Summary
At analysere kardiale genekspressionsprofiler under zebrafisk hjerte udvikling, er den samlede RNA udvindes fra isolerede hjerter. Her præsenterer vi en protokol til opsamling funktionelle / slå hjerter ved hurtig manuel dissektion fra zebrafisk embryoner for at få hjerte-specifikke mRNA.
Abstract
Zebrafisken embryoniske hjerte er sammensat af kun et par hundrede celler, der kun repræsenterer en lille brøkdel af hele embryoet. Derfor, for at forhindre, at hjerte-transkriptomet bliver maskeret af den globale embryonale transkriptomet, er det nødvendigt at indsamle et tilstrækkeligt antal hjerter for yderligere analyser. Som zebrafisk hjerte-udvikling forløber hurtigt, hjerte indsamling og RNA-ekstraktionsmetoder skal være hurtig for at sikre ensartethed af prøverne. Her præsenterer vi en hurtig manuel dissektion protokol til indsamling funktionelle / slå hjerter fra zebrafisk embryoner. Dette er en væsentlig forudsætning for efterfølgende hjerte--specifik RNA-ekstraktion for at bestemme hjertets specifikke genekspressionsniveauer ved transkriptom analyser, såsom kvantitativ realtids-polymerasekædereaktion (RT-qPCR). Metoden er baseret på differentielle klæbeegenskaber zebrafisk embryoniske hjerte sammenlignet med andre væv; dette giver mulighed for hurtig grafisisk separation af hjerte fra ekstrakardiale væv ved en kombination af strømningsteknisk forskydningskraft afbrydelse trinvis filtrering og manuel samling af transgene fluorescensmærkede hjerter.
Introduction
Zebrafisk (Danio rerio) er meget udbredt i udviklingsmæssige biologi til at studere organogenesis in vivo på grund af sin hurtige, gennemsigtig og ekstrautrin fosterudvikling, kombineret med lille størrelse og tilgængeligheden af transgene reporter linjer med vævsspecifik ekspression af fluorescerende proteiner. Denne lille hvirveldyr er særlig velegnet til at studere hjerte udvikling, fordi iltning af den tidlige zebrafisk embryo ikke er afhængig af hjerterytme og blodgennemstrømning; disse funktioner har tilladt karakterisering af et stort antal cardiovaskulære mutanter 1,2 og zebrafisk er nu almindeligt anerkendt model organisme for at studere hjertesygdomme 3.
At studere genekspression under fosterudviklingen, er udskrifter almindeligvis analyseret af hel-mount in situ hybridisering (ønske) 4, RT-qPCR 5, microarrays 6 eller næste generation sekventering (RNA-Seq) 7. MensWISH tillader en rumligt tidsmæssig analyse af genekspression i hele embryo er transkriptniveauer vurderes normalt ved RT-qPCR, microarrays eller RNA-Seq tilgange. Men disse metoder kræver væv berigelse for specifik genekspression profilering.
Da den zebrafisk embryonale hjerte udgør en lille brøkdel af hele embryo, transkriptom undersøgelser under hjerte- udvikling kræver en protokol for dissektion og berigelse af hjerter. Desuden, for at opnå fysiologisk relevante data, er det vigtigt at opretholde hjertevævet fuldt funktionel indtil RNA-ekstraktion. Her beskriver vi en protokol for hurtigt at isolere fysiologisk normal og slå hjerter fra hundredvis af zebrafisk embryoner effektivt at opnå høj kvalitet RNA-prøver til yderligere analyser. Den nuværende metode er baseret på den protokol, rapporteret af Burns og MacRae 2006 8. Til berigelse af hjertevæv, begge metoder bruger en transgen myocardial reporter linjeog drage fordel af den differentierede adhæsionsegenskaber af zebrafisk embryonale hjerter versus andre væv. Kort fortalt ved pipettering mange embryoner op og ned gennem en smal pipettespids, hjerter samtidig frigivet fra embryonale organer og efterfølgende adskilt fra embryonale vragrester i to hurtig filtrering trin; fluorescensmærkede hjerter derefter manuelt sorteret fra resterende snavs og opsamles til videre forarbejdning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger retningslinjerne i den tyske og Berlin statens lovgivning dyr pleje; zebrafisk håndtering blev overvåget af kommunen for dyrebeskyttelse (LaGeSo, Berlin-Brandenburg).
