Protocol
OPMERKING: Animal handling en experimenten werden uitgevoerd, zoals goedgekeurd door de universiteit van Göttingen Comité voor Ethiek in de Dierproeven.
1. Voorbereiding van Instrumenten en Pipette Fabrication
- Zorg ervoor dat de elektroporatie setup bestaat uit een stereomicroscoop met grote werkafstand en is uitgerust met TL verlichting en filter sets voor de gebruikte kleurstof.
- Voor elektroporatie gebruiken ofwel een speciale cel electroporator of algemene vierkante pulsgenerator aan een oscilloscoop. Sluit de electroporator uitgangen om een pipet houder en een bad elektrode. Sluit de positieve klem van de pulsgenerator de micropipet houder en de minpool aan het bad elektrode. Het zowel de pipet houder en het bad elektrode bevatten zilver draden gecoat met een dunne laag zilver chloride.
- Monteer de pipet houder op een micromanipulator Exacte positionering mogelijk te maken. Fabriceren elektroporatie micropipetten van borosilicaatglas haarvaten met interne gloeidraad.
- Gebruik een horizontale micropipet trekker en een gemodificeerd protocol toepassing voor de vervaardiging van pipetten voor patch-clamp experimenten zoals beschreven door Bestman et al. 13.
- Passen parameters een langere schacht en een kleinere tip opening resulteert in een hogere pipet weerstand van ongeveer 15-20 MOhm voor enkele cel elektroporatie produceren. De pipet weerstand lager moet zijn, bijvoorbeeld 3-4 MOhm voor etikettering van groepen cellen.
- Meet de pipet weerstand ofwel direct met een speciale single-cell electroporator of berekenen met de wet van Ohm na het meten van stroom met een oscilloscoop na toepassing van een bepaald voltage puls.
2. Bereiding van Electroporation Solution
- Ontbinden-fluorofoor gekoppeld dextran in frog beltoon (98 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM CaCl2, 2 mM MgCl 2, 5 mM glucose, 5 mM Na-pyruvaat, 10 mM HEPES, pH 7,8, osmolariteit was 230 mOsmol / l) bij een concentratie van 3 mM. De cellen kunnen niet zo helder worden geëtiketteerd als lagere kleurstof concentraties worden gebruikt. Bereid een groot volume stockoplossing en verdeel het in kleine porties. Bevriezen ze voor opslag (stabiel gedurende maanden).
OPMERKING: Dextranen zijn verkrijgbaar in verschillende maten en een verscheidenheid van de emissie / excitatiespectra (bv, Alexa 488-dextran 10 kD, Alexa 546-dextran 10 kD, Alexa 568-dextran 10 kD, Alexa 594-dextran 10 kD, TMR-dextran 3kD.). - Backfill de micropipet met een langwerpige pipetpunt met een kleine hoeveelheid dextran oplossing (1-5 ul). Flick zorgvuldig de micropipet met de vinger om de resterende luchtbellen uit de pipet tip verwijderen.
- Monteer de micropipet in de pipet houder. Zorg ervoor dat de zilverdraad in de pipet in contact met de kleurstofoplossing.
3. Selectie van larvale X. laevis </ Em>
- Gebruik albino larven van X. laevis voor de experimenten. Wildtype dieren bezitten-pigment gevulde melanoforen dat autofluorescentie-emissie tijdens confocale / multiphoton beeldvorming tonen en zijn daarom niet geschikt voor de beschreven experimenten.
- Stage premetamorphotic kikkervisjes na Nieuwkoop en Faber 14. Selecteer kikkervisjes trappen 45-53 voor de experimenten.
4. Elektroporatie van fluorofoor-gekoppelde dextranen
- Leg een klein stukje weefsel in een petrischaal en bedekken met een kleine hoeveelheid water die 0,02% tricaïne (Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat, pH 7).
- Verdoven van de kikkervisjes in water met 0,02% tricaïne. Na enkele minuten de dieren ophouden te bewegen. Bevestig de juiste verdoving door het aanraken van kikkervisjes. Ze dienen niet-responsief.
- Breng zorgvuldig het kikkervisje van de verdoving naar het weefsel bedekt petrischaal.
- Zorg ervoor dat het bad elektrode sluit de elektroporatie circuit. Zorg dat de elektrode in contact met het vochtige doekje; een direct contact met het kikkervisje is niet noodzakelijk.
- Plaats de micropipet tip dicht bij het reukorgaan met behulp van de micromanipulator.
