Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Optimera Utmätning av Human mesenkymala stamceller på Poly (ε-kaprolakton) Electrospun Garner

doi: 10.3791/52135 Published: April 10, 2015

Abstract

Forskning kring biomaterial och vävnadsteknik inkluderar ofta cellbaserade in vitro undersökningar som kräver initial kunskap om startcellnummer. Medan forskarna refererar ofta deras sådd täthet detta inte nödvändigtvis indikerar det faktiska antalet celler som har anslutit sig till det aktuella materialet. Detta är särskilt fallet för material, eller byggnadsställningar, som inte täcker basen av standardcellodlingsbrunnsplattor. Denna studie undersöker den inledande infästning av mänskliga mesenkymala stamceller sådda på ett känt antal på electrospun poly (ε-kaprolakton) garn efter 4 tim i kultur. Elektrospunna garner hölls inom flera olika uppställningar, inklusive bioreaktor fartyg som roterar med 9 rpm, cellodlingsinlägg placerade i låga bindningsbrunnsplattor och polytetrafluoretylen (PTFE) tråg placerade inom petriskålar. De senare två utsattes för antingen statiska betingelser eller placerade på en skakapparat platta (30 ° C, 5% CO2, var platsen för sådda celler bestämdes genom cell-DNA-analys. Ställningar togs bort från sina behållare och placeras i lyseringsbuffert. Medierna fraktionen liknande avlägsnades och centrifugerades - supernatanten kastades och pelleten bryts upp med lysbuffert. Lysis-buffert sattes till varje kärl, eller väl, och skrapades för att frigöra eventuella celler som kan finnas närvarande. Den cell-DNA-analysen bestämdes den procentuella andelen celler som finns inom byggnadsställning, media och brunns fraktioner. Cellfäste var låg för alla experimentella uppställningar, med störst fäste (30%) för garner som hålls inom cellodlingsinlägg och utsätts för skakningar rörelse. Denna studie lyfter medvetenhet till det faktiska antalet celler som är förenade med ställningar oavsett den angivna cellsåddtäthet.

Introduction

Byggnadsställningar rutinmässigt utvecklas och forskat för biomaterial och vävnadstekniska tillämpningar. Som sådana är de vanligen ympats med celler och deras in vitro beteende kännetecknas genom analyser som bestämmer celltillväxt och cellnummer, till exempel. För experiment som dessa, är det absolut nödvändigt att den initiala cellantalet är känd och forskare uppger ofta sådd koncentrationen i fråga om antalet celler per ml eller cm 2. Även om detta är en bra metod, speciellt för uppskalningsändamål, betyder inte hänsyn till det faktiska antalet celler som vidhäftar till ställningen yta (som också är beroende av de vidhäftande egenskaperna hos biomaterialytan 1). Detta gäller särskilt för byggnadsställningar som inte täcker hela basen av cellodlings brunnar som celler kan falla bort från konstruktionen och, på grund av den ofta statiska karaktären av experimentet, kan aldrig komma tillbaka i kontakt med materialet för integrevila. Electrospun fibergarn är ett bra exempel på en byggnadsställning som inte täcker basen av brunnen (Figur 1A). I detta fall bör låg bindningsbrunnsplattor som inte har ytbehandlats användas för att förhindra celler från att fästa till plattans yta och därmed snedvrida resultaten av eventuella väl baserad analys.

Brunnars plattor är lätt användas för cellsådd på byggnadsställningar, men de är inte den enda metod som finns tillgänglig. Roterande cellodlingssystem, en typ av bioreaktor utvecklats av Life Sciences Division på NASA i slutet av 1980-talet, kan på liknande sätt användas till utsäde byggnadsställningar inom en tredimensionell (3D) miljö med simulerad tyngdlöshet. Denna typ av bioreaktor förblir ett populärt val med forskare över hela världen och har införlivats i studier för cellsignalering 2,3, stamceller 4,5 och tissue engineering 6,7. Vad gör den roterande bioreaktor föredra framför brunnsplattor är underhålletav en 3D-miljö, vilket bidrar till att förhindra differentierade celler från dedifferentiating, vilket ofta är fallet när de odlas inom konventionella 2D förhållanden 8.

