CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.
The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.
Recent advances in genome engineering technology have allowed for unprecedented opportunities for site-specific modification of the genome. This technology may be utilized to investigate the function of genes and regulatory elements via prospective genetic perturbation. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription-activator like (TAL) effector nucleases (TALENs), and CRISPR/Cas9 RNA-guided nucleases each leverage customizable DNA specificity to localize a nuclease for the introduction of DSBs1–3. The resulting DSBs can be repaired by indel-forming NHEJ or by homology-directed repair (HDR) using a donor template4.
The CRISPR/Cas9 nuclease pathway, an adaptive immune system in prokaryotic cells5, has been recently adapted for mammalian genome engineering2,3. This tool has been demonstrated to be an inexpensive, efficient, and reliable genome engineering technique6. Briefly, a complex of Streptococcus pyogenes-derived Cas9 nuclease and a sgRNA achieve target recognition via Watson-Crick base-pairing with cognate genomic DNA sequences. sgRNAs include 20-mer sequences complementary to genomic sequences adjacent to an obligate protospacer adjacent motif (PAM) NGG. Cas9 induces a DSB at a predictable position within the target site. Additionally, variants of Cas9 with single-strand cleavage capacity or catalytic inactivity may be used to facilitate “nicking” or transcriptional regulation respectively7–9. CRISPR/Cas9 has been used for a wide range of applications including both knock-in and knockout10,11, large-scale genomic deletions12–14, pooled library screening for gene discovery15,16, genetic engineering of numerous model organisms10,11,17–21, as well as gene therapy22,23.
Here we describe a protocol for efficient deletion of desired genomic regions. The protocol includes CRISPR design, cloning, and delivery, as well as deletion, identification, and characterization. Genomic deletions can be generated by the introduction of two CRISPR sgRNAs with Cas9 to induce repair of the resultant two DSBs by NHEJ with deletion of the intervening segment. This strategy has been used to create deletions ranging from one kilobase to over one megabase12. Deletions can be informative for the study of genes and other genetic elements, either in isolation or in combination. There are several potential advantages of genomic deletions as compared to HDR or single-site small indel production. First, this method capitalizes on the high efficiency of NHEJ in many cellular contexts7. The high frequency of deletion limits the number of clones needed to be screened to identify informative clones. Deletion frequency is inversely related to deletion size. Biallelic deletion clones may be retrieved at frequencies at least as great as of probabilistic expectation12. Second, both monoallelic and biallelic deletions may be easily identified and distinguished by conventional PCR, simplifying the screening process. Strategies relying on small indels or point mutations may require RFLP, allele-specific PCR, T7EN1 cleavage assay, Sanger sequencing, RT-qPCR, or immunoblotting, which may be more laborious. Third, by removing a substantial portion of a gene or element of interest, a reliable loss-of-function allele may be obtained. In contrast, frameshift mutations in protein-coding sequences may not always induce nonsense-mediated decay, may produce a hypomorphic or neomorphic allele, or target an exon excluded from an alternate isoform24. Finally, deletions may be particularly revealing for the study of non-coding DNA such as regulatory elements since frameshift mutations as produced by single-site indels would not be relevant25.
Le système de CRISPR / Cas9 peut être utilisé pour générer des deletions génomiques d'une gamme de tailles. Bien que nous avons observé que la fréquence de suppression varie inversement par rapport à la taille de la suppression prévue, nous avons été en mesure de récupérer les suppressions de jusqu'à 1 Mb et suppressions jusqu'à 100 kb donné régulièrement plusieurs bialléliques supprimé clones. Nous avons observé aucune perte d'efficacité de l'introduction de deletions séquentiellement dans une lignée cellulaire. Cette stratégie peut être utilisée pour la création de suppression combinatoire de nombreux gènes et des éléments. Le processus d'obtention de clones de deletion bialléliques peut être accéléré en estimant le nombre minimum de clones devaient être examiné sur la base de la taille de la deletion d'obtenir le nombre souhaité de clones de deletion 12 biallélique.
La capacité d'obtenir la suppression monoallélique à l'absence de suppression lors de la distribution probabiliste biallélique peut indiquer la létalité cellulaire associé à la perte complète de la fonction. Faible frequency ou suppressions absents pourraient refléter un certain nombre de scénarios y compris la mauvaise transfection, sgRNAs inefficaces ou inefficaces amorces PCR de dépistage (en raison du manque d'un contrôle positif pour valider amorces de PCR pour le dépistage de suppression). cellules GFP + peuvent être utilisés comme un substitut pour une efficacité de transfection (voir l'étape 5.2), donc une réduction des cellules GFP + reflète probablement mauvaise transfection et A résultant diminué l'efficacité de suppression. L'utilisation de deux paires différentes de ARNsg avec des amorces de dépistage indépendants peuvent aider à contrôler ARNsg inefficace et dépistage des amorces de PCR et de maximiser les chances d'obtenir des clones de deletion bialléliques. Tri cellulaire pour cellules GFP + enrichit pour les allèles de suppression. Bien que cette étape peut être omise, omission faudra vraisemblablement plusieurs clones de dépistage pour identifier celles présentant des délétions ou monoalléliques bialléliques. Dans la mesure où l'efficacité de transfection peut être optimisée, nous nous attendrions édition du génome des gains d'efficacité.
