Protocol
注：動物実験における倫理のためのゲッティンゲン大学委員会によって承認された動物の取り扱いおよび実験を行った。
楽器やピペットの作製の作製
- エレクトロポレーションのセットアップは、大きな作動距離を持つ実体顕微鏡で構成され、使用される色素のための蛍光照明とフィルターのセットが装備されていることを確認してください。
- エレクトロポレーションのために専用の単一細胞エレクトロまたはオシロスコープに取り付ける一般的な方形パルス発生器のいずれかを使用します。ピペットホルダーと風呂電極にエレクトロ出力を接続します。マイクロピペットホルダとバス電極と負端子にパルス発生器の正端子を接続する。ピペットホルダーとバス電極の両方が塩化銀の薄層で被覆された銀のワイヤが含まれていることを確認してください。
- 正確な位置決めを可能にするマイクロマニピュレータにピペットホルダーをマウントします。 内部のフィラメントとホウケイ酸ガラスキャピラリーからエレクトロポレーション、マイクロピペットを製作。
- 水平マイクロピペットプラーを使用して、Bestman らによって記載されるように、パッチクランプ実験用ピペットの製造のための修正されたプロトコルを適用する。13。
- 長いシャンク単一細胞エレクトロポレーション用15-20メガオームの高いピペット抵抗をもたらす小さな先端開口を生成するためのパラメータを適応させる。ピペット抵抗は、セル群の標識のために、 例えば 、3-4メガオーム低いはず。
- 直接的に専用の単一細胞エレクトロピペット抵抗測定、規定された電圧パルスの印加後にオシロスコープで電流の流れを測定した後、オームの法則でそれを計算する。
エレクトロポレーションソリューションの調製
- カエルリンガー（98のNaCl、2mMのKClの中で、フルオロフォア結合デキストランを溶解させ、1mMのCaCl 2、2mMの上記MgCl 2は 、5 mMグルコース、5 mMのピルビン酸ナトリウム、pHを7.8に調整し、10mMのHEPESは、オスモル濃度は3 mMの濃度で）230ミリオスモル/ Lであった。低い色素濃度が使用される場合、細胞はそのように明るく標識されなくてもよい。大容量の原液を調製し、少量のアリコートに分割する。ストレージ（ヶ月間安定）のためにそれらを凍結する。
注：デキストランさまざまなサイズで提供され、発光/励起スペクトルの様々な（ 例えば 、アレクサ488デキストラン10KD、アレクサ546デキストラン10KD、アレクサ568デキストラン10KD、アレクサ594デキストラン10KD、TMR-デキストラン3kD。）。 - デキストラン溶液（1-5μl）を少量の細長いピペットチップでマイクロピペットを埋め戻す。注意深くピペットチップから残留気泡を除去するためにマイクロピペットを指ではじく。
- ピペットホルダーにマイクロピペットをマウントします。ピペット内部の銀線を染料溶液に接触していることを確認してください。
幼虫Xの3選定ツメガエル</ em>の
- Xのアルビノ幼虫を使用してください実験のためツメガエル 。野生型動物は、共焦点/多光子イメージング中に自己蛍光発光を示すので、記載された実験には適していない顔料で満たされたメラニン保有細胞を有する。
- Nieuwkoopとフェーバー14の後premetamorphoticオタマジャクシを上演。実験用のステージ45-53のオタマジャクシを選択します。
フォア結合デキストラン4.エレクトロ
- ペトリ皿、組織の小片を置き、0.02％トリカイン（エチル3-アミノベンゾエートメタン、pHを7に調整）を含有する少量の水でそれをカバー。
- 0.02％トリカインを含む水でオタマジャクシを麻酔。いくつかの分後に動物が動いやめる。オタマジャクシに触れることによって、適切な麻酔を確認してください。彼らは、非応答でなければなりません。
- 慎重に組織に覆わペトリ皿に麻酔からオタマジャクシを移す。
- 必ず風呂あるelectrを作るODEは、エレクトロポレーション回路を閉じる。電極がウェットティッシュに接触していることを確認してください。オタマジャクシへの直接接触が必要ではない。
- マイクロマニピュレーターを用いて嗅覚器官に近い位置マイクロピペットチップ。
- ピペットチップで嗅覚器官をカバーする皮膚を貫通し、慎重に主嗅上皮や鋤鼻上皮の中心に位置する感覚ニューロン層に先端を進める。
- 感覚ニューロンに色素を転写する正四角形の電圧パルスをトリガする。単一の電圧パルスを印加する（ 例えば 、25 V、パルス長25ミリ秒）または複数のパルス列（ 例えば 、50 V、パルス長300秒、200 Hzで400ミリ列持続時間）。