Denna uppsats undersöker olika tekniker för sådd mänskliga mesenkymala stamceller på electrospun poly (ε-kaprolakton) fibertrådar som tillverkas i et al. Bosworth, 9 för att maximera den initiala antalet celler som är knutna till dessa ställningar inom en 4 h period. För 2D kultur, har garner säkert hållas inom brunnsplattor eller skräddarsydda poly (tetrafluoroeten) (PTFE) tråg och hållas under statiska förhållanden, eller skakas vid 30 rpm. För 3D kultur ades garn och celler hållas inom bioreaktor fartyg som roterar med 9 rpm.

Protocol

1.Scaffold Fabrication och sterilisering

  1. Lös PCL i 1,1,1,3,3,3-hexafluorisopropanol att ge en 10% vikt / volym koncentration. Som beskrivs i Bosworth et al, 9 electrospin polymerlösningen (parametrar: 20 kV, 1 ml / tim, 20 cm). Och samla inriktade fibrer på kanten av en roterande spindel (600 rpm). Med en skalpell bort band av insamlade fiber och sedan skärs i kortare längder - 3 cm (för tråg och roterande kärl) och 4 cm (för cellodlings skär) längder.
  2. Med fin pincett dränka enskilda remsor i destillerat vatten och ta bort.
  3. Håll i båda ändar mellan tummen och pekfingret; vrida manuellt bandet tills det liknar tråden.
  4. Dränka korthet denna tråd liknande byggnadsställning i destillerat vatten och placera den rena, fiberfrämmande kort för att torka.
  5. När torr, plats individuellt i rena mikrocentrifugrör och tillsätt 1 ml 50% v / v etanol i destillerat vatten. Stäng locken och låt stå i 24 tim.
    Notera: Utför följande steg enligt laminärt flöde:
  6. Placera mikrocentrifugrör i en skåp med laminärt flöde och aspirera 50% volym / volym lösning. Ersätt med 1 ml 70% v / v etanol i destillerat vatten, nära lock och låt stå i 24 timmar.
  7. Upprepa för 90% och 100% volym / volym etanol i destillerat vatten (1 ml volymer).
  8. Tvätta ställningar två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 24 h per tvätt (2 x 1 ml).
  9. Ta bort PBS och ersätta med 1 ml cellodlingsmedia. Anm: Ställningar är klara för användning efter 24 tim.

2. Fastställande Scaffold Yta och Antal Celler

  1. Med hjälp av en ljusmikroskop och bildbehandlingsprogram, mät diametern på electrospun garnet längs dess längd för att bestämma ett medelvärde.
  2. Antag garnet att vara en cylindrisk stång och approximera ytarea använder:
  3. Där A = Yta, r = radie och h = längd
    Obs: Ytarean beräknades vara 18.902, 800 ^ m 2. Vidare bör det noteras att den verkliga ytarean kommer att vara större än denna beräkning eftersom garnet är sammansatt av hundratals fina fibrer, som kommer att öka ytarean. Följaktligen ett större antal celler bör kunna fästa till ställningen. Men detta påverkar inte en direkt jämförelse mellan testgrupper görs.
  4. Bestäm det maximala antalet celler som kan fästa till den exponerade ställningsytan genom:
    Obs: Med hjälp av en ljusmikroskop och bildbehandlingsprogram, var diametern på humana mesenkymala stamceller bestämdes till 20 pm (förutsatt celler är runda), alltså i detta fall, antal celler = 60.200.

