Генерация геномных делеций в линии клеток млекопитающих, через CRISPR / Cas9

Summary

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Abstract

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

Introduction

Recent advances in genome engineering technology have allowed for unprecedented opportunities for site-specific modification of the genome. This technology may be utilized to investigate the function of genes and regulatory elements via prospective genetic perturbation. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription-activator like (TAL) effector nucleases (TALENs), and CRISPR/Cas9 RNA-guided nucleases each leverage customizable DNA specificity to localize a nuclease for the introduction of DSBs^1–3. The resulting DSBs can be repaired by indel-forming NHEJ or by homology-directed repair (HDR) using a donor template⁴.

The CRISPR/Cas9 nuclease pathway, an adaptive immune system in prokaryotic cells⁵, has been recently adapted for mammalian genome engineering^2,3. This tool has been demonstrated to be an inexpensive, efficient, and reliable genome engineering technique⁶. Briefly, a complex of Streptococcus pyogenes-derived Cas9 nuclease and a sgRNA achieve target recognition via Watson-Crick base-pairing with cognate genomic DNA sequences. sgRNAs include 20-mer sequences complementary to genomic sequences adjacent to an obligate protospacer adjacent motif (PAM) NGG. Cas9 induces a DSB at a predictable position within the target site. Additionally, variants of Cas9 with single-strand cleavage capacity or catalytic inactivity may be used to facilitate “nicking” or transcriptional regulation respectively^7–9. CRISPR/Cas9 has been used for a wide range of applications including both knock-in and knockout^10,11, large-scale genomic deletions^12–14, pooled library screening for gene discovery^15,16, genetic engineering of numerous model organisms^{10,11,17–21}, as well as gene therapy^22,23.

Here we describe a protocol for efficient deletion of desired genomic regions. The protocol includes CRISPR design, cloning, and delivery, as well as deletion, identification, and characterization. Genomic deletions can be generated by the introduction of two CRISPR sgRNAs with Cas9 to induce repair of the resultant two DSBs by NHEJ with deletion of the intervening segment. This strategy has been used to create deletions ranging from one kilobase to over one megabase¹². Deletions can be informative for the study of genes and other genetic elements, either in isolation or in combination. There are several potential advantages of genomic deletions as compared to HDR or single-site small indel production. First, this method capitalizes on the high efficiency of NHEJ in many cellular contexts⁷. The high frequency of deletion limits the number of clones needed to be screened to identify informative clones. Deletion frequency is inversely related to deletion size. Biallelic deletion clones may be retrieved at frequencies at least as great as of probabilistic expectation¹². Second, both monoallelic and biallelic deletions may be easily identified and distinguished by conventional PCR, simplifying the screening process. Strategies relying on small indels or point mutations may require RFLP, allele-specific PCR, T7EN1 cleavage assay, Sanger sequencing, RT-qPCR, or immunoblotting, which may be more laborious. Third, by removing a substantial portion of a gene or element of interest, a reliable loss-of-function allele may be obtained. In contrast, frameshift mutations in protein-coding sequences may not always induce nonsense-mediated decay, may produce a hypomorphic or neomorphic allele, or target an exon excluded from an alternate isoform²⁴. Finally, deletions may be particularly revealing for the study of non-coding DNA such as regulatory elements since frameshift mutations as produced by single-site indels would not be relevant²⁵.

