We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.
The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.
The lifelong turnover of sensory neurons distinguishes the olfactory system from many other sensory and neuronal systems1,2. Newly formed sensory neurons are continuously generated in the basal portion of the olfactory epithelium3 and extend their axons into the olfactory bulb, the first relay station of the olfactory system4. However, the cellular and molecular mechanisms controlling the formation and maintenance of the olfactory map are far from being fully understood4,5.
Here, we describe a protocol for labeling sensory neurons of the olfactory organ of larval X. laevis by in vivo electroporation of fluorophore-coupled dextrans. The presented protocol allows visualization of axonal morphology and connectivity, track axonal development over time and study mechanisms regulating axonal wiring and guidance.
Electroporation is a well established method to introduce charged macromolecules, like dextran-coupled dyes and DNA, into cells6,7. The cell membrane is permeabilized by application of short voltage pulses and the molecules are electrophoretically delivered into the cytosol8. Spatially restricted electroporation using a micropipette permits selective labeling of cells including neurons and has been applied in various neuronal systems including the visual system of X. laevis9,10.
We show how the electroporated animals can be used to study axonal growth patterns and morphology in living animals using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. The described procedure allows identifying the coarse topology of axonal projections of sensory neurons of the main and accessory olfactory system11,12. Using in vivo time lapse imaging, it is also suitable to supervise the glomerular connections of single mature sensory neurons, and to monitor the evolution of the axonal projection patterns of immature sensory neurons12. The described protocol can be applied to investigate the structure and formation of olfactory circuits in the intact animal and can be adapted to other cell types within the olfactory and other neuronal systems.
Den eksperimentelle fremgangsmåde er beskrevet her tillader mærkning af sensoriske neuroner i lugteorganet af larvernes X. laevis ved elektroporering af fluorofor-koblede dextraner og efterfølgende visualisering af sensorisk axon vækst i levende dyr. Ved at variere parametrene for in vivo elektroporation er det muligt at kontrollere antallet af mærkede sensoriske neuroner. Det er derved muligt at mærke store grupper af neuroner af en sensorisk epithel meget få eller endda enkelte celler.
At sikre den ønskede forlænge af neuronal mærkning er det vigtigt at være særlig forsigtig mikropipetten egenskaber og elektroporation impulser. Højere pipette modstand og reduktion af spænding puls amplitude, varighed og antal gentagelser kan reducere mængden af mærkede celler, hvorimod faldende pipette modstand og højere spænding impulsamplitude, varighed og antal impulser kan føre til mere udbredt mærkning. The brug af fluorescerende dextraner for elektroporation giver øjeblikkelig visuel feedback, hvis de anvendte indstillinger er passende. Vær forsigtig, at bruge parametre for amplitude, varighed og antal pulser, der overskrider de værdier, der er fastsat i protokollen, kan potentielt føre til celleskader eller endda celledød 17. Tilstoppede eller knækkede tips af mikropipetter kan også hindre vellykket elektroporation.
In vivo elektroporation i lugteorganet af X. laevis er begrænset til larvestadier siden hud postmetamorphotic frøer er hårdere og ikke let kan gennemtrænges med en mikropipette. In vivo visualisering af neuronale processer kan hindres ved spredning af excitation / emission lys i dybere områder i hjernen eller ved blodkar. Dette problem bliver særlig tydelig i højere larvestadier på grund af en større hjerne og kan føre til støjende signaler gør klar identifikation af fine axonale processer vanskeligere.
<pclass = "jove_content"> Den præsenterede protokol tilladelser til at visualisere sensoriske neuroner i den intakte olfaktoriske system uden at dissekere dyret beskadige cellerne under mærkning, forbereder vævssnit eller fastsættelse af væv som nødvendigt for alternative metoder, ligesom mærkning i hel-celle patch -clamp forsøg 18. Ved kombination af mærkning af få eller enkelte sensoriske neuroner med in vivo tidsforskydningen billeddannelse, er det muligt at visualisere de glomerulære forbindelser enkelt modne sensoriske neuroner over lange tidsintervaller. På denne måde er det også muligt at overvåge udviklingen af de axonale projektion mønstre af umodne sensoriske neuroner over flere uger. Sidstnævnte mulighed er særlig interessant, da det giver mulighed for at overvåge vækstmønstre enkelte axoner i det levende dyr. Dette åbner mulighed for at undersøge cellulære og molekylære mekanismer, der styrer axon vejledning og stifinding. Flere faktorer, herunder odorantreceptor udtryk, forskellige AXOn vejledning molekyler og lugtstof-induceret / spontan aktivitet af sensoriske neuroner er blevet vist at regulere mål konstatering af sensoriske neuron axoner 4,5.Anvendelsen af protokollen er ikke begrænset til olfaktoriske sensoriske neuroner, men kan også anvendes til at studere andre celletyper, f.eks., Stamceller / progenitorceller af neurogene områder af hjernen eller udvikle mitral celler i lugtekolben. Derudover kan også anvendes påvises teknik i kombination med calcium følsomme dextraner eller injiceres membran-permeable calcium farvestoffer til at få funktionel information om det mærkede neuron og / eller den tilsluttede kredsløb 7,19. Tilgængeligheden af en bred vifte af fluoroforer koblet til dextraner tillader mærkning af flere individuelle celler eller populationer med forskellige farver. Også plasmid-DNA-opløsning, for eksempel koder for fluorescerende proteiner, er egnet til elektroporation og kan yderligere forbedre versatility og nytten af teknikken 6. Protokollen kan yderligere forbedret, så den kombinerede elektroporation af dextraner og DNA eller opladede morpholinos at manipulere genekspression 13,17.
Den beskrevne fremgangsmåde bestemt repræsenterer et nyt værktøj til at undersøge komplekse og endnu ikke fuldt forstået processer, der regulerer axonal vejledning i hvirveldyr olfaktoriske system.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by DFG Schwerpunktprogramm 1392 (project MA 4113/2-2), cluster of Excellence and DFG Research Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (project B1-9), and the German Ministry of Research and Education (BMBF; project 1364480).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
SZX16 | Olympus | stereomicroscope with fluorescent illumination | |
Axon Axoporator 800A | Molecular Devices | single cell electroporator | |
ELP-01D | npi electronic | electroporator | |
MMJ | Märzhäuser Wetzlar | manual micromanipulator | |
P-1000 | Sutter | Horizontal micropipette puller | |
G150F-4 | Warner Instruments | glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier | |
Alexa 488-dextran 10kD | Life Technologies | D22910 | |
Alexa 546-dextran 10kD | Life Technologies | D22911 | |
Alexa 568-dextran 10kD | Life Technologies | D22912 | |
Alexa 594-dextran 10kD | Life Technologies | D22913 | |
TMR-dextran 3kD (micro-Ruby) | Life Technologies | D7162 | |
microloader pipette tips | eppendorf | 930001007 | |
tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | anesthetic; use gloves |
A1-MP | Nikon | multiphoton microscope | |
LSM 780 | Zeiss | confocal microscope | |
Imaris | Bitplane | alternative software for neuronal tracing |