3. Scaffold Set-up - Cell Culture Inserts (Figur 1A)

  1. Under laminärt flöde, öppna sterila 6 brunnar cellodlingsinlägg och separera de kortare ringar med tänder från bredare vikare organ.
  2. Ta ringen med tänderna pekar uppåt. Drape enav de 4 cm byggnadsställningar över mitten av ringen och se den överlappar på båda sidor. Ta ringat kroppen och position över den tandade ringen och klätterställning och skjut nedåt se ställningen stannar i position och ligger genom centrum av cellodlingsinsatsen.
  3. Placera cellodlingsinsats med byggnadsställning i brunnen på en 6-brunnars, låg bindningsplattan.
  4. Tillsätt 10 ml odlingsmedia till schavotten.

4. Scaffold Set-up - Trough (Figur 1B)

  1. Under laminärt flöde, plats poly (tetrafluoroeten) (PTFE) dalar i individuella petriskålar och tillsätt 10 ml av odlingsmedia till tråget.
  2. Använd pincett drapera en av de 3 cm ställningar i tråget och se dess längd ligger parallellt med tråget s längre kanten.

5. Scaffold Set-up - Bioreaktor Vessel (Figur 1C)

  1. Under laminärt flöde, dosera 10 ml steril PBS genom bioreaktor fartygetsviktigaste hamn och låt stå i 10 minuter.
  2. Ta bort PBS och ersätt med 8 ml odlingsmedium.
  3. Använd pincett, sätt en av cm byggnadsställningar 3 in i kärlet via huvudporten.
  4. Stäng av huvudporten.

6. Cellräkning

  1. Kultur humana mesenkymala stamceller (hMSC) härrör från benmärg enligt tillverkarens protokoll upp till passagen 4 före skörd.
  2. Aspirera media från en 75 cm 2-kolv innehållande hMSCs härrör från benmärg (passage 4, 80% konfluens).
  3. Tvätta cellerna med 10 ml steril PBS och aspirera.
  4. Lägg 3 ml trypsin och inkubera kolven vid 37 ° C, 5% CO2 tills cellerna har lösgjorts från kolvytan.
  5. Lägg 7 ml odlingsmedia för att inaktivera enzymet och överför denna totala volym (10 ml) till ett centrifugrör.
  6. Resuspendera denna cellsuspension genom att pipettera upp och ned flera gånger för att homogent dispergera celler inommedia och begränsa cell agglomerat (10 ml pipett).
  7. Avlägsna 20 pl cellsuspension och överföring till en haemocytometer.
  8. Placera hemocytometer under ett ljusmikroskop och bild vid x10 objektiv.
  9. Fokusera rutnätet och räkna antalet celler i 4 x 4 rutor i varje hörn av nätet och som omfattas av det torget och de som korsar den högra eller nedre gränslinjen. Räkna för varje uppsättning av 4 x 4 rutor (4 pulser per rutnät).
  10. Upprepa resuspension och celltal tre gånger (steg 6,6-6,9).
  11. Beräkna den genomsnittliga celltal och fastställa omfattningen av media som krävs för cell resuspension (cellkoncentrationen 60.200 i 200 l). Till exempel, fastställa den genomsnittliga celltal från haemocytometer och sedan fastställa den totala genomsnittliga antalet celler från de tre separata räkningar. Multiplicera med ett x 10 4 för att ge antalet celler per ml och därefter multiplicera med den totala volymen av cellsuspension för att ge tilltal antal celler. Använd följande ekvation för att bestämma volymen av media som krävs för resuspension:
  12. Centrifugera cellsuspensionen vid 241 xg under 5 minuter.

7. Cell Seeding

  1. Aspirera media från centrifuge röret lämnar cellpelleten och ersätta med den beräknade medievolymen.
  2. Resuspendera cellerna och media för en jämn blandning.
  3. Med hjälp av en P200 Gilson pipett sakta dispensera 200 pl av cellsuspensionen på varje byggnadsställning genom att köra pipettspetsen längs ställningen längd och under mediavätskeytan. Lämna ostört i 20 min.
  4. För bioreaktor fartyg, dosera 200 l av cellsuspension genom huvudporten. Top-up resterande 2 ml odlingsmedier via sprutportar för att ge en total volym av 10 ml.

