CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.
The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.
Recent advances in genome engineering technology have allowed for unprecedented opportunities for site-specific modification of the genome. This technology may be utilized to investigate the function of genes and regulatory elements via prospective genetic perturbation. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription-activator like (TAL) effector nucleases (TALENs), and CRISPR/Cas9 RNA-guided nucleases each leverage customizable DNA specificity to localize a nuclease for the introduction of DSBs1–3. The resulting DSBs can be repaired by indel-forming NHEJ or by homology-directed repair (HDR) using a donor template4.
The CRISPR/Cas9 nuclease pathway, an adaptive immune system in prokaryotic cells5, has been recently adapted for mammalian genome engineering2,3. This tool has been demonstrated to be an inexpensive, efficient, and reliable genome engineering technique6. Briefly, a complex of Streptococcus pyogenes-derived Cas9 nuclease and a sgRNA achieve target recognition via Watson-Crick base-pairing with cognate genomic DNA sequences. sgRNAs include 20-mer sequences complementary to genomic sequences adjacent to an obligate protospacer adjacent motif (PAM) NGG. Cas9 induces a DSB at a predictable position within the target site. Additionally, variants of Cas9 with single-strand cleavage capacity or catalytic inactivity may be used to facilitate “nicking” or transcriptional regulation respectively7–9. CRISPR/Cas9 has been used for a wide range of applications including both knock-in and knockout10,11, large-scale genomic deletions12–14, pooled library screening for gene discovery15,16, genetic engineering of numerous model organisms10,11,17–21, as well as gene therapy22,23.
Here we describe a protocol for efficient deletion of desired genomic regions. The protocol includes CRISPR design, cloning, and delivery, as well as deletion, identification, and characterization. Genomic deletions can be generated by the introduction of two CRISPR sgRNAs with Cas9 to induce repair of the resultant two DSBs by NHEJ with deletion of the intervening segment. This strategy has been used to create deletions ranging from one kilobase to over one megabase12. Deletions can be informative for the study of genes and other genetic elements, either in isolation or in combination. There are several potential advantages of genomic deletions as compared to HDR or single-site small indel production. First, this method capitalizes on the high efficiency of NHEJ in many cellular contexts7. The high frequency of deletion limits the number of clones needed to be screened to identify informative clones. Deletion frequency is inversely related to deletion size. Biallelic deletion clones may be retrieved at frequencies at least as great as of probabilistic expectation12. Second, both monoallelic and biallelic deletions may be easily identified and distinguished by conventional PCR, simplifying the screening process. Strategies relying on small indels or point mutations may require RFLP, allele-specific PCR, T7EN1 cleavage assay, Sanger sequencing, RT-qPCR, or immunoblotting, which may be more laborious. Third, by removing a substantial portion of a gene or element of interest, a reliable loss-of-function allele may be obtained. In contrast, frameshift mutations in protein-coding sequences may not always induce nonsense-mediated decay, may produce a hypomorphic or neomorphic allele, or target an exon excluded from an alternate isoform24. Finally, deletions may be particularly revealing for the study of non-coding DNA such as regulatory elements since frameshift mutations as produced by single-site indels would not be relevant25.
CRISPR / Cas9 sistem çeşitli boyutlarda genomik silme oluşturmak için kullanılabilir. Biz silme sıklığı amaçlanan silme boyutuna göre ters orantılı olarak değişir görülmektedir rağmen, rutin birden bialelik silinmiş klonları elde 100 kb varan 1 Mb silmeler ve silmeleri kurtarmak mümkün olmuştur. Bir hücre hattı, sırasıyla sokulması silmeleri verim kaybı gözlemlenmiştir. Bu strateji, bir çok gen ve elemanlar arasında birleştirici silme oluşturulması için kullanılabilir. bialelik silme klonları elde süreci bialelik silinmesi 12 klonların istenen sayısını elde etmek için silme boyutuna göre ekranlı gereken klonların az sayıda tahmin edilerek hızlandırılmış olabilir.
olasılık dağılımına bialelik silinmesi yokluğu ile monoallelik silme elde yeteneği fonksiyonunun tamamen kaybı ile ilişkili hücre öldürücü gösterebilir. Düşük frequency veya yok silmeler zayıf transfeksiyon, verimsiz sgRNAs veya (nedeniyle bir pozitif kontrol eksikliği silinmesi için ekran PCR primerleri doğrulamak için) verimsiz PCR primerleri tarama dahil bir dizi senaryoyu yansıtıyor olabilir. GFP + hücreler transfeksiyon verimliliği (adım 5.2) için bir vekil olarak kullanılabilir, böylece, GFP + hücrelerinde bir azalma muhtemelen zayıf transfeksiyon yansıtır ve husule gelen silme etkinliği azalmıştır. Verimsiz sgRNA için kontrol yardımcı olabilir bağımsız tarama primerleri ile iki farklı sgRNA çiftleri kullanılarak ve PCR primerleri tarama ve bialelik silme klonları elde şansını maksimize. GFP + hücreler için sıralama Hücre silme allelleri için zenginleştirir. Bu adım, ihmal edilebilir olsa da, ihmal muhtemelen monoallelik veya bialelik silme olan tespit etmek daha fazla klonun taranması gerektirecektir. Transfeksiyon verimliliği optimize edilebilir olduğu ölçüde, biz genom düzenleme verimliliği gelişmiş olması beklenir.