Protocol

1. CRISPR Дизайн Дизайн sgRNAs вручную или с помощью свободно доступных онлайновых инструментов 7. Используйте эти инструменты, чтобы помочь определить направляющие последовательности, которые сводят к минимуму идентичные геномные матчи или почти матчей, чтобы снизить риск расщепления от сайтов-мишеней (вне целевой эффекты). Убедитесь, что направляющие последовательности состоят из 20-Мер («последовательность protospacer") вверх по течению из "NGG" последовательности ("protospacer рядом мотив" или PAM) на сайте геномной распознавания. ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 приведены возможные стратегии удаления для генов и некодирующих элементов. Для создания гена нокаут, два sgRNA, расположенные в пределах экзонов обогатит даже моноаллельной удаления, клоны потери функции. Это связано с высокой частотой вставкам, образованных на не-удалены аллелей 12, которые могут вызвать мутации сдвига рамки считывания, ведущие к нонсенс опосредованного распада мРНК транскрипта (Фиг.1В). ИспользуйтеПример руководства для предполагаемого удаления PIM1 у мышей (Mus Musculus; Таблица 1, Рисунок 2А). ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере, последовательность protospacer sgRNA-A и PAM, случается, падаете на дно (Крик) нити, а последовательность protospacer sgRNA-B и PAM падают на верхний (Watson) нити (рис 2а). Тем не менее, DSB будет происходить независимо от ориентации protospacer последовательность / PAM по отношению к верхней или нижней нити. Определить обратный комплемент (RC) каждой последовательности направляющей. Пример обратной комплементарной последовательности в PIM1 sgRNA из таблицы 1 можно найти в таблице 2. Получить 24- или 25-мерные олиго для каждой направляющей и связанной с обратной комплементарной включая дополнительные нуклеотидов для клонирования и экспрессии целей. ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы обсуждаем использование на pSpCas9 (BB) плазмиды (pX330) (Addgene плазмиды ID 42230). Эта плазмида дает возможность одновременногоВыражение sgRNA и SpCas9, но не содержит маркеры для отбора 7. Другие конструкции могут быть использованы, например, pX458 (Addgene плазмиду ID 48138) или pX459 (Addgene плазмиды ID 48139), которые включают GFP и пуромицин, как селективные маркеры, соответственно, или конструкции, в которой множество sgRNAs может быть выражена в одной плазмиде. Добавить "CACC" перед направляющей последовательности 20-мерной и "AAAC" перед обратной комплементарной гида для клонирования в вектор pX330 с использованием BbsI рестрикции (таблица 3). Добавить G нуклеотид после последовательности CACC и до 20-Мер, если первая позиция 20-мера не Г. sgRNA выражение из U6 промотора вектора pX330 усиливается за счет включения в G нуклеотида после последовательности CACC , Добавить C в 3'-конце обратного комплемента олиго (например, sgRNA-в таблице 4). Полученные олигонуклеотиды будет 25-мерных олигонуклеотидов. Каккогда-либо, если первая позиция 20-Мер (последовательности protospacer) является G, не добавить еще один G (например, sgRNA-B в таблице 4) и не добавлять С до конечного положения обратном комплемента олиго. В этом случае, полученные олигонуклеотиды были бы 24-мерных олигонуклеотидов (таблица 4). 2. Дизайн Делеционные скрининга Грунтовки Дизайн один набор праймеров внутренних последовательности должны быть удалены ("не удалить группу"), а другой набор праймеров вверх и вниз по течению сайтов sgRNA расщепления ("удаление группы"; рисунках 1 – 2). В отсутствие делеции, "удаление группа" часто слишком велик, чтобы эффективно амплифицировать. Обычно используют праймеры, по крайней мере 100 п.н. от предсказанного сайта расщепления, чтобы обеспечить обнаружение не будет воздействию небольшого INDEL на целевом сайте sgRNA. Дизайн дополнительные праймеров для анализа шрамов (небольшие вставкам, произведенные в sgRNA сleavage сайт без предполагаемого удаления). Используйте пару прямого и обратного праймеров, фланкирующих каждый целевой сайт sgRNA (в пределах 150 – 350 б.п.), чтобы усилить целевой сайт sgRNA для изучения шрамов. Это может быть полезно характеризовать не удаленных аллель в моноаллельной делеции клонов. Для небольших делеций (как "удаление группы" все еще может усилить), разрешить ампликонов в агарозном геле, чтобы определить, является ли размер в соответствии с наличием или отсутствием делеции. Для этого подхода, внутренние праймеры, описанные в шаге 2.1 может быть опущено. 