1. Indhentning af zebrafisk embryoner til Heart Extraction
- Cross hjerte- reporter zebrafisk såsom Tg (myl7: EGFP) twu34 transgen linie 9 for at opnå embryoner med hjerte-specifikke GFP-ekspression.
- Opretholde embryonerne i ægget vand ved 28,5 ° C, indtil den ønskede fosterstadiet 10,11. Sørg for, at det indsamlede embryo befolkning er homogen både genetisk og ved udviklingsstadiet at begrænse udsving i genekspression.
- Dechorionate embryoner manuelt.
2. Dissecting Zebrafisk Embryonale Hearts
BEMÆRK: Hold alle løsningerne på is. Hvis det er muligt, gøre teamwork: én person dissekerer hjerter fra EMBryos mens en anden person Sorterer hjerter under fluorescens stereomikroskop. Dette tillader behandling af flere hundrede af embryoner i et par timer.
- Overfør ca. 100 embryoner i et 1,5 ml centrifugerør. Bedøve embryoner med tricaine (0,16 mg / ml i E3 medium). Fortsæt når embryonerne klart bedøvet (de ikke svømme og sediment på bunden af røret, men deres hjerter er stadig slår).
- Fjern tricaine / E3-opløsning og vaske embryoner gang med 1 ml L-15/10% FBS medium og vedligeholde på is.
BEMÆRK: L-15/10% FBS medium er vigtigt at holde organer og celler i live under hele dissektion procedure, indtil hjerterne er blevet overført til RNAlater eller Trizol. - Tilsæt 1 ml L-15/10% FBS medium til embryonerne og pipette op og ned 5-8 gange med en Round Gel Loading Tip indtil blommen er helt afbrudt. Pipette embryoner drop-wise på overfladen af opløsningen, således at dråben vil briste ogembryonerne forsigtigt afbrudt.
BEMÆRK: Hvor kraftigt, og hvor ofte de embryoner skal pipetteret op og ned afhængig af udviklingsstadiet af embryonerne, dvs. mere pipettering er nødvendig på sene stadier (f.eks ved 56 HPF). - For det første parti af dissekerede embryoner, vurderer integriteten af embryonerne og andelen af dissekerede hjerter under et stereomikroskop, da nogle hjerter kan blive siddende på embryoner, hvis for forsigtigt afpipetteret. Juster den måde af pipettering for de næste runder af dissektion overensstemmelse hermed.
BEMÆRK: Brug lav tilbageholdelse pipettespidser og mikrocentrifugerør at minimere hjerter stikning til plast. - Påføre prøven på et 100 um filter anbragt på en 50 ml centrifugerør; skylle 1,5 ml rør med 1 ml L-15/10% FBS-medium og derefter anvende dette til filteret for at minimere tab af prøven (nogle hjerter kunne klæbe til væggene af røret). Vask filteret to gange med 1 ml L-15/10% FBS. I dette trin hjerter passere gennem filteret og opsamles i 50 ml rør.
- Påfør gennemløbet på et 30 um filter, placeret på en 15 ml centrifugerør og skyl filteret gang med 1 ml L-15/10% FBS-medium. I dette andet filtreringstrin hjerterne tilbageholdes i filtret og mindre affald vaskes.
- Drej filteret på hovedet og skylles hjerter ud af filteret i en 1% agarose-coatet petriskål ved anvendelse af tre på hinanden følgende vaske med 1 ml L-15/10% FBS.
- Manuelt adskille GFP-positive hjerter fra ikke-fluorescerende embryonale debris (f.eks øjelinser) med en pincet under et fluorescens stereomikroskop og koncentrere dem i midten af skålen. Saml dem efter trin 3.
BEMÆRK: Hvis embryonerne er ældre end 24 HPF bør hjerter skal slå, hvilket indikerer, at vævet er stadig fysiologisk normal.