- Doordringen in de huid die de reukorgaan met de pipet en voorzichtig vooruit de tip in de centraal gelegen sensorische neuron laag van de belangrijkste reukepitheel of vomeronasal epitheel.
- Triggeren positieve vierkante spanningsimpulsen om kleurstof te zetten in sensorische neuronen. Breng een enkele spanningspuls (bijv., 25 V, puls lengte 25 msec) of treinen van meerdere pulsen (bv., 50 V, puls lengte 300 usee, 400 msec trein duur bij 200 Hz).
OPMERKING: Bepaal optimale spanningspuls parameters voor de gewenste uitbreiding van de etikettering. Verminder spanning pulsamplitude, duur en het aantal herhalingen van het aantal gelabelde cellen verminderen. Breng hogere spanning pulsamplitude, duur en aantal pulses voor een meer wijdverbreide etikettering. - Visualiseer succesvolle kleurstof extrusie en elektroporatie door getriggerd pulsen met fluorescerende verlichting van de stereomicroscoop. De kleurstof verspreidt zich snel in cellichaam en dendrieten na succesvolle elektroporatie.
- Herhaal de stappen 4,5-4,9 voor de tweede reukorgaan van het kikkervisje.
- Breng het kikkervisje in een bekerglas gevuld met vers water voor de invordering. Na ca. 5 min van de kikkervisjes ontwaken uit narcose en het normale zwembewegingen.
- Na 24 uur de geëlectroporeerd kleurstof verspreidt zich in de sensorische neuronen en bereikt uiteindelijk het reukorgaan via axonale transport.
5. Montage Dieren voor in vivo visualisatie van cellen en Axonale Processen
- Verdoven van de kikkervisjes in water met 0,02% tricaïne.
- Zorgvuldig overdragen kikkervisjes in een imaging kamer, bijvoorbeeld, een kleine siliconen rubber bedekte petrischaal met een kikkervisje-sized uitsparing. </ Li>
- Snij een kleine rechthoek in een streep van Parafilm. Bedek het kikkervisje met de Parafilm, waardoor de voorste telencephalon blootgesteld via de cut-out-venster. Bevestig de Parafilm met naalden op de schotel zonder verwonden het kikkervisje.
- Zorg ervoor dat het kikkervisje is ondergedompeld in voldoende water met 0,02% tricaïne.
- Monteer de beeldvorming kamer op het podium van een rechtopstaande multifoton microscoop of confocale microscoop.
- Het verwerven van een driedimensionale stapel van beelden van de bulbus olfactorius. Zorg dat de beeldvormende procedure zo kort mogelijk en niet hoger dan 10-15 min.
- Breng het kikkervisje in gewoon water in een aparte tank en blootstelling te voorkomen aan het licht. Na 5 min, het kikkervisje ontwaakt uit anesthesie.
- Herhaal de stappen 5,1-5,7 na bepaalde tijdsintervallen, bijv., Elke dag.
6. Montage Dieren voor Ex vivo visualisatie van cellen en Axonale Processen
- Als alternatief voor sectie 5van het protocol, gebruik een weggesneden hersenen voorbereiding op de gelabelde sensorische neuronen te visualiseren.
- Verdoven en doden van het kikkervisje door doorsnijding van de hersenen bij de overgang naar het ruggenmerg. Accijnzen een blok van weefsel met daarin de reukorganen, de olfactorische zenuwen en de anterior telencephalon.
- Breng het weefsel blok naar kikker Ringer-oplossing en verwijder bindweefsel met fijne schaar om de ventrale zijde van de hersenen bloot te leggen.
- Breng het weefsel blok naar een beeldvorming kamer en zet deze vast met een platina montuur strijkinstrumenten met nylon draden.
- Monteer de beeldvorming kamer op het podium van een confocale / multifoton microscoop.
- Het verwerven van een driedimensionale stapel van beelden van de bulbus olfactorius.
7. Beeldverwerking en Data Evaluation
- Optimaliseren en niet-lokale middel van filtering om de beeldkwaliteit en de visualisatie van de neuronale structuren verbeteren van toepassing zoals beschreven door Coupé, P. et al. 15.
LET OP: De gegevens van imaging experimenten in diepere weefsellagen van levende exemplaren zijn vaak luidruchtig. - Creëer maximale intensiteit projecties van het beeld stacks voor een overzicht.
- Voor time-lapse imaging experimenten screenen datasets voor enkele ondubbelzinnig identificeerbaar axonen van sensorische neuronen.