注：目的のラベリングの延長のための最適な電圧パルスのパラメータを決定します。標識細胞の数を低下させるために、電圧パルスの振幅、持続時間、および繰り返し回数を減らす。 pが高電圧パルスの振幅、持続時間及び数を適用するより広範な標識のためulses。 - 実体顕微鏡の蛍光灯照明を使用してトリガパルスによる成功した染料押出およびエレクトロポレーションを視覚化する。染料は、成功したエレクトロポレーション後、細胞体と樹状突起に素早く広がります。
- 繰り返しますオタマジャクシの第二嗅覚器官のために4.5から4.9を繰り返します。
- 回復のために新鮮な水で満たされたビーカーにオタマジャクシを移す。約後に5分オタマジャクシが麻酔から覚めると、通常の水泳運動を開始します。
- 24時間後にエレクトロ色素が感覚ニューロンに広がり、最終的には軸索輸送を経由して嗅球に到達した。
細胞および軸索プロセスのin vivo可視化5.取付の動物
- 0.02％トリカインを含む水でオタマジャクシを麻酔。
- 注意深く例えば撮像チャンバ内にオタマジャクシを移す、小さなシリコンゴムは、オタマジャクシサイズの凹部をペトリ皿を覆った。</ LI>
- パラフィルムのストライプに小さな長方形に切る。切り抜き窓を介して露出し前方終脳を残して、パラフィルムでオタマジャクシをカバーしています。オタマジャクシを傷つけることなく、皿の上に針でパラフィルムを固定します。
- オタマジャクシは0.02％トリカインを含む十分な水の中に沈めていることを確認します。
- 直立多光子顕微鏡や共焦点顕微鏡のステージ上イメージングチャンバーをマウントします。
- 嗅球の像の3次元積層を獲得。イメージング処理が可能な限り短く、10〜15分を超えていないことを確認してください。
- 別のタンクに通常の水にオタマジャクシを返すと光への曝露を防止する。 5分後、オタマジャクシが麻酔から目覚める。
- 繰り返します、 例えば 、指定された時間間隔の後に5.1から5.7を繰り返します。毎日。
細胞および軸索プロセスの ex vivo可視化のための6のマウント動物
- 代わり部5にプロトコルの標識された感覚ニューロンを可視化するために摘出した脳の準備を使用しています。
- 麻酔や脊髄への移行時に、脳の離断によってオタマジャクシを殺す。嗅覚器官、嗅神経と前方終脳を含む組織のブロックを切り出す。
- カエルリンガー溶液に組織ブロックを転送し、脳の腹側を露出させ細かいハサミで結合組織を取り除く。
- イメージング室に組織ブロックを転送し、ナイロン糸で弦楽器プラチナ枠で固定します。
- 共焦点/多光子顕微鏡のステージ上イメージングチャンバーをマウントします。
- 嗅球の像の3次元積層を獲得。
7.画像処理およびデータ評価
- クーペ、P. らによって記載されるように最適化し、画質と神経構造の視覚化を改善するために、フィルタリングの非局所的な手段を適用する。15。
NOTE：ライブ試料のより深い組織層におけるイメージング実験からのデータは、多くの場合、ノイズが多い。 - 概要については、画像スタックの最大強度投影を作成します。
- タイムラプスイメージングのための実験は、感覚ニューロンの単一の明確に識別軸索のためのデータセットをスクリーニングする。
- パンらによって記載されるように神経突起のソフトウェア支援のトレースを介して細胞の形態を再構築。16。
Representative Results
記載されたプロトコルが正常にエレクトロポレーションし、麻酔されたXの嗅覚系の感覚ニューロンの軸索プロセスのin vivoでの可視化に適用することができツメガエル 、共焦点レーザー走査または多光子顕微鏡法（ 図1）を使用。
エレクトロポレーションは、フルオロフォア結合デキストランを入力すると、急速に嗅覚器官の細胞の内側に広がることを可能にする。これは、電圧パルスのトリガ後に成功したラベリングを検証するために蛍光照明を適用すると便利です。 、エレクトロポレーションパラメータに応じて、例えば 、ピペット抵抗は、細胞（ 図2A、B）または嗅覚器官の単一細胞（ 図2C）の基が標識されている。標識された感覚ニューロンの軸索は、嗅神経（ 図2D）で可視化することができ、軸索のプロセスが成功したエレクトロポレーション後、嗅球においても、通常24時間を観察することができる（ 図3）。感覚ニューロンのグループのエレクトロポレーションは、嗅球（ 図3A）に粗配線パターンを可視化することができる。単一細胞エレクトロポレーションは、嗅球（ 図3C-E）における糸球体の構造の個々の軸索投射パターンが、軸索の分岐部と接続性を調査するために適用することができる。
