CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.
The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.
Recent advances in genome engineering technology have allowed for unprecedented opportunities for site-specific modification of the genome. This technology may be utilized to investigate the function of genes and regulatory elements via prospective genetic perturbation. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription-activator like (TAL) effector nucleases (TALENs), and CRISPR/Cas9 RNA-guided nucleases each leverage customizable DNA specificity to localize a nuclease for the introduction of DSBs1–3. The resulting DSBs can be repaired by indel-forming NHEJ or by homology-directed repair (HDR) using a donor template4.
The CRISPR/Cas9 nuclease pathway, an adaptive immune system in prokaryotic cells5, has been recently adapted for mammalian genome engineering2,3. This tool has been demonstrated to be an inexpensive, efficient, and reliable genome engineering technique6. Briefly, a complex of Streptococcus pyogenes-derived Cas9 nuclease and a sgRNA achieve target recognition via Watson-Crick base-pairing with cognate genomic DNA sequences. sgRNAs include 20-mer sequences complementary to genomic sequences adjacent to an obligate protospacer adjacent motif (PAM) NGG. Cas9 induces a DSB at a predictable position within the target site. Additionally, variants of Cas9 with single-strand cleavage capacity or catalytic inactivity may be used to facilitate “nicking” or transcriptional regulation respectively7–9. CRISPR/Cas9 has been used for a wide range of applications including both knock-in and knockout10,11, large-scale genomic deletions12–14, pooled library screening for gene discovery15,16, genetic engineering of numerous model organisms10,11,17–21, as well as gene therapy22,23.
Here we describe a protocol for efficient deletion of desired genomic regions. The protocol includes CRISPR design, cloning, and delivery, as well as deletion, identification, and characterization. Genomic deletions can be generated by the introduction of two CRISPR sgRNAs with Cas9 to induce repair of the resultant two DSBs by NHEJ with deletion of the intervening segment. This strategy has been used to create deletions ranging from one kilobase to over one megabase12. Deletions can be informative for the study of genes and other genetic elements, either in isolation or in combination. There are several potential advantages of genomic deletions as compared to HDR or single-site small indel production. First, this method capitalizes on the high efficiency of NHEJ in many cellular contexts7. The high frequency of deletion limits the number of clones needed to be screened to identify informative clones. Deletion frequency is inversely related to deletion size. Biallelic deletion clones may be retrieved at frequencies at least as great as of probabilistic expectation12. Second, both monoallelic and biallelic deletions may be easily identified and distinguished by conventional PCR, simplifying the screening process. Strategies relying on small indels or point mutations may require RFLP, allele-specific PCR, T7EN1 cleavage assay, Sanger sequencing, RT-qPCR, or immunoblotting, which may be more laborious. Third, by removing a substantial portion of a gene or element of interest, a reliable loss-of-function allele may be obtained. In contrast, frameshift mutations in protein-coding sequences may not always induce nonsense-mediated decay, may produce a hypomorphic or neomorphic allele, or target an exon excluded from an alternate isoform24. Finally, deletions may be particularly revealing for the study of non-coding DNA such as regulatory elements since frameshift mutations as produced by single-site indels would not be relevant25.
CRISPR / Cas9 시스템 등 다양한 크기의 게놈의 결실을 생성하기 위해 사용될 수있다. 우리는 삭제의 주파수가 의도 삭제 크기에 대하여 반비례 관찰했지만, 우리는 정기적으로 여러 배체 삭제 클론을 얻을 1백킬로바이트까지 최대 1 메가의 삭제 및 삭제를 복구 할 수 있었다. 우리는 세포 라인에 순차적으로 도입 삭제의 효율 손실을 관찰 없다. 이 전략은 다수의 유전자와 요소의 조합 삭제의 생성에 사용할 수 있습니다. 삭제 배체 클론을 얻는 과정은 12 배체 결실 클론의 수를 얻기 위해 결실 크기에 따라 선별 될 필요 클론의 최소 수를 추정함으로써 신속 할 수있다.
확률 분포 배체 삭제 부재와 monoallelic 삭제를 수득하는 능력은 완전한 기능의 상실과 관련된 세포 치사를 나타낼 수있다. 낮은 FRequency 결석 삭제는 가난한 형질 전환, 비효율적 sgRNAs 또는 (때문에 양성 대조군의 부족으로 삭제 화면에 PCR 프라이머의 유효성을 검사) 비효율적 인 PCR 검사 프라이머를 포함하는 시나리오의 수를 반영 할 수있다. GFP + 세포는 형질 전환 효율 (단계 5.2 참조) 대용으로 사용할 수 있도록 GFP + 세포의 감소 가능성이 불량한 형질을 반영하고 결과적인 결실은 효율을 감소시켰다. 비효율적 sgRNA에 대한 제어를 할 수 있습니다 독립적 인 심사 프라이머와 두 개의 서로 다른 sgRNA 쌍을 사용하여 PCR 프라이머를 선별하고 배체 삭제 클론을 얻을 기회를 극대화 할 수 있습니다. GFP + 세포 정렬 셀은 삭제 대립 유전자에 대한 풍부. 이 단계를 생략 할 수 있지만, 누락 가능성이 monoallelic 또는 배체 삭제 가진 사람을 식별하는 데 더 클론을 선별 필요로합니다. 형질 전환 효율이 최적화 될 수 있음도, 우리는 게놈 편집 효율을 향상시킬 것으로 기대된다.
