CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.
The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.
Recent advances in genome engineering technology have allowed for unprecedented opportunities for site-specific modification of the genome. This technology may be utilized to investigate the function of genes and regulatory elements via prospective genetic perturbation. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription-activator like (TAL) effector nucleases (TALENs), and CRISPR/Cas9 RNA-guided nucleases each leverage customizable DNA specificity to localize a nuclease for the introduction of DSBs1–3. The resulting DSBs can be repaired by indel-forming NHEJ or by homology-directed repair (HDR) using a donor template4.
The CRISPR/Cas9 nuclease pathway, an adaptive immune system in prokaryotic cells5, has been recently adapted for mammalian genome engineering2,3. This tool has been demonstrated to be an inexpensive, efficient, and reliable genome engineering technique6. Briefly, a complex of Streptococcus pyogenes-derived Cas9 nuclease and a sgRNA achieve target recognition via Watson-Crick base-pairing with cognate genomic DNA sequences. sgRNAs include 20-mer sequences complementary to genomic sequences adjacent to an obligate protospacer adjacent motif (PAM) NGG. Cas9 induces a DSB at a predictable position within the target site. Additionally, variants of Cas9 with single-strand cleavage capacity or catalytic inactivity may be used to facilitate “nicking” or transcriptional regulation respectively7–9. CRISPR/Cas9 has been used for a wide range of applications including both knock-in and knockout10,11, large-scale genomic deletions12–14, pooled library screening for gene discovery15,16, genetic engineering of numerous model organisms10,11,17–21, as well as gene therapy22,23.
Here we describe a protocol for efficient deletion of desired genomic regions. The protocol includes CRISPR design, cloning, and delivery, as well as deletion, identification, and characterization. Genomic deletions can be generated by the introduction of two CRISPR sgRNAs with Cas9 to induce repair of the resultant two DSBs by NHEJ with deletion of the intervening segment. This strategy has been used to create deletions ranging from one kilobase to over one megabase12. Deletions can be informative for the study of genes and other genetic elements, either in isolation or in combination. There are several potential advantages of genomic deletions as compared to HDR or single-site small indel production. First, this method capitalizes on the high efficiency of NHEJ in many cellular contexts7. The high frequency of deletion limits the number of clones needed to be screened to identify informative clones. Deletion frequency is inversely related to deletion size. Biallelic deletion clones may be retrieved at frequencies at least as great as of probabilistic expectation12. Second, both monoallelic and biallelic deletions may be easily identified and distinguished by conventional PCR, simplifying the screening process. Strategies relying on small indels or point mutations may require RFLP, allele-specific PCR, T7EN1 cleavage assay, Sanger sequencing, RT-qPCR, or immunoblotting, which may be more laborious. Third, by removing a substantial portion of a gene or element of interest, a reliable loss-of-function allele may be obtained. In contrast, frameshift mutations in protein-coding sequences may not always induce nonsense-mediated decay, may produce a hypomorphic or neomorphic allele, or target an exon excluded from an alternate isoform24. Finally, deletions may be particularly revealing for the study of non-coding DNA such as regulatory elements since frameshift mutations as produced by single-site indels would not be relevant25.
Die CRISPR / Cas9 System kann verwendet werden, um genomische Deletionen von einer Vielzahl von Größen zu erzeugen. Obwohl wir beobachtet haben, dass die Frequenz des Löschens umgekehrt proportional bezüglich beabsichtigten Deletion Größe, haben wir in der Lage, Deletionen von bis zu 1 Mb und Deletionen von bis zu 100 kb zu gewinnen routine Ausbeute mehreren biallelischen gelöscht Klone. Wir haben keinen Verlust in der Effizienz des sequentiellen Einführen Deletionen in eine Zelllinie beobachtet. Diese Strategie kann für die Erstellung von kombi Deletion zahlreicher Gene und Elemente verwendet werden. Das Verfahren zur Erlangung biallelischen Deletionsklone kann durch Schätzen der minimalen Anzahl von Klonen benötigt, um basierend auf Deletion eine Größe, um die gewünschte Anzahl von Klonen mit biallelischen Deletion 12 erhalten gescreent werden beschleunigt werden.