8. Experimentell Start

  1. Överför bioreaktor kärlen till RCC-4DQ bioreaktor och inställd på att rotera vid 9 rpm.
  2. TranSfer brunnsplattor med cellodlingsinlägg och dalar till shaker plattan och inställd på att rotera vid 30 rpm.
  3. Överför brunnsplattor med cellodlingsinlägg och dalar till hyllan i en cellinkubator inställd på 37 ° C, 5% CO2 (statisk odling).

9. DNA-analys

  1. Bered lösningar - lys buffert, 1x TE buffert, DNA standarder och cell DNA arbetslösning - enligt tillverkarens anvisningar.
  2. Efter 4 timmar, ta prover från inkubatorn och placera under laminärt flöde.
  3. Ta bort mediefraktioner från alla prover och placera in separat märkta centrifugrör. Centrifugera rören 241 xg. Avlägsna supernatanten och tillsätt 3 ml lysbuffert. Resuspendera lösningen för att bryta upp cellpelleten.
  4. Använd pincett bort byggnadsställningar och plats i centrifugrör innehållande 3 ml lyseringsbuffert (för byggnadsställningar inom bioreaktor kärlen, ta bort ställningen före aspirera migdia). För byggnadsställningar som hålls inom cellodlingsinlägg, först frigöra ställningen genom att skära ställningen nära insatsens kanten med en skalpell.
  5. Lägg 3 ml lyseringsbuffert till varje schavotten kärl och skrapa ytan (kraftigt agitera för bioreaktor kärlen). Ta lysbufferten och placera in separat märkta centrifugrör.
  6. Vortex varje centrifugrör under ca 1 min för att säkerställa tillräcklig omröring av cellerna och buffert och uppmuntra lys av cellmembranet.
  7. I en svart 96 brunnar, tillsätt 100 pl lyseringsbuffert för varje provfraktion - schavotten, media och väl (duplicera).
  8. I mörkret, tillsätt 100 | il av cell-DNA-lösning till samtliga brunnar innehållande lyseringsbuffert och blanda försiktigt.
  9. Inkludera brunnar med lysbuffert innehållande inget DNA och cell DNA-lösning för att ge en negativ och en positiv kontroll för brunnar.
  10. Med användning av en fluorescensplattläsare, mät absorbansen av brunnens använder 485 nm excitation och 520 nm emission.
  11. Jämför data med standardkurvan som genererats från DNA-standarder i enlighet med tillverkarens instruktioner.

10. Svepelektronmikroskop (SEM) Fixering

  1. Utför följande steg under laminärt flöde: Efter 4 timmar, ta bort alla ställningar från sina kärl och plats inom en ny 6-brunnar (separata brunnar).
  2. Tvätta ställningar två gånger med PBS.
  3. Utför följande steg på den öppna bänk: Till varje brunn, tillsätt 2 ml 1,5% v / v glutaraldehyd i PBS för att säkerställa fullständig täckning av schavotten.
  4. Låt plattan för minst 30 min vid 4 ° C för cellfixering.
  5. Avlägsna fixeringslösning och tvätta ställningar två gånger med PBS.
  6. Dehydrera ställningar med ökande koncentrationer av etanol i destillerat vatten som börjar med 50% volym / volym, följt av 70% volym / volym och 90% volym / volym. För varje koncentration, fullt Doppa de ställningar i Solution (2 ml) och låt stå i 3 min. Kassera lösningen och upprepa.
  7. Torka i 100% etanol genom fullt sänka ned de ställningar i lösning (2 ml) och lämnar i 5 min. Kassera lösningen och upprepa.
  8. Kemiskt torka ställningar med hjälp hexametyldisilazan (HMDS) inom ett dragskåp. Doppa ställningar i HMDS (2 ml) och låt stå i 5 minuter. Ta bort HMDS och upprepa.
  9. Ta bort HMDS och låt ställningar torka. Montera ställningar på kommersiellt tillgängliga SEM stubbar (i detta fall rostfritt stål stubbar med kol flikar självhäftande).
  10. För att underlätta visning inom SEM, för att belägga de prover med ett guld-sputter coater i 2 min säkerställa en tunn och jämn täckning.
  11. Placera prover inom SEM och visualisera cell-seedade byggnadsställningar med hjälp av en 5 keV elektronstråle.