Xの透明アルビノオタマジャクシ麻酔をかけたオタマジャクシの無傷の脳における標識感覚ニューロンの生体内共焦点または多光子イメージングにおけるツメガエル許可 。同じ標識感覚ニューロン（ 図4）のin vivoでの可視化を繰り返すことにより、軸索の成長パターンの開発は、数日/数週間にわたって追跡することができる。感覚ニューロンの成熟度に応じて、エレクトロポレーションの時点で嗅球における軸索パターンが大幅に変化することができる。成熟したニューロンは既に房を備えて精巧な軸索の枝を持っている糸球体に接続されているEDエリア。成熟したニューロンの軸索成長パターンはむしろ安定であるが、糸球体房の軸索の枝や改良の伸びが（ 図4A-E）観測可能である。感覚ニューロンは、 例えば 、長期間にわたって生体内で観察することができる。3週間（ 図4F-I）よりも長い。一方、未熟ニューロンの軸索は、タフテッドarborizationsを有していない、初期成長の過程にまだある、まだそれらの最終的な糸球体ターゲットに接続していない。実験プロトコルは、成熟中にこれらのニューロンの開発を追跡することができます例えば 、軸索の伸長、分岐及びタフテッドarborizations（ 図4J-L）の設立。その他の例についてもHassenklöverとマンジニ12を参照してください。
麻酔をかけたXの嗅覚器官の実験プロトコルの図1.概要。（A）の主嗅上皮における感覚ニューロン（MOE）または鋤鼻器官（VNO） ツメガエルの幼生は、蛍光デキストラン溶液を充填したガラスピペットを用いてエレクトロポレーションを介して標識される。標識されたニューロンの軸索は、嗅神経（ON）を介して、続いて、最終的に嗅球（OB）に到達することができる。（B）オタマジャクシに麻酔され、標識されたニューロンを繰り返し、特定の時間間隔で、共焦点又は多光子顕微鏡を用いて調べた。 （C）標識された細胞の軸索成長パターンのインクリメンタル開発は、数日から数週間の時間スパンにわたって追跡することができる。
図2.エレック嗅覚器官における感覚ニューロンのポレーション（A）エレクトロ低抵抗ピペットとは、嗅覚器官内の複数の細胞の標識をもたらす。この代表的な例では、複数の嗅覚受容ニューロン（ORN類、満たされた矢じり）と2つの円柱形の支持細胞（SCS、アスタリスク）が染色された。破線は、嗅上皮（OE）の境界を画定する。（B）、エレクトロポレーションパラメータを絞り込み、 例えば 、ピペットの抵抗を増大させる、標識細胞の数を制限する。この例では、単一の感覚ニューロン（黒塗り矢印）と一つの隣接支持細胞（アスタリスク）は、エレクトロポレーションの後に染色した。嗅上皮（オープン矢じり）を残し、単一の軸索に注意してください。（C）に成功した単一細胞エレクトロポレーションは、個々の感覚ニューロン（塗りつぶされた矢印）および嗅上皮で、接続された軸索（オープン矢じり）の排他的ラベリングにつながる。 
図3.摘出した嗅球における嗅覚軸索投射を可視化。（A）の嗅球における感覚ニューロンの軸索投射の粗いトポロジーは、低抵抗電気穿孔ピペットを用いて可視化することができる。 One嗅球半球とそれに関連する嗅神経（ON）が示されている。 MOE（赤）とVNO（オレンジ）を外側から内側、横方向（緑）、中間体（黄色）：異なる蛍光体に結合された4つのデキストランは、嗅覚器官の4離れた位置で電気穿孔した。これは副嗅球（AOB）と主嗅球（MOB）の3つの主要な投影フィールドを可視化することができます。 
シングル嗅覚ニューロンの軸索のin vivoでのタイムラプスイメージング。（AE） では 、図4成功した単一細胞のエレクトロポレーションの後、標識軸索を繰り返し嗅球（OB）で可視化することができる。この例では、1週間調査した個々の軸索を示しています。 （開いた矢印）の全体的な形態は大きく変化せず、二つの主要な分岐点を識別することができる。他の二つの糸球体の房が（アスタリスク）安定した状態を保つのに対し、時間経過にわたって、1糸球体房は、連続の減少（塗りつぶされた矢印）を受けることに注意してください。（FI）この特定の軸索を調べたように、この代表的な例は、長期的な観測の生存率を示す3週間以上のために。その成長パターンの明らかな変化は検出できなかった。（JL）成長過程における未熟感覚軸索の一例が示されている。それはまだ糸球体に接続されていないがあり、特徴的な糸球体房が欠落しています。軸索の枝を長くしている5日後に、軸索は複数回と罰金arborizationsである二股確立された。
Discussion
ここで説明する実験手順は、幼虫Xの嗅覚器官の感覚ニューロンを標識化することができますフルオロフォア結合デキストランのエレクトロポレーションおよび生きている動物における感覚軸索成長のその後の可視化によってツメガエル 。 インビボでのエレクトロポレーションのパラメータを変えることにより、標識された感覚ニューロンの数を制御することが可能である。それは、感覚上皮のニューロンの大規模なグループ、非常に少数または単一の細胞を標識することが可能となる。
