryonen ist ein limitierender Faktor. Es ermöglicht auch die Bündelung von den Herzen, die erforderlich sind, um eine ausreichende Menge an Ausgangsmaterial für eine effiziente Trennung von hochwertigen RNA mit Trizol erhalten. Übertragen der Herzen direkt in Trizol würde die Verwendung von RNAlater umgehen, jedoch wegen der Gesundheitsrisiken, dieser Schritt müssten unter einer chemischen Haube, die nicht angenommen werden können, um in der unmittelbaren Nähe des Fluoreszenzmikroskops für alle Experimentatoren angeordnet sein kann durchgeführt werden .
Wir fanden, tHat das Herz-Dissektion funktioniert gut mit Embryonen zwischen 20-72 HPF [12; unveröffentlichte Daten für 72 HPF]. Jedoch wird die Extraktionsverfahren schwieriger mit steigender embryonalen Alter und Dauer: zusätzliche und eindringlicher Pipettieren ist erforderlich, um die Embryonen in die lange Spitze erfolgreich einzuführen und die Herzen von anderen embryonalen Gewebe zu trennen. Dadurch ist mehr embryonale Trümmer im Probenvorbereitung vorhanden (siehe Abbildung 1C, C ') und der Versuchsleiter muss vorsichtiger sein bei der Sortierung die Herzen in der Petrischale.
Die hier vorgestellte Herzen Dissektion Protokoll ermöglicht eine Analyse des gesamten Herzexpressionsprofil verschiedener Zelltypen, einschließlich Myokard und Endokard. (: GFP myl7) twu34 und Tg (kdrl: weitere Trennung der kardialen Zelltypen kann mit endocardial- und myokardiale spezifische-Reporter Linien [zB Tg erreicht werden mCherry IS5] 9, 17 für Herzextraktion kombiniert mit FACS-Sortierung. Im Gegensatz zum Übersetzen Ribosome Affinity Purification (TRAP) Methode 18,19, die gewebespezifische Transkriptionsanalyse ermöglicht, ohne Gewebedissektion wird unser Ansatz nicht aktiv translatierten mRNAs beschränkt, sondern beinhaltet auch nicht-aktiv-translatierte mRNAs oder nichtkodierenden RNAs. Eine alternative Anwendung des Herzens Dissektion Protokolls ist es, Protein-Expression in Herz zu analysieren: Protein-Ebene kann durch Western-Blot und Proteinlokalisation beurteilt durch Immunhistochemie untersucht werden, wie der Anatomie des Herzens während der Dissektion Verfahren konserviert werden.
Zusammenfassend stellen wir hier ein detailliertes Protokoll zum Präparieren Funktions- / schlagenden Herzen von Hunderten von Embryonen in einer kurzen Zeit, die für den Erhalt von herzspezifischen RNA (oder Protein) Proben von hoher Reinheit für weitere Analysen verwendet werden kann.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment for raising fish and collecting eggs | see the Zebrafish Book11 for details | ||
| Fluorescence stereomicroscope | |||
| Refrigerated Microcentrifuge | |||
| UV-Spectrophotometer | e.g. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Nucleic acid electrophoresis chamber | |||
| Petri dishes 4 cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium | |||
| Micropipettes and tips (P20, P100, P1000) | |||
| 1.5 ml centrifugation tubes | |||
| 15 ml and 50 ml centrifugation tubes | |||
| Pair of Dumont #5 forceps | |||
| ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Phase lock gel, heavy, 1.5 ml tubes | Prime | 2302810 | |
| Egg water medium | 60 μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue | ||
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | ||
| Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 mg/ml Tricaine stock solution, pH 7 |
| 1% agarose (in E3 medium) | |||
| 1% agarose gel (in TBE buffer) | |||
| Leibovitz´s L-15 medium | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 µg/µl in RNase-free water |
| chloroform | |||
| isopropanol | |||
| 75% ethanol (in DEPC-ddH2O) | |||
| Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O | |||
| Nucleic acid loading buffer | |||
| TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis |
References
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