Representative Results

Resultaten belyser placeringen av celler efter 4 h efter ympning för varje experimentella uppställning undersökts. Figur 2A visar den procentuella andelen av celler som har fäst till ställningen ytan under denna tid. En omvandlingsfaktor på 8,5 pg / cell användes för att omvandla den uppmätta DNA-innehållet i cell nummer och därmed bestämma andelen celler 10. För alla sådd uppställningar undersökt, är andelen cellbindning relativt låg, med störst cell följsamhet (30%) för byggnadsställningar som hålls inom cellodlingsinlägg och skakades vid 30 rpm (Insert Shaker). Lägsta följsamhet (15%) var för byggnadsställningar som hålls inom cellodlingsinlägg och hållas under statiska förhållanden (Insert Statisk).

Ett stort antal celler var närvarande i medierna fraktionen (Figur 2B), främst för cellodlingsinsatser som hålls inom låga bindnings plattor (Insert Statisk) och roterande fartyg vara 50% och 51%respektive. Ställningar som hålls inom trågen visade en upphöjd antal celler närvarande inom själva hållaren - 48% av celler för Tråg Shaker och 50% för Tråg Statisk.

Svepelektronmikroskopi tillät en visuell bedömning av cellsådd byggnadsställningar (Figur 3). Bilderna markerade en begränsad närvaro av celler på fibrösa ytan, oavsett sådd installation. Men ett större antal celler och cell agglomerat var närvarande på byggnadsställningar som hålls inom cellodlingsinlägg och skakades vid 30 rpm (Insert Shaker).

Figur 1
Figur 1. experimentella uppställningar, där Electrospun Garn hålls inom; (A) cellodlings skär och låg bindningsbrunnsplatta, (B) poly (tetrafluoroetylen) (PTFE) tråg och petriskål; och (C) bioreaktor kärl. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Placering av celler 4 tim efter sådd på PCL Electrospun Garner använder olika sådd uppställningar. (A) Demonstrerar andelen celler som har kopplade till PCL schavotten (medelvärde ± standardavvikelse), (B) belyser den procentuella spridningen av cell plats inom de tre fraktionerna - media, väl och klätterställning (n = 4, uppgifter presenteras som medelvärden). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3

Figur 3. Representativa svepelektronmikro för PCL Electrospun Garner med Human mesenkymala stamceller, 4 timmar efter initial sådd med hjälp av olika experimentella uppställningar. (Alla bilder på 1,000X förstoring, skal bar = 130 nm.) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Elektrospunna fibermatriser tillverkade av biopolymerer regelbundet används för att stödja cellbindning och spridning för biomaterial och / eller vävnadstekniska tillämpningar 11,12. I dessa fall, matriserna är ofta tunna blad av fibrer som lätt täcker hela basen av ett cellodlingsbrunnsplatta och sålunda är i fullständig kontakt med sådda celler som förbättrar cellvidhäftning. Men om biomaterial ställningen inte helt täcker basen av brunnar, det finns en stor chans att en stor andel av de sådda cellerna inte kommer att stanna i kontakt med byggnadsställningen och i slutändan inte kommer att kunna fästa. Denna studie undersökte flera olika metoder för sådd celler på byggnadsställningar som inte täcker basen av brunnar, i syfte att fastställa en optimerad teknik som kan rekommenderas för framtida cellbaserade experiment.