希望する神経細胞のラベリングの延長を保証するためには、マイクロピペット特性および電気穿孔パルス約特に慎重であることが重要です。高いピペット抵抗、電圧パルスの振幅、持続時間及び繰り返し回数の減少は、より広範な標識をもたらすことができるピペット抵抗と高電圧パルスの振幅、持続時間、およびパルスの数を減少させる一方で、標識された細胞の量を減らすことができる。目エレクトロポレーションのための蛍光デキストランの電子の使用は、適用した設定が適切であれば即時の視覚的なフィードバックを提供しています。プロトコルで提供された値を超えたパルスの振幅、持続時間、および数のパラメータを使用すると、潜在的に細胞の損傷、あるいは細胞死17につながる可能性があることに注意してください。マイクロピペットの目詰まりや破損のヒントにも成功したエレクトロポレーションを妨げることができます。
Xの嗅覚器官のin vivoエレクトロポレーションでは postmetamorphoticカエルの皮膚は厳しいですし、簡単にマイクロピペットで浸透することはできませんので、 ツメガエルは幼虫期に限られている。神経突起のin vivo可視化は、より深い脳領域または血管によって励起/発光光の散乱によって妨げられることができる。この問題は、より大きな脳への高い幼虫期に特に顕著になり、細かい軸索のプロセスの明確な識別をより困難にノイズの多い信号につながることができます。
プロトコルの適用は、嗅覚感覚ニューロンに限定されず、 例えば、他の細胞型を研究するために適用することができる。、発達中の脳または嗅球の僧帽細胞の神経性ゾーン/前駆幹細胞。さらに実証技術は、標識されたニューロンおよび/ または接続された回路7,19についての機能情報を取得するために、カルシウム感受性デキストランまたは注入された膜透過性カルシウム色素と組み合わせて使用することができる。デキストランに結合されたフルオロフォアの広範囲の利用可能性は、異なる色を持つ複数の個々の細胞または集団の標識化を可能にする。また、蛍光タンパク質のための例示的な符号化のためのDNA溶液を、プラスミドエレクトロポレーションに適しており、さらにversatiliを高めることができるTYとテクニック6の有用性。プロトコルは、さらにデキストランおよびDNAまたは荷電モルホリノの組み合わせエレクトロポレーション、遺伝子発現13,17を操作することができるように拡張することができる。
記載されている方法は確かに複雑であり、脊椎動物の嗅覚系における軸索ガイダンスを調節し、まだ十分に理解されていないプロセスを調査するための新しいツールを表しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SZX16 | Olympus | Stereomicroscope with fluorescent illumination | |
| Axon Axoporator 800A | Molecular Devices | Single cell electroporator | |
| ELP-01D | npi electronic | Electroporator | |
| MMJ | Märzhäuser Wetzlar | Manual micromanipulator | |
| P-1000 | Sutter | Horizontal micropipette puller | |
| G150F-4 | Warner Instruments | Glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier | |
| Alexa 488-dextran 10 kD | Life Technologies | D22910 | |
| Alexa 546-dextran 10 kD | Life Technologies | D22911 | |
| Alexa 568-dextran 10 kD | Life Technologies | D22912 | |
| Alexa 594-dextran 10 kD | Life Technologies | D22913 | |
| TMR-dextran 3 kD (micro-Ruby) | Life Technologies | D7162 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | Anesthetic; use gloves |
| A1-MP | Nikon | Multiphoton microscope | |
| LSM 780 | Zeiss | Confocal microscope | |
| Imaris | Bitplane | Alternative software for neuronal tracing |
References
- Huard, J. M., Youngentob, S. L., Goldstein, B. J., Luskin, M. B., Schwob, J. E. Adult olfactory epithelium contains multipotent progenitors that give rise to neurons and non-neural cells. J. Comp. Neurol. 400 (4), 486-4810 (1998).