<p ckız = "jove_content" hedef bölgelerde indellerin çeşitli alellerin bir dizi silme ve yerel onarım sonucunu altında yatan> NHEJ olaylar. 10 bp'lik girmeler ya da daha yaygın olarak sgRNA yönelik bölünme (Şekil 2B) yerinde kromozom anormallikleri – baskın sonuç küçük ~ 1. Genellikle bu aleller microhomology dayalı onarım 34,35 sonucu gibi görünmektedir. Biz tarif PCR bazlı saptama stratejisi daha büyük veya daha karmaşık bir ekleme, delesyon, evirtme ve yeniden düzenlemeler tespit etmeyeceği hususu not edilmelidir. Bu olaylar daha az yaygın olmasına rağmen, biz ne silme ne de olmayan silme amplikonlar tespit edilebileceği klonları gözlenen ve daha fazla araştırma üzerine bu daha karmaşık sonuçlar yansıtmaktadır var.Biz geniş CRISPR / monoallelik ve non-silme klonları olmayan silme allel "yara izi" Cas9-aracılı gözlemledik (Şekil 2B bakınız). Bu "izleri" oluşuristenen silme olmadan sgRNA bölünme yerinde üretilen küçük indeller (yani, sgRNAs A ve B arasındaki müdahalede segmentin silinmesi). Bu yara izleri genellikle sgRNA hedef tanıma kesme. Bu nedenle daha önce aynı sgRNAs kullanarak sgRNAs maruz kalan hücrelerde allellerini yeniden hedefleme dikkatli çağırıyorum. Benzersiz sgRNA kullanmak istiyorum bir daha başarılı yeniden hedefleme stratejisi önce "yaralı" tanıma sitelerinden farklı dizileri. Durumlarda sgRNAs bir çift (Şekil 1B, alt), çerçeve kayması alleller da silme yokluğunda üretilebilir egzonik dizileri algıladığında. Bu nedenle, monoallelik silme klonları nedeniyle alel 12 olmayan silinmiş üzerine frameshift mutasyonların yüksek frekans kaybı fonksiyon-zenginleştirilmiş olabilir.
38 – CRISPR / Cas9 sistemi ile Tek endişe hedef dışı etkileri, yani, istenmeyen sitelere 36 de genomik değişiklik. Recent raporları 17 ile kısa kılavuz RNA'lar ileri sürmüşlerdir – 19 nükleotid CRISPR sıklığını azaltabilir / off-hedef etkilerini 39 Cas9 tabanlı. Buna ek olarak, bir nickase hedef bölge başına iki kılavuz kullanılarak çift-çentikleme stratejisi hedef dışı etkiler 7 en aza DSBs oluşturmak için de kullanılabilir. Seçenek olarak ise, RNAi kullanılan stratejilere benzer biz örtüşmeyen protospacer dizileriyle sgRNAs farklı çiftlerinin hedef dışı bir potansiyele karşı gözlenen fenotipin üzerinde hedef CRISPR / Cas9 modifikasyonu sonucu olduğunu göstermek için kullanılabilir olduğunu düşündürmektedir etkisi. Uygun bir yaklaşım, tarama primerler (adım 2), tek bir dizi çoklu sgRNA çifti (Şekil 1A) için de kullanılabilir, böylece en az iki bitişik, fakat örtüşmeyen sgRNA çiftleri tasarım olacaktır. Ayrıca, eksik dizisi ve / veya bozulmuş geni reintroducing bir silme hücre hattı tamamlayan arasında nedensel bir ilişki kanıtlamak olabilirBelirli bir genomik silme ve fenotip.
Hücresel model sistemler ile çalışan biyologlar için, RNAi fonksiyonel genomik için güçlü bir araç temsil etmiştir. 42 – Ancak, bu yaklaşımın sınırlamalar hedef mRNA transkript düzeylerinde azalma eksik, aynı geni hedef bağımsız reaktiflerin etkisinin heterojenitesini ve tohum bazlı olmayan tohum etkileri 40 olmak üzere bilinen off-hedef etkilerini dahil ettik. Genom düzenleme stratejileri bu endişelerin çoğu ele veriyorum ve muhtemel genetik pertürbasyon 8,36,37 için heyecan verici, tamamlayıcı bir yaklaşım temsil eder. Ayrıca, genom düzenleme RNAi mümkün geleneksel hedeflemenin zor bir şekilde genetik elemanları kodlayıcı olmayan 25 yaklaşır çalışması için izin verir. Biz üretmek ve zarar fonksiyon-alellerini karakterize için sağlam ve özel bir yöntemi olarak CRISPR / Cas9 tarafından genomik silme nesil teşvik.
The authors have nothing to disclose.
Thanks to Jason Wright for suggesting the Golden Gate Assembly cloning strategy and Katherine Helming and members of Orkin lab, particularly Jian Xu, Guoji Guo, Elenoe Smith, and Partha Das for helpful discussions. This work was supported by NIH R01HL032259 and P30DK049216 (Center of Excellence in Molecular Hematology) to S.H.O. and NIDDK K08DK093705 to D.E.B.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
T4 DNA Ligase (with associated ligation buffer) | New England Biolabs | M0202T | |
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
BSA, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | B9000S | |
BbsI Restriction Enzyme (with associated NEB Buffer 2.1) | New England Biolabs | R0539S | |
pSpCas9(BB) (pX330) | Addgene | 42230 | |
S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
BTX ECM 830 | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
BTX Solution and 2mm Cuvettes | Harvard Apparatus | 45-0803 | |
pmaxGFP Plasmid | Lonza | VPA-1003 | |
QuickExtract DNA Extraction Solution | Epicentre | QE09050 | |
HotStarTaq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 203443 | |
Zero Blunt PCR Cloning Kit | Life Technologies | K2700-20 |