- Reconstrueren celmorfologie via software-ondersteunde traceren van neuronale processen zoals beschreven door Peng et al. 16.
Representative Results
De beschreven protocol kan goed worden toegepast voor elektroporatie en in vivo visualisatie van axonale processen van sensorische neuronen van het olfactorische systeem verdoofde X. laevis, met confocale laser-scanning of multifoton microscopie (figuur 1).
Elektroporatie laat-fluorofor gekoppeld dextranen aan te gaan en zich snel te verspreiden in de cellen van het reukorgaan. Het is nuttig om fluorescentieverlichting toepassing succesvolle etikettering verifiëren na activering van spanningspulsen. Afhankelijk van de elektroporatie parameters, bijv., Pipet weerstand, groepen cellen (figuur 2A, B) of enkelvoudige cellen (Figuur 2C) van de reukzin gelabeld. Axonen van gelabelde sensorische neuronen kunnen worden gevisualiseerd in de olfactorische zenuw (figuur 2D) en axonale processen kunnen ook na succesvolle elektroporatie worden waargenomen in de bulbus olfactorius, gewoonlijk 24 uur(Figuur 3). Elektroporatie van groepen van sensorische neuronen maakt visualiseren grove bedradingspatronen in de olfactorische bulb (Figuur 3A). Single cell elektroporatie kan worden toegepast op afzonderlijke axonale projectie patronen, axonale vertakkingen en connectiviteit glomerulaire structuren in de olfactorische bulb (Figuur 3C-E) te onderzoeken.
Transparante albino kikkervisjes van X. laevis vergunning in vivo confocale of multiphoton beeldvorming van gelabelde sensorische neuronen in de intacte hersenen van verdoofd kikkervisje. De ontwikkeling van axonale groei patronen kunnen worden gevolgd gedurende meerdere dagen / weken door herhaalde in vivo visualisatie van dezelfde gelabelde sensorische neuron (Figuur 4). Afhankelijk van de looptijd van de sensorische neuron op het tijdstip van elektroporatie de axon patroon in de olfactorische bulb kan aanzienlijk variëren. Volwassen neuronen reeds uitgebreide axonale takken die tuft voorzien bezittened gebieden aangesloten op glomeruli. De axonale groeipatroon van volwassen neuronen is redelijk stabiel, maar de rek van axon takken en verfijningen van glomerulaire plukjes waarneembaar zijn (Figuur 4A-E). Sensorische neuronen in vivo worden waargenomen gedurende langere tijd, bv., Meer dan drie weken (figuur 4F-I). Anderzijds, axonen van onvolwassen neuronen nog bezig initiële groei, hoeft tufted arborizations bezitten en nog niet verbonden met hun uiteindelijke glomerulaire doelen. Het experimentele protocol maakt het bijhouden van de ontwikkeling van deze neuronen tijdens de rijping, bijv., Axon rek, vertakkingen en de vestiging van getuft arborizations (Figuur 4J-L). Voor meer voorbeelden zie ook Hassenklöver en Manzini 12.
Figuur 1. Schematische weergave van het experimentele protocol. (A) Sensorische neuronen in het centraal reukepitheel (MOE) of vomeronasale orgaan (VNO) van de reukzin van verdoofde X. laevis larven worden gemerkt door elektroporatie met een glazen pipet gevuld met fluorescerende dextran oplossing. De axonen van gelabelde neuronen zijn door middel van de olfactorische zenuw (ON) en uiteindelijk de bulbus olfactorius (OB) te bereiken. (B) De kikkervisje verdoofd en de gelabelde neuronen herhaaldelijk onderzocht met een confocale microscoop of multifoton specifieke tijdsintervallen. (C) De incrementele ontwikkeling van axonale groei patroon van gemerkte cellen in tijdspannes dagen tot weken gevolgd.
Figuur 2. Electroporation van sensorische neuronen in het reukorgaan. (A) Electroporatie met lage weerstand pipetten leidt tot etikettering van meerdere cellen in het reukorgaan. In dit representatief voorbeeld multiple olfactorische receptor neuronen (ORNs, gevuld pijlpunten) en twee zuilvormige-vormige ondersteunende cellen (SC's, sterretjes) werden gekleurd. Gestippelde lijnen bakenen de grenzen van de reukepitheel (OE). (B) Verfijning elektroporatie parameters, bijv. Het verhogen van de pipet weerstand beperkt het aantal gemerkte cellen. In dit voorbeeld, een sensorisch neuron (gevulde pijlpunten) en een aangrenzende ondersteunende cel (asterisk) werden gekleurd na elektroporatie. Let op de enkele axon verlaten van de reukepitheel (open pijlpunten). (C) Succesvolle single cell elektroporatie leidt tot de exclusieve kenmerken van een individuele sensorische neuron (gevulde pijlpunt) en haar verbonden axon (open pijlpunten) in de olfactorische epitheel. 