- Schwob, J. E. Neural regeneration and the peripheral olfactory system. Anat. Rec. 269 (1), 33-49 (2002).
- Leung, C. T., Coulombe, P. A., Reed, R. R. Contribution of olfactory neural stem cells to tissue maintenance and regeneration. Nat. Neurosci. 10 (6), 72-726 (2007).
- Lodovichi, C., Belluscio, L. Odorant receptors in the formation of the olfactory bulb circuitry. Physiology (Bethesda. 27 (4), 212-2110 (2012).
- Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain). Annu. Rev. Neurosci. 34, 467-499 (2011).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Hovis, K. R., Padmanabhan, K., Urban, N. N. A simple method of in vitro electroporation allows visualization, recording, and calcium imaging of local neuronal circuits. J. Neurosci. Methods. 191 (1), 1-10 (2010).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44 (1-2), 5-14 (2006).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), (2008).
- Gliem, S., et al. Bimodal processing of olfactory information in an amphibian nose: odor responses segregate into a medial and a lateral stream. Cell. Mol. Life Sci. 70 (11), 1965-1984 (2013).
- Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. J. Neurosci. 33 (44), 17252-1710 (2013).
- Bestman, J. E., Ewald, R. C., Chiu, S. -L., Cline, H. T. In vivo single-cell electroporation for transfer of DNA and macromolecules. Nat. Protoc. 1 (3), 1272-1210 (2006).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
- Coupé, P., Munz, M., Manjón, J. V., Ruthazer, E. S., Collins, D. L. A CANDLE for a deeper in vivo insight. Med. Image Anal. 16 (4), 849-864 (2012).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat. Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
- Nezlin, L. P., Schild, D. Individual olfactory sensory neurons project into more than one glomerulus in Xenopus laevis tadpole olfactory bulb. J. Comp. Neurol. 481 (3), 233-239 (2005).
- Nagayama, S., et al. In vivo simultaneous tracing and Ca2+ imaging of local neuronal circuits. Neuron. 53 (6), 789-803 (2007).