Fem olika uppställningar undersöktes (Figur 1): scaffolds (electrospun garn) höll med hjälp cellodlingsinlägg inom låga bindningsbrunnsplattor och antingen hållas under statiska förhållanden eller skakas vid 30 rpm; byggnadsställningar placerade inom snäva PTFE dalar och höll statisk eller skakas vid 30 rpm; och byggnadsställningar inrymt inuti bioreaktor fartyg som roterar med 9 rpm. Bestämmande av antalet celler som hade anslutit sig till de elektrospunna garner genom DNA-analys visade en låg andel av fäste för alla sådd uppställningar (Figur 2); och detta bekräftades ytterligare från svepelektronmikrofotografier (SEM) (figur 3). Greatest cellvidhäftningen - 30% eller ~ 18.060 celler -var observerats för garner som hölls inom cellodlingsinlägg och utsätts för kontinuerlig rörelse. Intressant var lägst cellbindning (15%) uppnås för garner som innehas av cellodlingsinlägg men hålls under statiska förhållanden, vilket skulle tyda på att införandet av radiell rörelse har en positiv effekt på att hålla cellerna i kontakt med byggnadsställningen. EmellertidDet bör noteras att kontinuerlig cirklande av medias flöde kan vara ansvarig för cell agglomerat observerade från SEM-bilder. Den shaker plattan sattes på sin lägsta inställning - 30 rpm - vilket skulle kunna vara en begränsning till denna uppsättning. Med användning av en långsammare radiell rörelse kan bidra till att förhindra eller minska cell agglomerering och skulle också kunna förbättra cellvidhäftning som celler kommer att uppleva mindre kraft. Framtida experiment bör fokusera på att optimera den ideala shaker hastighet för bättre cellbindning. Införliva förslag till garn som hålls inom de dalar resulterade inte i en liknande trend, med båda scenarierna ger 18% fäste (~ 10.836 celler); även om detta kan bero på den partiella flyt av byggnadsställningar inom trågen (observeras för tråg placerade på shaker plattan), eftersom de inte var förankrade till basen. Partiell flytning av byggnadsställningen kommer att förhindra eventuella celler som har sjunkit till botten av tråget från att komma i kontakt med materialet och vidhäftning. För thans särskilda uppsättning, var tråget inrymd i en petriskål och en total 10 ml volym av medium tillsattes. De små dimensionerna hos tråget innebär att majoriteten av medierna är närvarande inuti petriskålen och om det finns någon rörelse, kan celler glida iväg från tråget in i petriskål och förbli helt utom räckhåll för byggnadsställningen. För att övervinna dessa begränsningar, bör ytterligare experiment inkluderar ett extra steg i protokollet, varvid ändarna av byggnadsställningar är uppsatt på basen av tråg som använder sterila fin-nålar, eftersom detta skulle hindra deras flyt och rörelse (särskilt för byggnadsställningar utsatta för radiell rörelse), vilket i slutändan skulle leda till ett ökat antal celler som är knutna till schavotten. 16% av cellerna hade fäst trådarna som finns inom de roterande kärl. Trots att en väl etablerad teknik för 3D kultur, gjorde uppstår problem med avlägsnande av byggnadsställningar från fartygens huvudport, vilket kan ha lett till löst attacHed celler går förlorade. Fartyg som kan öppnas helt skulle eliminera detta problem; dessa är tillgängliga att köpa, men är betydligt dyrare än de engångs fartyg som används i denna studie.

Denna studie visar de aktuella frågor med sådd byggnadsställningar som inte täcker hela basen av standardcellodlingshålsplattor. Sådd ett känt cell nummer resulterade i mindre än en tredjedel är knuten till schavotten, trots ställningen s yta möjliggör för alla celler att hålla sig. Detta skulle kunna få negativa konsekvenser i andra cellbaserade analyser som kan bedöma biokompatibilitet och cellmaterial / cell-cell beteende och samspel med ställningen som en potentiell framtida medicinteknisk produkt. Ytterligare begränsningar av studien kan omfatta 4 h tidspunkt - trots att tillräckligt lång för att säkerställa initiala cellsådd (celler har visat sig ordentligt fästa vid substrat inom trettio minuter 13,14,15), kan det vara rimligt att itesta själva senare tidpunkter som ger celler inte föröka under en längre tidsram, eftersom detta annars skulle skeva startcellnummer. Att minska volymen av media, i detta fall 10 ml, även skulle kunna förbättra kontakten mellan cellerna och byggnadsställning och i slutändan öka cellbindning. Framtida studier bör också överväga cellviabiliteten som processen att cellsådd kan orsaka cellskador och / eller celldöd 16. Cell DNA-analyser gör ingen skillnad mellan livskraftiga och icke livsdugliga celler, som sådan en levande / död analys, till exempel, skulle lyfta nivån på lönsamheten.