Figuur 3. visualiseren olfactorische axon projecties in de uitgesneden bulbus olfactorius. (A) De grove topologie van axonale projecties van sensorische neuronen in de olfactorische bulb kan worden gevisualiseerd door minder weerstand elektroporatie pipetten. Eén reukbol halfrond en de bijbehorende reukzenuw (ON) zijn afgebeeld. Vier dextranen gekoppeld met verschillende fluoroforen geëlektroporeerd op vier afstanden zijn van de reukzin: laterale (groen), tussenproduct (geel), mediale MOE (rood) en VNO (oranje). Dit maakt het visualiseren van het accessoire bulbus olfactorius (AOB) en de drie projectie gebied van de belangrijkste bulbus olfactorius (MOB). 
Figuur 4. In vivo time-lapse imaging van enkele olfactorische neuron axonen. (AE)Na succesvolle single cell elektroporatie de gelabelde axon herhaaldelijk kan worden gevisualiseerd in de olfactorische bulb (OB). Dit voorbeeld toont een individu axon die werd onderzocht voor een week. De algehele morfologie niet te sterk wijzigt en twee grote vertakking punten kunnen worden geïdentificeerd (open pijlpunten). Merk op dat in het tijdsverloop, een glomerulaire tuft ondergaat voortdurende vermindering (gevulde pijlpunt), terwijl de andere twee glomerulaire plukjes blijven stabiel (sterretjes). (FI) Dit representatief voorbeeld toont de levensvatbaarheid van langdurige observaties als deze specifieke axon werd onderzocht meer dan drie weken. Geen duidelijke wijziging van zijn groeipatroon kan worden gedetecteerd. (JL) Een voorbeeld van een onrijpe sensorische axon in het groeiproces afgebeeld. Het is nog niet verbonden glomeruli en karakteristieke glomerulaire bosjes ontbreken. Na 5 dagen de axonale vertakkingen zijn langwerpig, de axon bifurcated meerdere keren en fijne arborizations zijnvastgesteld.
Discussion
De hier beschreven experimentele procedure laat etikettering sensorische neuronen van het reukorgaan van larvale X. laevis door elektroporatie van fluorofoor gekoppelde dextranen en daaropvolgende visualisatie van sensorische axon groei in het levende dier. Door het variëren van de parameters van de in vivo elektroporatie is het mogelijk om het aantal gelabelde sensorische neuronen regelen. Het is daardoor mogelijk om grote groepen neuronen van een sensorische epitheel, zeer weinig of zelfs enkele cellen te labelen.
Om er zeker van de gewenste mate van neuronale etikettering is het belangrijk vooral voorzichtig over de micropipet kenmerken en de elektroporatie pulsen te zijn. Hogere pipet weerstanden en vermindering van spanning pulsamplitude, duur en aantal herhalingen kan de hoeveelheid gelabelde cellen verminderen, terwijl afnemende pipet weerstanden en hogere voltage pulsamplitude, duur en aantal pulsen kan leiden tot grotere schaal labeling. The gebruik van fluorescerende dextranen voor elektroporatie biedt onmiddellijke visuele feedback als de toegepaste instellingen geschikt zijn. Wees voorzichtig dat het gebruik van parameters voor de amplitude, de duur en het aantal pulsen dat de waarden in het protocol is overschreden kan mogelijk leiden tot beschadiging van cellen of zelfs de dood tot 17 cel. Verstopte of gebroken tips van micropipetten kan ook succesvol elektroporatie belemmeren.
In vivo elektroporatie in de reukzin X. laevis beperkt tot larven omdat de huid van postmetamorphotic kikkers is steviger en kan niet gemakkelijk worden gepenetreerd met een micropipet. De in vivo visualisatie van de neuronale processen kunnen worden gehinderd door verstrooiing van excitatie / emissie licht in diepere hersengebieden of door de bloedvaten. Dit probleem wordt vooral duidelijk hoger larven door een grotere hersenen en kan leiden tot afnemende signalen die duidelijke identificatie van fijne axonale processen moeilijker.