Die Fähigkeit, monoallelic Deletion mit der Abwesenheit von biallelischen Deletion an Wahrscheinlichkeitsverteilung zu erhalten könnte anzeigen Zell Letalität mit kompletten Funktionsverlust verbunden. Low frequency oder nicht vorhanden Löschungen könnte eine Reihe von Szenarien, einschließlich schlechte Transfektion ineffizient sgRNAs oder ineffiziente PCR-Screening-Primer (aufgrund des Fehlens von einer positiven Kontrolle, um PCR-Primer zu validieren, um zum Löschen-Bildschirm) zu reflektieren. GFP + -Zellen können als Ersatz für die Transfektionseffizienz (siehe Schritt 5.2), so dass eine Verringerung der GFP + -Zellen spiegelt wahrscheinlich schlecht Transfektion und einem daraus resultierenden verringerten Effizienz Löschung. Mit zwei verschiedenen sgRNA Paare mit unabhängigen Screening-Primer können Steuerung für ineffiziente sgRNA helfen und Screening-PCR-Primer und maximieren Chancen auf biallelischen Deletionsklonen. Zellsortierung für GFP + -Zellen bereichert zum Löschen Allele. Während dieser Schritt weggelassen werden kann, wird wahrscheinlich erforderlich machen Weglassen Screening weitere Klone zu denen mit monoallelic oder biallelischer Deletionen identifizieren. In dem Maße, Transfektionseffizienz optimiert werden kann, würden wir erwarten, Genom Bearbeitungseffizienz verbessert werden.
<p class = "jove_content"> Die NHEJ Ereignisse, Löschungen und lokale Reparatur Ergebnis zugrunde liegen, in einer Reihe von Allelen mit einer Vielzahl von indels an den Zielorten. Die vorherrschende Ergebnis klein ~ 1 – 10 bp Insertionen oder häufiger Deletionen an der Stelle der sgRNA gerichtete Spaltung (2B). Oft werden diese Allele scheinen das Ergebnis von microhomology basierten Reparatur 34,35 sein. Es sollte beachtet werden, dass die PCR-basierten Nachweis Strategie, die wir beschreiben werden nicht größer und komplizierter Insertionen, Deletionen, Inversionen oder Umlagerungen identifizieren. Obwohl diese Ereignisse sind weniger verbreitet, haben wir Klone, bei denen weder das Löschen noch nicht gelöscht Amplikons nachgewiesen werden konnte beobachtet werden, und bei einer weiteren Untersuchung auch auf diese komplexeren Ergebnissen widerspiegeln.Wir haben beobachtet, umfangreiche CRISPR / Cas9 vermittelte "Narben" nicht Deletionsallelen aus monoallelic und nicht-Deletionsklone (siehe 2B). Diese "Narben" auskleine indels am sgRNA Spaltstelle ohne den beabsichtigten Deletion erzeugt (dh Deletion der intervenierenden Segment zwischen sgRNAs A und B). Diese Narben oft unterbrechen, Zielerfassung durch die sgRNA. Deshalb möchten wir Vorsicht bei Retargeting-Allele in Zellen, die zuvor auf sgRNAs mit den gleichen sgRNAs ausgesetzt zu drängen. Ein erfolgreicher Re-Targeting Strategie wäre einzigartig sgRNA nutzen Sequenzen unterscheidet sich von zuvor "Narben" Erkennungsstellen. In Fällen, wenn ein Paar von sgRNAs erkennt Exon-Sequenzen (1B, unten), kann Aster Allelen selbst bei Abwesenheit des Löschens erzeugt werden. Daher kann monoallelic Deletionsklone zum Verlust der Funktion aufgrund der hohen Frequenz von Frameshift-Mutationen auf dem Allel 12 nicht gelöschten angereichert werden.