3. CRISPR Клонирование Отжига и фосфорилирования олигонуклеотидов. Ресуспендируйте олигонуклеотиды в концентрации 100 мкМ в DDh 2 O. Подготовка 10 мкл реакционной смеси для каждой направляющей и свою оборотную дополнение: 1,0 мкл sgRNA 24- или 25-мерный олиго (100 мкМ; см шаг 1,4), 1,0 мкл sgRNA 24- или 25-мерный обратной complemenт олиго (100 мкМ; см шаг 1,4), 1,0 мкл 10х буфера для лигирования Т4, 6,5 мкл DDH 2 O и 0,5 мкл Т4 полинуклеотидкиназы (ПНК) (10000 ЕД / мл). ПРИМЕЧАНИЕ: Фосфорилированные олигонуклеотиды могут быть заказаны вместо этого. Для этого подхода, использование Т4 ПНК опущено. Отжиг в амплификаторе, используя следующие параметры: 37 ° C в течение 30 мин; 95 ° С в течение 5 мин и затем снижает частоту до 25 ° С со скоростью 5 ° С / мин. Развести олигонуклеотидов 1:10 в DDH 2 O (например, 1,0 мкл отожженных олиго + 9,0 мкл DDH 2 O с получением концентрации 1 мкМ). Перевязывать отожженных олигонуклеотиды в pX330 с помощью Золотые ворота сборочного клонирования стратегии 26. Подготовка 50 мкл реакционной смеси: 100 нг круговой pX330 вектор, 1,0 мкл отожженных олиго (1 мкМ; см шаг 3.1.4), 5,0 мкл фермента рестрикции буфера (10x), 4,0 мкл (20 ед) BbsI рестрикции (5000 U / мл), 5,0 μл АТФ (10 мМ), 0,25 мкл (5 мкг) БСА (20 мг / мл), 0,375 мкл (750 U), ДНК-лигазы Т4 (2000000 ед / мл) и H 2 O до конечного объема 50 мкл. Эта реакция может быть уменьшено до меньшего конечного объема, если это необходимо. Запуск образцы в амплификаторе, используя следующие параметры: циклы 1-20 (37 ° С в течение 5 мин, 20 ° С в течение 5 мин); Цикл 21 (80 ° С в течение 20 мин). Эти условия велосипедные позволяют расщепления и лигирования происходит в одной реакции (см шаг 3,2). Преобразование 10 мкл DH5 & E. палочки клетки с 1 мкл реакции (от 3.2.1 – 3.2.2). Пластина на лизогении бульон (LB) с агаром 100 мкг / мл ампициллина и инкубировали O / N при 37 ° С. Выберите 2 – 3 колонии и привить в мини-Prep культуры. Выполнение мини-преп для каждого образца и последовательность каждой колонии с использованием U6 промотора прямого праймера: CGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGC. Это арepresentative последовательности праймера; другие фланкирующие праймеры могут быть использованы. Выберите колонию последовательности, подтвержденные и привить в макси-подготовительные культуры. Размер Prep может быть расширена на основе требуемой выходом ДНК. Выполните макси-приготовительные для каждого CRISPR / Cas9 конструкции. 4. трансфицирующих CRISPRs в интересующих клеток ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол включает в себя доставку CRISPR / Cas9 плазмид электропорации 27. Этот протокол описан подробно для мышиного эритролейкемии (MEL) клеток, суспензии клеточной линии. Культуральную среду на всех этапах состоит из DMEM, дополненной 2% пенициллина / стрептомицина и 1% L-глутамина, который используется для MEL клетках. Тем не менее, переходные трансфекции CRISPR / Cas9 плазмид может быть успешно приспособлены к многочисленным типам клеток с использованием предпочтительных условий культивирования и стратегий трансфекции для каждого типа клеток. В то время как MEL клетки подвеска клетки, инструкции по прилипшие клетки чпр также были включены. Убедитесь, 2 х 10 6 клеток на CRISPR пары. Ресуспендируют 2 × 10 6 клеток в 100 мкл электропорации раствора и добавить к электропорации кюветы. Добавить 5 мкг каждого CRISPR / Cas9 конструкции (10 мкг общего). Добавить 0,5 мкг GFP выражения конструкции. Электропорации клетки с 250 вольт на 5 мс в 2 мм кювете с использованием системы электропорации. Примечание: Можно также использовать другой способ трансфекции, такие как катионной липосомы на основе трансфекции. Оптимизация условий трансфекции для каждой клеточной линии с корреспондентом конструкции, чтобы обеспечить надежную доставку плазмиды, прежде чем пытаться редактирование генома. Сразу передачи раствор из кюветы в 1 мл культуральной среды после электропорации. Сведите к минимуму время между электропорации и передачи решения в средствах массовой информации для повышения жизнеспособности клеток. Инкубировать при 30 – 37 ° С в течение 24 – 72 ч. 30 ° С, может повысить геномредактирования эффективность, но 37 ° С является приемлемым. 5. флуоресценции Активированный сотовый Сортировка (FACS) трансфицированных клеток Подготовка клеток для FACS путем фильтрации их через 50 мкм фильтр в FACS трубы. FACS сортировки TOP ~ 3% от GFP-позитивных клеток с целью обогащения для клеток, которые получили высокие уровни CRISPR / Cas9 строит. Пластинчатые отсортированных клеток по отдельности в 96-луночных круглодонных планшетах с использованием нижней сортировщик или с помощью лимитирующего разведения в 30 клеток на 96-луночный круглым дном пластины. Оптимизация покрытие тип клеток, используемый в лимитирующего разведения перед выполнением этого шага, чтобы гарантированно получить около 30 клеток на 96-луночный планшет. Включить 100 мкл на лунку в среде для культивирования клеток. Для остальных отсортированных клеток ("сыпучих"), которые не высевали, заморозить половина клеток для будущего покрытия. Пластина другую половину для скрининга и грунтовки проверки (см шаг 6). ПРИМЕЧАНИЕ: Этот рrotocol для суспензии клеток. Адгезивные клетки могут расти либо в виде отдельных клеток в 96-луночных плоскодонных пластины или в 10-см чашку при низкой концентрации, так что отдельные одноклеточные клоны могут быть собраны и перемещены в плоской нижней 96-луночного планшета. Разрешить объемные клетки инкубировали при 37 ° С в течение 3 – 7 дней, и позволяют клоны инкубировали при 37 ° С в течение 7 – 14 дней. Вары эти времена в зависимости от времени удвоения клеточной линии, используемой. ПРИМЕЧАНИЕ: Это время инкубации позволяет в течение достаточного клеточной пролиферации для скрининга геномной ДНК (GDNA) для предполагаемого удаления с помощью ПЦР (см шаги 6,1 и 7,1). Объемные элементы имеют