<p c아가씨 = "jove_content"대상 사이트의 삽입과 삭제의 다양한 대립 유전자의 일련의 삭제 및 로컬 복구 결과를 기초> NHEJ 이벤트. 10 bp의 삽입 또는 더 일반적으로 sgRNA 지시 분열 (그림 2B)의 사이트에서 삭제 – 주된 결과는 작은 ~ 1입니다. 종종 이러한 대립은 microhomology 기반 수리 34, 35의 결과로 나타납니다. 우리가 설명-PCR 기초 검출 전략 크게 또는 더 복잡한 삽입, 결실, 역위 또는 재 배열을 확인하지 않은 경우도있다. 이러한 이벤트는 덜 일반적이지만, 우리는 모두 삭제하거나 비 삭제 증폭 산물이 검출 될 수있는 클론을 관찰하고, 추가 조사에이 더 복잡한 결과를 반영했다.우리는 광범위한 CRISPR가 / monoallelic 및 비 삭제 클론에서 비 삭제 대립 유전자의 "상처"를 Cas9이 매개 관찰 (그림 2B 참조). 이러한 "상처"구성의도없이 삭제 sgRNA 절단 부위에서 생산 작은 삽입이나 삭제 (즉, sgRNAs와 B 사이의 중간 세그먼트의 삭제). 이러한 흉터는 종종 sgRNA에 의해 대상 인식을 중단. 그러므로 우리는 이전에 같은 sgRNAs를 사용 sgRNAs에 노출 된 세포에서 대립 유전자 타겟 변경에주의를 촉구한다. 독특한 sgRNA을 활용 것보다 성공적인 리 타겟팅 전략은 이전에 "상처"인식 부위 구별 시퀀스. 경우 sgRNAs의 쌍 (도 1b, 바닥), 틀 이동 대립 유전자의 결실에도 부재하에 제조 될 수있다 엑손 서열을 인식 할 때. 따라서 monoallelic 결실 클론 의한 대립 유전자 (12)에서 삭제되지 않은 프레임 이동 돌연변이의 고주파로 기능 상실 용 풍부 할 수있다.
38 – CRISPR / Cas9 시스템과 하나의 관심사는 오프 – 타겟 효과, 즉, 의도하지 않은 사이트 (36)에서 유전자 변형이다. Recent 보고서 (17)와 짧은 가이드 RNA를 제안했다 – 19 뉴클레오티드가 CRISPR의 빈도를 줄일 수 / 오프 대상 효과 39 Cas9는 기반. 또한 nickase으로 목표 부위 당 두 개의 가이드를 사용하여 이중 칼자국내는 전략은 오프 – 타겟 효과 (7)을 최소화하면서 DSBs를 생성하는데 사용될 수있다. 대안 적으로, RNAi를 사용 전략과 유사한, 우리는 비 중첩 protospacer 서열과 sgRNAs 상이한 쌍 오프 – 타겟 잠재 대조적으로 관찰 표현형 온 타겟 CRISPR / Cas9 수정의 결과가 있음을 입증하는 데 사용될 수 있음을 시사 효과. 편리한 방법은 선별 프라이머 (공정 2 참조)의 하나의 세트는 다중 sgRNA 쌍 (도 1a)에 사용될 수 있도록 적어도 두 개의 인접하지만 비 중첩 sgRNA 쌍을 설계하는 것이다. 또한, 누락 된 순서 및 / 또는 파쇄를 재 도입 유전자 결실 세포주를 보완하면 사이의 인과 관계를 입증 할 수있는주어진 게놈 삭제 및 표현형.
셀룰러 모델 시스템 작업 생물 학자, RNAi의이 기능 유전체학을위한 강력한 도구를 대표했다. 42 – 그러나,이 방법의 제한 대상의 mRNA 전 사체 수준 불완전 환원, 동일한 유전자 타겟팅 독립적 시약의 효과의 이질성, 종자 계 및 비 시드 효과 (40)를 포함한 공지 된 오프 – 타겟 효과를 포함했다. 게놈 편집 전략은 이러한 문제의 대부분을 해결하기 위해 약속과 미래의 유전 적 교란 8,36,37에 대한 흥미로운 보완적인 접근 방식을 나타냅니다. 또한, 게놈 RNAi를 편집 가능하고, 종래의 표적으로하지 도전 방식으로 유전 적 요소를 비 – 코딩 (25)의 접근을 허용 연구. 우리는 생산 및 기능 상실 대립 유전자의 특성을 강력하고 구체적인 방법으로 CRISPR / Cas9에 의해 게놈 삭제의 생성을 권장합니다.
The authors have nothing to disclose.
Thanks to Jason Wright for suggesting the Golden Gate Assembly cloning strategy and Katherine Helming and members of Orkin lab, particularly Jian Xu, Guoji Guo, Elenoe Smith, and Partha Das for helpful discussions. This work was supported by NIH R01HL032259 and P30DK049216 (Center of Excellence in Molecular Hematology) to S.H.O. and NIDDK K08DK093705 to D.E.B.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
T4 DNA Ligase (with associated ligation buffer) | New England Biolabs | M0202T | |
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
BSA, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | B9000S | |
BbsI Restriction Enzyme (with associated NEB Buffer 2.1) | New England Biolabs | R0539S | |
pSpCas9(BB) (pX330) | Addgene | 42230 | |
S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
BTX ECM 830 | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
BTX Solution and 2mm Cuvettes | Harvard Apparatus | 45-0803 | |
pmaxGFP Plasmid | Lonza | VPA-1003 | |
QuickExtract DNA Extraction Solution | Epicentre | QE09050 | |
HotStarTaq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 203443 | |
Zero Blunt PCR Cloning Kit | Life Technologies | K2700-20 |