Denna undersökning ökar medvetenheten till det faktiska antalet celler som fäster till schavotten trots sådd en känd kvantitet. För studier som är beroende av utgångs antalet celler, är det mycket viktigt att de forskare veta exakt hur många av denna omsättning gör faktiskt vidhäfta till substratet av intresse.

Acknowledgments

Författarna vill tacka och erkänna det medicinska forskningsrådet för att finansiera denna forskning - MRC-DPFS bidrag koden G1000788-98812.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Distilled water in-house supply n/a
Ethanol Merck 1117271000
Phosphate Buffered Saline solution Life Technologies 70013016
Human mesenchymal stem cells PromoCell GmbH C-12974
MSC culture media PromoCell GmbH C-28010B Warmed to 37 oC before use
Supplement mix PromoCell GmbH C-39810 Add to culture media
Antibiotic/antimyotic mix Sigma-Aldrich A5955 Add to culture media
Trypsin (0.05%) EDTA (0.02%) Sigma-Aldrich 59417C Warmed to 37 °C before use
Cell culture flasks (T75) Becton Dickinson Ltd 353110
Low binding 6-well plates Costar Corning 3471
6-well CellCrowns Scaffdex C00003S
Petri-dish 50 ml deep Sterilin 124
PTFE troughs in-house production n/a
Disposable RCCS vessels 10 ml Synthecon D-410
4 Vessel Rotary Cell Culture System bioreactor Synthecon RCCS-4DQ
Shaker plate Stuart SSM1 Mini Orbital Shaker
Haemocytometer Digital Bio DHC-F01 Disposable C-Chip
Centrifuge tube Deltalab 352096, 429901 15 ml and 50 ml
Centrifuge Hettich Rotafix 32 A
Syringe 3 ml Shield Medicare Ltd 3039820
Pipettes Sterilin 40305, 47310, 40125 5, 10 and 25 ml
Gilson pipettes SLS F144801, F144802, F123600, F123601, F123602 P2 - P1000
Pipette tips SLS PIP7852, PIP7834, PIP7840
Micro test tube 1.5 ml Eppendorf 30125.15
Triton X-100 Sigma 9002-93-1
PicoGreen Assay Invitrogen P7589 Assay set-up in the dark
Black 96-well plate Greiner Bio One 655086
Fluorescent plate-reader BGM Labtech FLUOstar Optima
Glutaraldehyde 25% TAAB Laboratories G002 Made to a concentration of 1.5% v/v in PBS
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma 999-97-3
Aluminium stubs (SEM) Agar Scientific G301
Carbon tabs (SEM) Agar Scientific G3347N
Gold sputter coater Edwards S150B
Scanning Electron Microscope (SEM) Phenom World Phenom Pro