достаточно широкое распространение, когда концентрация превышает ~ 100000 клеток / мл или для адгезивных клеток, клетки достигли ~ 80% слияния. Клоны были достаточно широкое распространение, как только макроскопически видимой с диаметром ~ 2 мм. 6. Грунтовка Проверка и отбор CRISPR / Cas9-опосредованной Удаление Изолировать GDNA родительских и сыпучих отсортированных клеток ресуспендированием родительских и сыпучих ячейки гранул в 50 мкл выделения ДНК раствора. Примечание: Вообще ~ 100000 клетки используются для выделения ДНК, хотя широкий диапазон количества клеток является приемлемым. Объемные отсортированы клетки состоит из поликлональных населения, подверженного воздействию sgRNA-А и sgRNA-B (см шаг 5). Целью следующей ПЦР праймеров для проверки и проверки на наличие предполагаемой геномной делецией. Запуск образца в амплификаторе и запустить следующую программу: 65 ° С в течение 6 мин, 98 ° С в течение 2 мин, чтобы извлечь GDNA. Измерьте концентрацию ДНК. Примечание: В то время как шаги 6,1 и 6,2 рекомендуем эффективный способ для выделения ДНК, любой способ для выделения геномной ДНК может быть использована, чтобы иметь возможность выполнять ПЦР на этапе 6.3. Соберите 20 мкл ПЦР в со следующими компонентами: 10 мкл 2x ПЦР смеси, 0,5 мкл прямого праймера (10 _6, M), 0,5 мкл Обратный праймер (10 мкм), 50-100 нг GDNA и H 2 O до 20 мкл. Используйте праймеров, сконструированных на шаге 2 выше. Проведение ПЦР для "не-удаления группы" и "удаления группы" в отдельных реакциях. Примечание: Многочисленные полимеразы может быть использовано для стадии 6.3. Запуск образцы в амплификаторе с использованием следующих параметров: 95 ° C в течение 15 мин, 35 циклов (95 ° С в течение 30 сек, 60 ° C в течение 1 мин, 72 ° С в течение 1 мин), и 72 ° C в течение 10 мин , Оптимизация условий ПЦР для каждого праймера пары разработан на основе тестирования Уложенные навалом клетки. Запуск образцов на 2% агарозном геле при 10 В / см с использованием 1x Трис-ацетат-ЭДТА (ТАЕ) буфер. Проверьте образцы на наличие / отсутствие не-удаление и удаление полос (рисунок 2). Рассмотрим мультиплексирования "удаление" и "не-удаление" ПЦР пары праймеров в одной реакции. Оптимизация мультиплексированиев поликлональных населения (то есть, основная сортируются клетки) до проверки индивидуальных клонов. Очень важно, что исключение и не удаление ампликоны быть легко решена на агарозном геле для мультиплексирования. 7. Скрининг CRISPR / Cas9 Клоны выпадений и Clone Selection Для суспензии клеток, передать все клоны с одной 96-луночный планшет, который уже содержит 50 мкл среды для культивирования клеток на лунку в конечном объеме 150 мкл. Это облегчает скрининг, позволяя многоканальной пипетки будет использоваться для оставшейся части действия, описанные в шаге 7. Передача 50 мкл из каждой лунки (оставляя 100 мкл в каждой лунке) на 96-луночный планшет ПЦР с использованием многоканальной пипетки. Центрифуга ПЦР пластины при 400 мкг в течение 5 мин и удалить супернатант, щелкая пластину ПЦР над раковиной. Добавить 50 мкл ДНК экстракционного раствора на лунку и ресуспендируют. Перейдите к шагу 7.3 для суспензии клеток. </LI> Для прилипшие клетки, аспирация средств массовой информации. Добавить 20 мкл 0,05% трипсина-ЭДТА в каждую лунку с клона настоящее время. Ресуспендируют клеток в 200 мкл среды. Внесите смешивать, чтобы отделить клетки. Пластина 100 мкл каждого из двух отдельных 96-луночных плоскодонных планшетах. Храните одну пластину, чтобы обеспечить клоны расти и использовать другие пластины на экран каждого клона для удаления. Добавить дополнительные 100 мкл в каждую лунку при общем объеме 200 мкл. Подождите 24 – 72 часа, чтобы дать клеткам расти. Вытяжку массовой информации. Добавить 50 мкл экстракции ДНК решение на лунку, ресуспендируют и трансфер в 96-луночного ПЦР планшета. Перейдите к шагу 7.3. Извлеките GDNA от клонов. Запуск образца в амплификаторе: 65 ° С в течение 6 мин и 98 ° С в течение 2 мин, чтобы извлечь GDNA. Экран каждого клона с помощью же праймеры для ПЦР и условия реакции, оптимизированные на объемных элементов (см шаг 6). Выберите IDEN клоновтифицированы с желаемым удалением и перейти к большей пластины или колбы роста. 8. Проверка биаллельных удаление клонов Для того чтобы охарактеризовать полученные клоны и проверки успешного нокаутом, оценки клонов на ДНК, а также РНК и / или белковых уровней. Для оценки ДНК, усиливать удаления, группы из биаллельных делеции клонов с корректура полимеразы и клонировать ампликоны (например, с помощью набора для клонирования ПЦР) в вектор плазмиды. Преобразование плазмиды в DH5 & E. палочки клетки и пластину на LB чашках с агаром с соответствующей антибиотиков. Выберите несколько колоний, мини-приготовительные каждого из них, и не подвергайте каждый клон Sanger секвенирования охарактеризовать каждого удаления аллель 28 – 30. Повторяя тест ПЦР для удаления после первоначального экрана гарантирует, что правильный клон был выбран, и воспроизводимость результатов. Для оценки РНК, выполните RT-КПЦР для Genе выражение соответствующего гена 30,31. Чтобы оценить белок, выполнить иммуноблот использованием антитела против соответствующего белка 33.