De toepassing van het protocol is niet beperkt tot olfactorische sensorische neuronen, maar kan ook worden toegepast op andere celtypen, bijv bestuderen., Stam / progenitorcellen van de neurogene zones van de ontwikkelende hersenen of mitrale cellen van de bulbus olfactorius. Bovendien toonden de techniek kan ook worden gebruikt in combinatie met calcium gevoelige dextranen of geïnjecteerd membraan permeabele calcium kleurstoffen functionele informatie over het gelabelde neuron en / of de aangesloten schakeling 7,19 krijgen. De beschikbaarheid van een groot aantal fluoroforen gekoppeld met dextranen maakt etikettering van meerdere afzonderlijke cellen of populaties met verschillende kleuren. Bovendien plasmide DNA oplossing, bijvoorbeeld coderen voor fluorescerende eiwitten, is geschikt voor elektroporatie en kan verder de versatility en het nut van de techniek 6. Het protocol kan verder worden verbeterd, zodat de gecombineerde elektroporatie van dextranen en DNA of geladen morpholinos genexpressie 13,17 manipuleren.
De beschreven werkwijze is zeker een nieuw instrument voor het complex en nog niet volledig begrepen processen axonale begeleiding vertebrate olfactorische systeem reguleren onderzoeken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SZX16 | Olympus | Stereomicroscope with fluorescent illumination | |
| Axon Axoporator 800A | Molecular Devices | Single cell electroporator | |
| ELP-01D | npi electronic | Electroporator | |
| MMJ | Märzhäuser Wetzlar | Manual micromanipulator | |
| P-1000 | Sutter | Horizontal micropipette puller | |
| G150F-4 | Warner Instruments | Glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier | |
| Alexa 488-dextran 10 kD | Life Technologies | D22910 | |
| Alexa 546-dextran 10 kD | Life Technologies | D22911 | |
| Alexa 568-dextran 10 kD | Life Technologies | D22912 | |
| Alexa 594-dextran 10 kD | Life Technologies | D22913 | |
| TMR-dextran 3 kD (micro-Ruby) | Life Technologies | D7162 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | Anesthetic; use gloves |
| A1-MP | Nikon | Multiphoton microscope | |
| LSM 780 | Zeiss | Confocal microscope | |
| Imaris | Bitplane | Alternative software for neuronal tracing |
References
- Huard, J. M., Youngentob, S. L., Goldstein, B. J., Luskin, M. B., Schwob, J. E. Adult olfactory epithelium contains multipotent progenitors that give rise to neurons and non-neural cells. J. Comp. Neurol. 400 (4), 486-4810 (1998).
- Schwob, J. E. Neural regeneration and the peripheral olfactory system. Anat. Rec. 269 (1), 33-49 (2002).
- Leung, C. T., Coulombe, P. A., Reed, R. R. Contribution of olfactory neural stem cells to tissue maintenance and regeneration. Nat. Neurosci. 10 (6), 72-726 (2007).
- Lodovichi, C., Belluscio, L. Odorant receptors in the formation of the olfactory bulb circuitry. Physiology (Bethesda. 27 (4), 212-2110 (2012).
- Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain). Annu. Rev. Neurosci. 34, 467-499 (2011).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Hovis, K. R., Padmanabhan, K., Urban, N. N. A simple method of in vitro electroporation allows visualization, recording, and calcium imaging of local neuronal circuits. J. Neurosci. Methods. 191 (1), 1-10 (2010).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44 (1-2), 5-14 (2006).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), (2008).
- Gliem, S., et al. Bimodal processing of olfactory information in an amphibian nose: odor responses segregate into a medial and a lateral stream. Cell. Mol. Life Sci. 70 (11), 1965-1984 (2013).
- Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. J. Neurosci. 33 (44), 17252-1710 (2013).
- Bestman, J. E., Ewald, R. C., Chiu, S. -L., Cline, H. T. In vivo single-cell electroporation for transfer of DNA and macromolecules. Nat. Protoc. 1 (3), 1272-1210 (2006).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
- Coupé, P., Munz, M., Manjón, J. V., Ruthazer, E. S., Collins, D. L. A CANDLE for a deeper in vivo insight. Med. Image Anal. 16 (4), 849-864 (2012).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat. Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
- Nezlin, L. P., Schild, D. Individual olfactory sensory neurons project into more than one glomerulus in Xenopus laevis tadpole olfactory bulb. J. Comp. Neurol. 481 (3), 233-239 (2005).
- Nagayama, S., et al. In vivo simultaneous tracing and Ca2+ imaging of local neuronal circuits. Neuron. 53 (6), 789-803 (2007).