<p class = "jove_content"> Les événements NHEJ qui sous-tendent des deletions et des résultats de réparation locale d'une série d'allèles avec une variété d'indels au niveau des sites cibles. Le résultat est prédominant petits ~ 1-10 pb insertions ou deletions plus communément au niveau du site de clivage ARN sg dirigée (figure 2B). Souvent, ces allèles semblent être le résultat de base microhomology réparation 34,35. Il convient de noter que la stratégie de détection basée sur la PCR, nous décrivons ne identifiera pas plus grandes insertions ou deletions, plus complexes, des inversions, ou des réarrangements. Bien que ces événements sont moins fréquents, nous avons observé clones dans laquelle ni suppression, ni amplicons non-suppression pourraient être détectés, et après enquête, tenir compte de ces résultats plus complexes.Nous avons observé une vaste CRISPR / Cas9-médiation "cicatrices" des allèles non-suppression de monoalléliques et non-suppression clones (voir la figure 2B). Ces «cicatrices» sont constitués deindels petites produites au niveau du site de clivage ARN sg sans la suppression prévue (ce est à dire, la suppression du segment intermédiaire entre sgRNAs A et B). Ces cicatrices interrompent souvent reconnaissance de la cible par le ARNsg. Par conséquent, nous inciter à la prudence dans reciblage allèles dans les cellules préalablement exposés à sgRNAs utilisant les mêmes sgRNAs. Une stratégie de reciblage plus de succès utiliserait ARNsg unique de séquences distinctes de sites de reconnaissance "cicatrices" précédemment. Dans les cas où une paire de sgRNAs reconnaît des séquences exoniques (figure 1B, en bas), les allèles du cadre de lecture peut être produit même en l'absence de suppression. Par conséquent, clones de deletion monoalléliques peuvent être enrichis pour la perte de fonction en raison de la fréquence élevée de mutations de déphasage sur le non-supprimé allèle 12.
Une préoccupation avec le système de CRISPR / Cas9 est hors-cible, à savoir les effets, la modification génomique sur les sites involontaires 36-38. Res dernières rapports ont suggéré que plus courts ARN guides avec 17 à 19 nucléotides peuvent réduire la fréquence des CRISPR / Cas9-fondé des effets hors-cible 39. En outre, une stratégie à double entaillage aide de deux guides par site cible avec un nickase peut être utilisé pour créer CDB tout en minimisant les effets hors-cible 7. Alternativement, analogue à des stratégies utilisées pour ARNi, nous suggérons que les différentes paires de sgRNAs avec non-chevauchement des séquences de protospacer être utilisés pour démontrer que le phénotype observé est le résultat de la CRISPR / modification Cas9 sur cible par opposition à un potentiel hors cible effet. Une solution pratique serait de concevoir au moins deux paires de ARNsg adjacentes mais non-chevauchement de sorte qu'un seul ensemble d'amorces de dépistage (voir étape 2) peut être utilisé pour plusieurs paires de ARNsg (figure 1A). Par ailleurs, en complément d'une lignée cellulaire de suppression en réintroduisant la séquence manquante et / ou gène interrompu peut justifier d'un lien de causalité entreune délétion génomique et le phénotype donné.
Pour les biologistes qui travaillent avec des systèmes modèles cellulaire, l'ARNi a représenté un outil puissant pour la génomique fonctionnelle. Cependant, les limites de cette approche ont inclus une réduction incomplète des niveaux de transcrits d'ARNm cible, l'hétérogénéité de l'effet des réactifs indépendants ciblant le même gène, et connus des effets hors-cible y compris les effets axées sur les semences et les semences non-40-42. stratégies d'édition du génome promettent de répondre à bon nombre de ces préoccupations et représentent une approche passionnante, complémentaire de perturbation génétique prospective 8,36,37. En outre, l'édition du génome permet pour l'étude des éléments non codants génétiques d'une manière pas possible par ARNi et stimulant par un ciblage approches conventionnelles 25. Nous encourageons génération de suppressions génomiques par CRISPR / Cas9 comme une méthode robuste et spécifique pour produire et caractériser les allèles de perte de fonction.
The authors have nothing to disclose.
Thanks to Jason Wright for suggesting the Golden Gate Assembly cloning strategy and Katherine Helming and members of Orkin lab, particularly Jian Xu, Guoji Guo, Elenoe Smith, and Partha Das for helpful discussions. This work was supported by NIH R01HL032259 and P30DK049216 (Center of Excellence in Molecular Hematology) to S.H.O. and NIDDK K08DK093705 to D.E.B.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
T4 DNA Ligase (with associated ligation buffer) | New England Biolabs | M0202T | |
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
BSA, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | B9000S | |
BbsI Restriction Enzyme (with associated NEB Buffer 2.1) | New England Biolabs | R0539S | |
pSpCas9(BB) (pX330) | Addgene | 42230 | |
S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
BTX ECM 830 | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
BTX Solution and 2mm Cuvettes | Harvard Apparatus | 45-0803 | |
pmaxGFP Plasmid | Lonza | VPA-1003 | |
QuickExtract DNA Extraction Solution | Epicentre | QE09050 | |
HotStarTaq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 203443 | |
Zero Blunt PCR Cloning Kit | Life Technologies | K2700-20 |