Representative Results

Цель этого эксперимента была удаление PIM1 в MEL клетках. Использование нескольких пар неперекрывающихся sgRNA (т.е. независимые последовательности protospacer) может помочь контролировать для офф-целевых эффектов (1А). Соответствует фенотип будет, скорее всего, возникают из-за воздействия на-мишени, в отличие от общего вне целевой эффекта разделяют несколько независимых последовательностей protospacer. Каждая пара приведет к производству уникального удаления точки останова. Если близко друг к другу (т.е. меньше, чем п ~ 150 п.н.), одни и те же праймеры скрининга может быть использован для обнаружения делеции, полученные каждым набором sgRNAs. Геномные делеции генов могут нарушить с помощью sgRNA пар в различных местах по отношению к гену (Фиг.1В). Например, пара sgRNA может фланкируют ген для удаления всего тела гена; пара может быть расположен в пределах двух экзонов, с потенциалом для создания рамки считывания вставкам, даже если один или оба аллеляES не были удалены; или пара может фланкируют конкретную экзон, чтобы нарушение конкретной изоформы. Стратегия удаление используется для PIM1 заключается в разработке фланговые sgRNAs удалить весь организм гена, 8 пар нуклеотидов (рисунок 2). Эта стратегия была выбрана отчасти из-за относительно небольшого размера гена PIM1. Этот пример показывает один PAM (зеленое) на верхней части (Watson) нити и один PAM на дне (Крик) нити; Однако, DSB не зависит от последовательности PAM локализации в верхней или нижней нити. sgRNA пары могут иметь как PAM последовательности на верхней нити, как на нижней ветви, или один из каждого. Использование протокола, описанного выше, два sgRNA были разработаны, клонировали в вектор экспрессии pX330, и доставлен в MEL клетки путем электропорации вместе с GFP-репортера (фиг.2А). Топ 3% GFP + клеток были отсортированы два дня пост-электропорации и высевали клонированных на ограничение разведения. ЭкранIng праймеры были сконструированы, как описано в стадии 2, и, как показано на фиг.2. Условия ПЦР были оптимизированы с помощью GDNA, выделенные из родительских клеток MEL и от "массовых" отсортированных клеток. 10 дней после посева, гДНК был изолирован от всех клонов и подвергали скринингу для удаления методом ПЦР, в котором определены не-удаление, моноаллельной и биаллельных удаления, клоны в соответствии с моделями, не-удаления (ND) и удаления (D) Ампликоны (Рисунок 3) , Номера удаление клонов были идентифицированы как имеющие присутствие без удаления ампликона и отсутствие делеции ампликона. Моноаллельной клоны были определены как имеющие присутствие как не-удаление и удаление ампликонов. Биаллельных клоны были определены как имеющие отсутствие не-удаления ампликоне и наличие делеции ампликоне. Для этого удаления, 400 клонов подвергали скринингу на котором были определены 126 моноаллельной удаления, клонов и 32 диаллельных Delet ионные клоны (важно отметить, что частота удаление зависит от размера делеции 12). Биаллельных удаления клоны были отобраны и переехал в колбы с 8 мл средства массовой информации. После того 5 дней для расширения, каждый клон повторно с помощью ПЦР из гДНК, чтобы подтвердить биаллельных удаления и удаления ампликоны подвергались Sanger секвенирования точно определить удаление (рис 2б). Неоднородность в делеции ампликонов отражает несовершенство INDEL формирования NHEJ ремонт. Секвенирование без удаления аллеля в monoallelelic делеции клонов, обнаруженных вставкам в большинстве случаев, демонстрируя, что даже не удаленный аллель, часто редактировалось CRISPR / Cas9, что может быть важно для приложений, где требуется как моноаллельной и биаллельных удаления клоны , РНК выделяли из биаллельных делеции клонов и анализировали с помощью RT-КПЦР для подтверждения потеря экспрессии PIM1 (рисунок 4). способы "> Рисунок 1. Схема возможных стратегий удаления. () Два примера sgRNA пары для геномных делеций (показано в черно-оранжевый, соответственно). Синие стрелки показывают праймеры для обнаружения не-удаления ампликон и красные стрелки указывают праймеров для обнаружения удаления ампликон. sgRNA позиции 17 и 18 выделены красным и синим цветом на sgRNA-сайтов-1/2 и выделяется в фиолетовый и оранжевый на sgRNA-сайтов-B 1 / B 2 с красной линией, указывающей предсказал Cas9 расщепление между позициями 17 и 18. (B) CRISPR-направленный расколы показаны в виде вертикальных черных линий. Синие стрелки показывают праймеры для обнаружения не-удаления ампликон и красные стрелки указывают праймеров для обнаружения удаления ампликон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотретьБолее крупная версия этой фигуры. Рисунок 2. Стратегия для создания и обнаружения удаление PIM1, в том числе секвенирования удаления и без делеции аллелей. () Схема стратегии скрининга ПЦР-идентифицировать PIM1 удаления, клоны. Один праймер пары расположен на внутренней делеции (синие стрелки) и один пары праймеров локализован внешними по отношению к делеции (красные стрелки). sgRNA последовательности (protospacer последовательности) приведены в фиолетовый. Вертикальные красные линии обозначают прогнозируемую Cas9 расщепление между позициями 17 и 18 последовательности sgRNA. (B) Sanger секвенирования показывает образование INDEL на сайт узнавания sgRNA. последовательности sgRNA показаны в порфиру и PAM последовательностей в зеленый цвет. Делеционные события SHсамостоятельно, эквивалентное число тире марок и вставок выделены синим цветом. Вертикальные красные линии обозначают предсказал сайт расщепления, между позициями 17 и 18 sgRNA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 3. Представитель гель выявления нон-удаление, моноаллельной и биаллельных клонов. Для каждого клона, левая полоса представляет собой не-удаления ампликон ("ND" в синий цвет) и правой полосе представляет удаления ампликон ("D" в красном ). Индивидуальные клоны разделены пунктирными линиями. Три моноаллельной удаление клоны клонов 5, 6 и 2. Три биаллельных удаление клоны клонов 15, 17 и 13. Как видно из данных секвенировани, удаление группы для C одинокий 13 имеет меньший размер из-за больших удалений на удаление перехода. Рисунок 4. Потеря выражения PIM1 в биаллельных делеции клонов. Выражение PIM1 была рассчитана на два биаллельных делеции клонов RT-КПЦР. Данные были нормированы на GAPDH с использованием 2 – метод & Delta; CТ. Protospacer Последовательность sgRNA- 5'-TAGGAAAATGACTCGTCACT-3 ' sgRNA-B 5'-GTCTATCCTATCTCGATAAA-3 ' Таблица 1. 20-Мер protospacer последовательности для двух sgRNA для удаления PIM1. 543 "> Обратный Дополнение Protospacer последовательности sgRNA-RC- 5'-AGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 ' sgRNA-B-RC 5'-TTTATCGAGATAGGATAGAC-3 ' Таблица 2. обратной комплементарной из protospacer последовательностей для двух sgRNA из таблицы 1. Последовательности sgRNA- 5'-CACCTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 ' sgRNA-RC- 5'-AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTA-3 ' sgRNA-B 5'-CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 ' sgRNA-B-RC 5'-AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 ' Таблица 3. Protospacer последовательности и их обратная дополняет с "CACC" и "AAAC" добавлен для клонирования в вектор pX330 с использованием BbsI фермента рестрикции. Последовательности sgRNA- 5'CACCGTAGGAAAATGACTCGTCACT-3 " sgRNA-RC- 5'AAACAGTGACGAGTCATTTTCCTAC-3 " sgRNA-B 5'CACCGTCTATCCTATCTCGATAAA-3 " sgRNA-B-RC 5'AAACTTTATCGAGATAGGATAGAC-3 " Таблица 4. Выражение sgRNA от U6 промотора вектора pX330 усиливается добавлением G нуклеотида после последовательности CACC и перед20-мерный. Добавление дополнительной G нуклеотида требуется добавление C нуклеотида на 3'-конце обратного комплемента олиго (например, sgRNA-A). Однако, если первая позиция 20-мерного (последовательности protospacer) уже G нуклеотид, нет необходимости, чтобы добавить еще один G (например, sgRNA-В) и нет необходимости добавлять С в конечное положение в обратной комплементарной олиго.