3. isolering af mRNA fra Dissected Hearts
- Saml hjerter i den mindst mulige mængde (fx 10 pi) og pipette i en 1,5 ml rør indeholdende 0,75 ml RNAlater (på is). Kontroller, at der ikke hjerter forbliver i pipettespidsen ved at se det under en fluorescens stereomikroskop.
- Alternativt, hvis en kemisk hætte findes i umiddelbar nærhed af fluorescensmikroskop overføre de indsamlede hjerter i Trizol (PAS) under kemisk stinkskab. Dette omgår det mulige tab af hjerter stikning i pipettespidsen og også under centrifugering af hjerter (trin 3.4, 3.5 og 3.7). Pool hjerter fra flere runder af isolation i det samme rør med Trizol og gå direkte til trin 3,8; den endelige volumen må ikke overstige 10% af den oprindelige Trizol volumen.
BEMÆRK: Læs Trizol sikkerhedsdatablad (MSDS), før brug. Håndtag Trizol reagens i et stinkskab og bær det anbefalede personlige værnemidler. Undgå kontakt med hud, øjne og tilbehør tng. Fjern alle antændelseskilder. - Pool hjerter fra flere runder af isolation i det samme rør med RNAlater (på is), da effektiviteten af RNA-isolering forbedres med mængden af væv opsamlet. Hvis den samlede mængde overstiger 10% af den oprindelige RNAlater volumen, skal du bruge et ekstra rør med 0,75 ml RNAlater til opbevaring (på is).
- Centrifugeres prøverne ved 15.700 xg i 20 minutter ved 4 ° C for at sedimentere hjerter.
- Under en fluorescens stereomikroskop, indsamle omhyggeligt så meget supernatant som muligt i en 1% agarose-coatet petriskål indeholdende 3 ml L-15/10% FBS-medium, men ikke forstyrrer de sedimenterede hjerter i bunden af centrifugerør. Da op til 15% af hjerter kan forblive i supernatanten på grund af den høje viskositet af RNAlater, hente dem som beskrevet i trin 3.7.
- Under en kemisk hætte, tilsættes 0,5 ml Trizol til røret indeholdende det sedimenterede hjerter og holde på is.
- Under fluorescerende microscoPE, overføre hjerter (fra trin 3.5) fra 1% agarose-coated skål indeholdende RNAlater / L-15/10% FBS opløsning i yderligere 1% agarose-coated skål med 3 ml L-15/10% FBS for at fortynde ud RNAlater. Saml hjerter i midten af petriskålen, og overføre dem i en lille mængde ind i røret af aflejrede hjerter i Trizol under en kemisk stinkskab.
- Vortex 1,5 ml rør indeholdende hjerter i Trizol at forstyrre hjerter og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Under en kemisk hætte, tilsættes 100 pi chloroform (ADVARSEL) og blandes grundigt og overføre Trizol / chloroform opløsning i en 1,5 ml præ-spundet PLG rør (centrifuge 30 sekunder ved maksimal hastighed før brug). Inkuber i 3 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Læs kloroform MSDS før brug. Håndtag chloroform reagens i et stinkskab og bær det anbefalede personlige værnemidler. Undgå kontakt med hud, øjne og tøj. Holdes væk fra uforligelige stoffer som metaller, alkalier. - CentrifuGE prøven ved 15.700 xg i 15 minutter ved 4 ° C og overføre den vandige fase til et nyt 1,5 ml rør.
- Tilføj 5-10 ug glycogen og 250 pi kølet (ved -20 ° C) isopropanol; bland godt og inkuberes natten over ved -20 ° C.
- Centrifugeres prøven ved 15.700 xg i 30 minutter ved 4 ° C og supernatanten fjernes.
- Vask pellet med 1 ml 75% ethanol, centrifugeres ved 15.700 xg i 15 minutter ved 4 ° C og supernatanten fjernes.
- Lad ethanol fordampe ved tørring pelleten ved stuetemperatur, indtil den bliver hvid (f.eks 10-15 min).