Ein Problem bei der CRISPR / Cas9 System Off-Target-Effekte, also Genomveränderung bei unbeabsichtigter Websites 36-38. Reuere Berichte haben vorgeschlagen, dass kürzere Führung RNAs mit 17-19 Nukleotiden können die Häufigkeit der CRISPR reduzieren / Cas9-basierte Nebeneffekte 39. Zusätzlich kann eine Doppelstrangbruchstrategie mit zwei Führungen pro Zielort mit einem Nickase verwendet werden, um DSBs erstellen und minimiert Nebeneffekte 7. Alternativ analog zu Strategien für RNAi verwendet, empfehlen wir, dass verschiedene Paare von sgRNAs mit nicht überlappenden protospacer Sequenzen verwendet, um zu zeigen, dass der beobachtete Phänotyp ist das Ergebnis der Vor-Ziel CRISPR / Cas9 Änderung im Gegensatz zu einem potenziellen Off-Target werden Wirkung. Eine praktische Vorgehensweise würde sein, wenigstens zwei benachbarte, aber nicht überlappende sgRNA Paare zu entwerfen, so dass ein einzelner Satz von Screening-Primer (siehe Schritt 2) können für mehrere sgRNA Paaren (1A) verwendet werden. Darüber hinaus ergänzt eine Deletion Zelllinie durch Wiedereinführung der fehlende Sequenz und / oder gestört Gen kann einen kausalen Zusammenhang zwischen untermauerneine bestimmte genomische Deletion und Phänotyp.
Für Biologen arbeiten mit zellulären Modellsystemen hat RNAi ein leistungsfähiges Werkzeug für die funktionale Genomforschung vertreten. 42 – haben jedoch Grenzen dieses Ansatzes unvollständige Reduktion der Ziel-mRNA-Transkript-Gehalte, Heterogenität der Effekt der unabhängigen Reagenzien zur Förderung der gleichen Gen, und bekannte Nebeneffekte einschließlich Saatgut-basierte und nicht-Sameneffekte 40 enthalten. Genome Bearbeitungsstrategien versprechen, viele dieser Probleme anzugehen und stellen eine spannende, komplementären Ansatz für zukünftige genetische Störung 8,36,37. Weiterhin ermöglicht die Untersuchung von nicht-codierenden genetischen Elementen in einer Weise durch RNAi nicht möglich und herausfordernde durch herkömmliche Targeting nähert 25 Genom Bearbeitung. Wir ermutigen Generation von genomischen Deletionen von CRISPR / Cas9 als robuste und spezifische Methode zur Herstellung und Charakterisierung loss-of-function-Allele.
The authors have nothing to disclose.
Thanks to Jason Wright for suggesting the Golden Gate Assembly cloning strategy and Katherine Helming and members of Orkin lab, particularly Jian Xu, Guoji Guo, Elenoe Smith, and Partha Das for helpful discussions. This work was supported by NIH R01HL032259 and P30DK049216 (Center of Excellence in Molecular Hematology) to S.H.O. and NIDDK K08DK093705 to D.E.B.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
T4 DNA Ligase (with associated ligation buffer) | New England Biolabs | M0202T | |
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
BSA, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | B9000S | |
BbsI Restriction Enzyme (with associated NEB Buffer 2.1) | New England Biolabs | R0539S | |
pSpCas9(BB) (pX330) | Addgene | 42230 | |
S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
BTX ECM 830 | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
BTX Solution and 2mm Cuvettes | Harvard Apparatus | 45-0803 | |
pmaxGFP Plasmid | Lonza | VPA-1003 | |
QuickExtract DNA Extraction Solution | Epicentre | QE09050 | |
HotStarTaq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 203443 | |
Zero Blunt PCR Cloning Kit | Life Technologies | K2700-20 |