Discussion

CRISPR / Система Cas9 может быть использован для создания геномных делеций различных размеров. Хотя мы обнаружили, что частота удаления изменяется обратно пропорционально по отношению к предполагаемой размера удаления, мы смогли восстановить делеции до 1 Мб и удаления до 100 кб обычно можно дать несколько биаллельных удалены клонов. Мы не наблюдали никаких потерь в эффективности последовательно вводя делеций в клеточной линии. Эта стратегия может быть использована для создания комбинаторной удаления множества генов и элементов. Процесс получения биаллельных делеционных клонов можно ускорить путем оценки минимального числа клонов, необходимых для скрининга на основе размера делеции, чтобы получить нужное количество клонов с делецией ¹² диаллельных.

Возможность получения моноаллельную удаление с отсутствием биаллельной удаления в вероятностной распределения может указывать на мобильный летальность, связанную с полной потерей функции. Низкий FRequency или отсутствие делеции могут отражать ряд сценариев, включая плохое трансфекции, неэффективных sgRNAs или неэффективных ПЦР скрининга праймеров (из-за отсутствия положительного контроля для проверки праймеров для ПЦР для выявления удаление). GFP ⁺ клетки могут быть использованы в качестве суррогата эффективности трансфекции (см шаг 5,2), так что уменьшение GFP ⁺ клеток, вероятно, отражает плохую трансфекции и в результате снижению эффективности удаления. Использование двух различных пар sgRNA с независимыми скрининга праймеров может помочь контроль за неэффективного sgRNA и скрининга ПЦР праймеров и максимально шансы на получение биаллельных удаления, клоны. Сортировки клеток для GFP ⁺ клеток обогащает от удаления аллелей. Хотя этот шаг может быть пропущен, пропуск скорее всего потребует скрининга больше клонов с целью выявления лиц с моноаллельной или биаллельных удалений. В той степени, что эффективность трансфекции может быть оптимизирована, то можно ожидать эффективность редактирования генома быть повышена.

<p cдевушка = "jove_content"> События NHEJ которые лежат в основе удаления и локальный результат ремонта в серии аллелей с различными вставкам на цель сайтов. Преобладающий исход небольшие ~ 1 – 10 п.о. вставки или делеции чаще в месте sgRNA-направленного расщепления (фиг.2В). Часто эти аллели, кажется, результат microhomology на основе ремонтных ^34,35. Следует отметить, что стратегия обнаружения на основе ПЦР описаны не будут определены более крупные или более сложные инсерции, делеции, инверсии, или перестановки. Хотя эти события являются менее распространенными, мы наблюдали клоны, в которых могут быть обнаружены ни удаление, ни не-удаление ампликоны, и после дальнейшего исследования отражают эти более сложные результаты.

Мы наблюдали обширная CRISPR / Cas9-опосредованные "рубцов" не-делеции аллелей из моноаллельной и не на удаление клонов (рис 2б). Эти "шрамы" состоят изнебольшие инсерций, полученные в сайте расщепления sgRNA без предполагаемого удаления (т.е. удаление промежуточный сегмент между sgRNAs А и В). Эти шрамы часто прерывать признание поставленной цели в sgRNA. Поэтому мы хотели бы призвать осторожность в переориентации аллелей в клетках, ранее подвергшимися воздействию sgRNAs, используя те же sgRNAs. Более успешная стратегия переориентация будет использовать уникальный sgRNA последовательности отличие от ранее "травмированных" сайтами узнавания. В тех случаях, когда пара sgRNAs признает экзонных последовательности (Фигура 1В, внизу), сдвигом рамки аллели могут быть получены даже в отсутствие делеции. Таким образом, моноаллельной удаления клоны могут быть обогащены с потерей функции в связи с высокой частотой мутации сдвига рамки считывания на не удаленный аллель ^12.

Одна из проблем, с CRISPR / системы Cas9 мимо цели эффекты, т.е., геномная модификация в непредусмотренных местах ^{36 – 38.} RОтчеты ecent предположили, что короткие направляющие РНК с 17 – 19 нуклеотидов может уменьшить частоту CRISPR / Cas9 основе мимо цели эффекты ^39. Кроме того, стратегия дважды надрезани с помощью двух направляющих за целевом сайте с никазы может быть использован для создания DSBs при минимизации проходит мимо эффекты ^7. Кроме того, по аналогии с стратегий, используемых для РНК-интерференции, мы предполагаем, что различные пары sgRNAs с неперекрывающихся protospacer последовательностей можно использовать для демонстрации, что наблюдается фенотип результат на-мишени CRISPR / модификации Cas9 в отличие от потенциала мимо цели эффект. Удобным подходом было бы разработать по крайней мере, два смежных, но не перекрывающихся пар sgRNA так, чтобы один набор праймеров скрининга (см шаг 2) может быть использован для нескольких пар sgRNA (фиг.1А). Кроме того, дополняя удаление клеточной линии путем восстановления недостающего последовательность и / или нарушенного ген может обосновать причинно-следственную связь междуучитывая геномной удаление и фенотип.

Для биологов, работающих с сотовой модельных систем, RNAi представлял собой мощный инструмент для функциональной геномики. Тем не менее, ограничения этого подхода включали неполную снижение уровня транскриптов мРНК-мишени, неоднородность эффекта независимых реагентов, направленных на один и тот же ген, и известен у ворот эффекты, включая семенной основе и не семенных эффектов ^{40 – 42.} Стратегии редактирования Геном обещают решить многие из этих проблем и представляют собой захватывающее, дополнительный подход для перспективного генетической возмущения ^8,36,37. Кроме того, редактирование генома позволяет исследовать некодир генетические элементы таким образом, не представляется возможным по РНК-интерференции и сложной обычным адресности приближается к ^25. Мы призываем поколение геномных делеций по CRISPR / Cas9 в качестве надежной и конкретного метода для получения и характеристики с потерей функции аллелей.

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201S
T4 DNA Ligase (with associated ligation buffer)	New England Biolabs	M0202T
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	P0756S
BSA, Molecular Biology Grade	New England Biolabs	B9000S
BbsI Restriction Enzyme (with associated NEB Buffer 2.1)	New England Biolabs	R0539S
pSpCas9(BB) (pX330)	Addgene	42230
S.O.C. Medium	Life Technologies	15544-034
BTX ECM 830	Harvard Apparatus	45-0052
BTX Solution and 2mm Cuvettes	Harvard Apparatus	45-0803
pmaxGFP Plasmid	Lonza	VPA-1003
QuickExtract DNA Extraction Solution	Epicentre	QE09050
HotStarTaq PCR Master Mix Kit	Qiagen	203443
Zero Blunt PCR Cloning Kit	Life Technologies	K2700-20