- Tilsæt 20 pi RNase-fri Hedeselskabet 2 O til pelleten og inkuberes i 10-15 minutter ved 55 ° C for at opløse RNA; derefter holde på is.
- Vurdere RNA koncentration og renhed ved absorbansmåling. Vurdere RNA integritet ved at køre prøven på en 1% agarosegel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her beskriver vi en repræsentativ hjerte dissektion eksperiment ved hjælp af zebrafisk Tg (myl7: GFP) twu34 transgen linje 9, som udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) udelukkende inden for myocardium (fig. 1). Vi indsamlede både dissekerede hjerter og embryoner, hvorfra de blev afledt til at vurdere renheden af hjertet prøven. Kort fortalt homozygot Tg (myl7: GFP) blev twu34 zebrafisk 9 udkrydsede med vildtype-så alle embryonale hjerte blev GFP mærket. Omkring 500 embryoner (56 HPF) blev overført til 1,5 ml rør (ca.. 100 embryoner i hver) (Fig. 1A1, 1B). Hvert rør blev behandlet som beskrevet i protokollen sektion (trin 2) og i figur 1A. Hjerter blev frigivet ved at pipettere op og ned flere gange (Fig. 1A2) og derefter påført på en 100 um filter (fig. 1A3). Store stykker af fostervæv blev bevaret i dette filter; denne fraktion blev hentet og sat i Trizol for RNA-ekstraktion for at opnå en "embryo uden hjerte" RNA-prøve (fig. 1A3). Gennemstrømningen indeholdende hjerter blev derefter påført på et 30 um filter (fig. 1A4), der bibeholdt hjerter og vævsrester af tilsvarende størrelse. GFP-positive hjerter blev skyllet ud af filteret i en agarose-coatet petriskål (Fig. 1A5, 1C), hurtigt samles i midten af skålen under en fluorescerende stereomikroskop og overført til 0,75 ml RNAlater (Fig. 1A6). Inden dette rør med RNAlater vi puljet hjerter afledt fra 5 dissektion runder. (Ca. 300 hjerter fra 500 embryoner repræsenterer en ekstraktionseffektivitet på ca. 60%). En sammenligning af hjerte prøver forud for sortering af affald fra fostre ved 56 HPF (Fig. 1C) versus 36 HPF (Fig. 1C) er vist i figur 1. På 56 HPF, afbrydelsen af embryoner gav mere embryonale vragrester ( såsom linser, pilespids, fig. 1C) end ved 36 HPF efter 30 um filtrering trin (fig. 1C).
For at bestemme renheden af 56 HPF "hjerte" prøve sammenlignede vi ekspressionsniveauerne af hjerte- versus ekstra hjerte- transkripter i "hjerte" og "embryo uden hjerte" prøver ved hjælp af RT-qPCR. Til dette formål har vi ekstraheret mRNA fra disse to prøver og vurderet RNA kvalitet på en agarosegel (figur 2A) og mængde ved absorbans måling (tabel 1) som beskrevet i protokollen sektion (trin 3). Den ca. 300 hjerter gav 660 ng RNA. Derefter blev cDNA syntetiseret under anvendelse af M-MLV Reverse transcriptase RNase H (-) og vilkårlige hexamerer i overensstemmelse med producentgaranti instruktioner, og RT-qPCR eksperimenter blev udført som beskrevet 12. Relative genekspressionsniveauer blev beregnet for forskellige vævsspecifikke markører, såsom myosin lys polypeptid 7 [myl7 en myocardial markør] 9, kinase insert-domæne receptor-lignende [kdrl, en endotel / endokardial markør] 13, hæmoglobin beta embryonale-1.1 [hbbe1.1, en erythrocyt markør] 14 crystallin-alpha A [cryaa en øjelinsens markør] 15 og glial fibrillært surt protein [GFAP, et centralnervesystem markør] 16 (figur 2B). Zebrafisken eukaryot translationsinitiering faktor 1B [eif1b] 12 blev anvendt som en intern reference-genet (se tabel 2 for GenBank ID-numre, primersekvenser, PCR-produkt størrelser og vævsspecificitet for hvert gen). Som forventet blev myl7 højt beriget i "hjerte" prøve i forhold til den "embryo uden hjerte" prøve (fig. 2B). Den endotelcelle markør kdrl fandtes at være moderat beriget i hjertet prøve, som forventet (ca. 40% af hjerteceller ved 56 HPF er kdrl udtrykkende endokardiale celler) (fig. 2B). Den erythrocyt markør hbbe1.1 blev overrepræsenteret i "hjertet" prøve, selv om hjerter var stsyg slå efter dissektion, som bør udvise røde blodlegemer fra hjertet (Fig. 2B). I modsætning hertil ekspressionsniveauerne af CNS og linsen markører (GFAP og cryaa, henholdsvis) var yderst lavt i "hjerte" prøve (fig. 2B). Alt i alt konkluderer vi, at hjertet dissektion protokol udbytter høj kvalitet og hjerte-specifikke RNA fra hele zebrafisk embryoner.
Figur 1. Heart ekstraktion fra zebrafisk embryoner. (A) Scheme afbilder hjertet ekstraktionsprocedure. Omkring 100 levende embryoner opsamles i et 1,5 ml rør (A1, B, B '), bedøvet og derefter pipetteret op og ned adskillige gange gennem en smal pipettespids at frigive hjerter (A2). Den resulterende opløsning indeholdende de embryonale væv (A2) påføres derefter på et 100 um filter (A3). Embryonale væv uden æggeblomme og hearts, og store embryonale rester forbliver i filteret (A3). Gennemstrømningen opsamles i et 50 ml rør (A3) og derefter påført på en 30 um filter (A4). Hjerterne og små rester er bevaret i 30 um filter og overført til en lille agarose-coatet petriskål (A5, C, C '). EGFP mærkede hearts (C, C '; pil) manuelt sorteret fra de resterende rester, såsom linser (C, pilespids), og opsamles i RNAlater (A6). Denne procedure gentages mindst 5 gange, og alle hjerter samles sammen til yderligere behandling. (BC) overlejring af fluorescens (EGFP i grøn) og DIC billeder af levende transgene Tg (myl7: EGFP) twu34 embryoner ved 56 HPF (B, C) og 36 HPF (B ', C') på to trin i hjertet dissektion procedure: før embryo dissektion (B, B '), og lige efter skylning fra 30 um filter, før sortering hjerter fra vragrester i petriskålen (C, C'). Scale bar: 500 um.
Figur 2. Analyse af RNA kvalitet og renhed ved elektroforese og RT-qPCR hhv. (A) Total RNA fra "hjerte" prøve (2 pi) og fra "embryo uden hjerte" prøve (1 pi), der stammer fra 56 HPF embryoner, opløst på en 1% agarosegel. Fremtrædende S18 og S28 rRNA bands angive, at RNA'er ikke nedbrydes. (B) relative ekspressionsniveauer af vævsspecifikke markører myl7 (myocardium), kdrl (endotel), hbbe1.1 (erytrocytter), cryaa (linse) og GFAP (CNS) som bestemt ved RT-qPCR til "hjerte" prøve normaliseret til "embryo uden hjerte" prøve. RT-qPCR eksperimenter blev udført som tekniske tredobbelte og gives data som middelværdi ± SEM. En uparret t-test blev udført. **** P <0,0001; ** P <0,005. bp, basepar.
| prøve-ID | ng / pl | A260 | A280 | 260/280 | 260/230 | cursor abs. | 340 rå |
| hjerter | 32.97 | 0,82 | 0,41 | 2.01 | 0,35 | 2,355 | 0,031 |
| embryoner uden hjerte | 568,82 | 14.22 | 7,00 | 2.03 | 2.04 | 6,965 | 0,018 |
Tabel 1. RNA mængde og kvalitet ved spektrofotometrisk måling. Mængden og kvaliteten af RNA af "hjerte" og "embryo uden hjerte" prøver fra 56 HPF embryoner som målt ved spektrofotometri.
| gene | GenBank # | primersekvens | PCR-produkt størrelse (bp) | Vævsspecifik markør |
| myl7 | BX248505 | F: 5'-ACAGCAAAGCAGACAGTGAA-3 ' | 163 | myocardium |
| R: 5'-TAACTCCATCCCGGTTCTGA-3 ' | ||||
| kdrl | CR759732 | F: 5'-ACAACGACACTGGCATCTAC-3 ' | 170 | endotel / endocardium |
| R: 5'-TGTTCTACAGGGGACCACAA-3 ' | ||||
| GFAP | BX324157 | F: 5'-AGACAACTTGGCCTCAGAC-3 ' | 247 | centralnervesystemet |
| R: 5'-ATCCACATGAACCTGTTGGG-3 ' | ||||
| cryaa | BX248514 | 190 | øjelinse | |
| R: 5'-TCAGACCTCACCTCAGAGAC-3 ' | ||||
| hbbe1.1 | BC095024 | F: 5'-TGGTTGTGTGGACAGACTTCGA-3 '8 | 102 | erythrocyt |
| R: 5'-CGATAAGACACCTTGCCAGAGC-3 '8 | ||||
| eif1b | BX323079 | F: 5'-CAGAACCTCCAGTCCTTTGATC-3 '12 | 195 | henvisning gen |
| R: 5'-GCAGGCAAATTTCTTTTTGAAGGC-3 '12 |
Tabel 2. Primere anvendt til RT-qPCR forsøg. Navn, Genbank, sekvens, PCR-produkt størrelser og væv-specificitet er vist for alle gener analyseres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol giver mulighed for hurtig berigelse af zebrafisk embryonale hjertevæv til genekspression analyser. Mængden og kvaliteten af hjerte--specifikke RNA-prøve i høj grad afhænger af et par afgørende trin: først, er mængden af prøven væsentligt forbedret, hvis tab af hjerter forhindres på alle trin i protokollen, da RNA oprensning kun vil arbejde med tilstrækkelig udgangsmateriale. For det andet, renheden af prøven, der afhænger helt af forsøgslederen, bestemmes ved at sortere og indsamle hjerter i petriskålen under streng udelukke andre væv. For det tredje prøve kvalitet kritisk afhænger begrænse RNA nedbrydning, som kan forekomme ved afbrydelse af embryonerne; dette opnås ved hjælp af cellekulturmedium for at undgå celledød og ved at holde prøverne på is. RNA nedbrydning stoppes, når hjerterne er blevet overført til RNAlater eller Trizol. Det hjerter slå i petriskålen kraftigt viser, at hjertets tSpørgsmålet er fysiologisk normal efter dissektion.
Vi anbefaler at starte med mindst 300 hjerter (dvs. omkring 500 embryoner), hvorfra nok RNA sikkert kan udfældes (sammen med 5-10 ug glykogen). Men vi kan ikke udelukke, end færre hjerter ville være tilstrækkeligt for små eksperimenter. Det er simpelthen vigtigt at have tilstrækkelig RNA for at bestemme den koncentration, renhed og integritet af prøven. Bemærk venligst, at RNA-indhold kan variere afhængigt af udviklingsstadiet og den genetiske baggrund af embryo (eksempelvis i tilfælde af mutanter med unormale hjerter). Derfor vil den minimale mængde af embryoner, der er nødvendige for et eksperiment skal bestemmes i hvert enkelt tilfælde.
Der er kun få tekniske forskelle mellem denne protokol og en tidligere protokol ved Burns og MacRae, og vi tror ikke, at der er en væsentlig forskel i effektivitet eller hastighed mellem de to protokoller.Men vi har indført forbedringer: Vigtigst, foreslår vi brug af RNAlater stabilisering løsning. Dette er vigtigt af to grunde: for det første at indsamle RNA høj kvalitet til yderligere eksperimenter såsom RT-qPCR ved at reducere RNA nedbrydning til et minimum, da RNAlater straks inaktiverer RNaser og stabiliserer RNA inden væv eller celler. Andet RNAlater er afgørende for, at indsamling af hjerter på forskellige dage, hvilket er vigtigt, når antallet af embryoer er en begrænsende faktor. Det giver også samle hjerter, som kan være nødvendig for at opnå en tilstrækkelig mængde af udgangsmateriale til effektiv isolering af høj kvalitet RNA med Trizol. Overførsel hjerter direkte ind Trizol ville omgå anvendelsen af RNAlater, men på grund af sundhedsrisici, dette trin skulle udføres under en kemisk hætte, som ikke kan antages at være placeret i umiddelbar nærhed af fluorescensmikroskop for alle eksperimentatorerne .
Vi fandt that hjertet dissektion fungerer godt med embryoner mellem 20-72 HPF [12; upublicerede data for 72 HPF]. Imidlertid bliver vanskeligere med stigende embryonale alder og længde udvinding procedure: supplerende og mere insisterende pipettering er nødvendigt for en vellykket indføre embryoner i den lange spids og at adskille hjerter fra andre embryonale væv. Som et resultat, mere embryonale vragrester er til stede i prøveforberedelse (se figur 1 C, C ') og forsøgslederen skal være mere omhyggelige med at sortere hjerter i petriskål.
Hjertet dissektion protokol præsenteres her tillader en analyse af hele hjerte- ekspressionsprofil af forskellige celletyper, herunder myocardium og endocardium. Yderligere adskillelse af hjerte-celletyper kunne opnås ved hjælp af endocardial- og myokardie-specifik-reporter linjer [f.eks Tg (myl7: GFP) twu34 og Tg (kdrl: mCherry IS5] 9, 17 for hjerte ekstraktion kombineret med FACS sortering. I modsætning til Omsætning Ribosome Affinitetsrensning (TRAP) metode 18,19, hvilket tillader vævsspecifik transkriptionel analyse uden væv dissektion, er vores fremgangsmåde ikke begrænset til aktivt oversatte mRNA'er, men omfatter også ikke-aktivt oversatte mRNA'er eller ikke-kodende RNA'er. En alternativ anvendelse af hjertet dissektion protokollen er at analysere proteinekspression i hjerter: proteinniveauer kan vurderes ved Western blot og proteinlokalisering kan analyseres ved immunohistokemi, som anatomi hjertet er bevaret under dissektion procedure.
Sammenfattende præsenterer vi her en detaljeret protokol for dissekering funktionelle / beating hjerter fra hundredvis af embryoner i en kort tid, som kan anvendes til opnåelse af hjerte-specifikt RNA (eller protein) prøver af høj renhed til yderligere analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment for raising fish and collecting eggs | see the Zebrafish Book11 for details | ||
| Fluorescence stereomicroscope | |||
| Refrigerated Microcentrifuge | |||
| UV-Spectrophotometer | e.g. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Nucleic acid electrophoresis chamber | |||
| Petri dishes 4 cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium | |||
| Micropipettes and tips (P20, P100, P1000) | |||
| 1.5 ml centrifugation tubes | |||
| 15 ml and 50 ml centrifugation tubes | |||
| Pair of Dumont #5 forceps | |||
| ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Phase lock gel, heavy, 1.5 ml tubes | Prime | 2302810 | |
| Egg water medium | 60 μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue | ||
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | ||
| Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 mg/ml Tricaine stock solution, pH 7 |
| 1% agarose (in E3 medium) | |||
| 1% agarose gel (in TBE buffer) | |||
| Leibovitz´s L-15 medium | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 µg/µl in RNase-free water |
| chloroform | |||
| isopropanol | |||
| 75% ethanol (in DEPC-ddH2O) | |||
| Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O | |||
| Nucleic acid loading buffer | |||
| TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis |
References
- Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
- Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish. Development. 123, 293-302 (1996).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends Genet. 10, 73-74 (1994).
- Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001 (1996).
- Epstein, C. B., Butow, R. A. Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).
- Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics. OMICS. 18, 98-110 (2014).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. Biotechniques. 40, 274-278 (2006).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th, University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Veerkamp, J., et al. Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry). Dev Cell. 24, 660-667 (2013).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Brownlie, A., et al. Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish. Dev Biol. 255, 48-61 (2003).
- Marvin, M., et al. Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins. Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).
- Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain. Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
- Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