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jauregui, H. O. Cell adhesion to biomaterials. The role of several extracellular matrix components in the attachment of non-transformed fibroblasts and parenchymal cells. ASAIO transactions/American Society for Artificial Internal Organs. 33, (2), 66-74 (1986).
  2. Puca, A., Russo, G., Giordano, A. Properties of Mechano-Transduction via Simulated Microgravity and its Effects on Intracellular Trafficking of VEGFR's. Oncotarget. 3, (4), 426 (2012).
  3. Vincent, L., Avancena, P., Cheng, J., Rafii, S., Rabbany, S. Y. Simulated microgravity impairs leukemic cell survival through altering VEGFR-2/VEGF-A signaling pathway. Annals of biomedical engineering. 33, (10), 1405-1410 (2005).
  4. Rungarunlert, S., Klincumhom, N., Tharasanit, T., Techakumphu, M., Pirity, M. K., Dinnyes, A. Slow Turning Lateral Vessel Bioreactor Improves Embryoid Body Formation and Cardiogenic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells. Cellular Reprogramming. 15, (5), 443-458 (2013).
  5. Wu, X., Li, S. H., Lou, L. M., Chen, Z. R. The Effect of the Microgravity Rotating Culture System on the Chondrogenic Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells. Molecular biotechnology. 54, (2), 331-336 (2013).
  6. Wang, Y., et al. Rotating Microgravity-Bioreactor Cultivation Enhances the Hepatic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells on Biodegradable Polymer Scaffolds. Tissue Engineering Part A. 18, (21-22), 2376-2385 (2012).
  7. Lv, Q., Deng, M., Ulery, B. D., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Nano-ceramic Composite Scaffolds for Bioreactor-based Bone Engineering. Clinical Orthopaedics and Related Research. 471, (8), 2422-2433 (2013).
  8. Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281, (1), F12-F25 (2001).
  9. Bosworth, L. A., Alam, N., Wong, J. K., Downes, S. Investigation of 2D and 3D electrospun scaffolds intended for tendon repair. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 24, (6), 1605-1614 (2011).
  10. Dormer, N. H., Qiu, Y., Lydick, A. M., Allen, N. D., Mohan, N., Berkland, C. J., Detamore, M. S. Osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in hydroxyapatite-loaded microsphere-based scaffolds. Tissue Engineering Part A. 18, (7-8), 757-767 (2011).
  11. Rayatpisheh, S., Heath, D. E., Shakouri, A., Rujitanaroj, P. O., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. Combining cell sheet technology and electrospun scaffolding for engineered tubular, aligned, and contractile blood vessels. Biomaterials. 35, (9), 2713-2719 (2014).
  12. Wismer, N., Grad, S., Fortunato, G., Ferguson, S. J., Alini, M., Eglin, D. Biodegradable electrospun scaffolds for annulus fibrosus tissue engineering: effect of scaffold structure and composition on annulus fibrosus cells in vitro. Tissue Engineering Part A. (3-4), 672-682 (2014).
  13. Yavin, E., Yavin, Z. Attachment and culture of dissociated cells from rat embryo cerebral hemispheres on polylysine-coated surface. The Journal of cell biology. 62, (2), 540-546 (1974).
  14. Chen, H. Guan, of focal adhesion kinase with its potential substrate phosphatidylinositol 3-kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91, (21), 10148-10152 (1994).
  15. Grant, D. S., Tashiro, K. -I., Segui-Real, B., Yamada, Y., Martin, G. R., Kleinman, H. K. Two different laminin domains mediate the differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures in vitro. Cell. 58, (5), 933-943 (1989).
  16. Carrier, R. L., Papadaki, M., Rupnick, M., Schoen, F. J., Bursac, N., Langer, R., Freed, L. E., Vunkaj-Novakovic, G. Cardiac tissue engineering: cell seeding, cultivation parameters, and tissue construct characterization. Biotechnology and bioengineering. 64, (5), 580-589 (1999).
Optimera Utmätning av Human mesenkymala stamceller på Poly (ε-kaprolakton) Electrospun Garner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bosworth, L. A., Rathbone, S. R., Cartmell, S. H. Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(ε-caprolactone) Electrospun Yarns. J. Vis. Exp. (98), e52135, doi:10.3791/52135 (2015).More

Bosworth, L. A., Rathbone, S. R., Cartmell, S. H. Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(ε-caprolactone) Electrospun Yarns. J. Vis. Exp. (98), e52135, doi:10.3791/52135 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter