We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.
The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.
The lifelong turnover of sensory neurons distinguishes the olfactory system from many other sensory and neuronal systems1,2. Newly formed sensory neurons are continuously generated in the basal portion of the olfactory epithelium3 and extend their axons into the olfactory bulb, the first relay station of the olfactory system4. However, the cellular and molecular mechanisms controlling the formation and maintenance of the olfactory map are far from being fully understood4,5.
Here, we describe a protocol for labeling sensory neurons of the olfactory organ of larval X. laevis by in vivo electroporation of fluorophore-coupled dextrans. The presented protocol allows visualization of axonal morphology and connectivity, track axonal development over time and study mechanisms regulating axonal wiring and guidance.
Electroporation is a well established method to introduce charged macromolecules, like dextran-coupled dyes and DNA, into cells6,7. The cell membrane is permeabilized by application of short voltage pulses and the molecules are electrophoretically delivered into the cytosol8. Spatially restricted electroporation using a micropipette permits selective labeling of cells including neurons and has been applied in various neuronal systems including the visual system of X. laevis9,10.
We show how the electroporated animals can be used to study axonal growth patterns and morphology in living animals using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. The described procedure allows identifying the coarse topology of axonal projections of sensory neurons of the main and accessory olfactory system11,12. Using in vivo time lapse imaging, it is also suitable to supervise the glomerular connections of single mature sensory neurons, and to monitor the evolution of the axonal projection patterns of immature sensory neurons12. The described protocol can be applied to investigate the structure and formation of olfactory circuits in the intact animal and can be adapted to other cell types within the olfactory and other neuronal systems.
ここで説明する実験手順は、幼虫Xの嗅覚器官の感覚ニューロンを標識化することができますフルオロフォア結合デキストランのエレクトロポレーションおよび生きている動物における感覚軸索成長のその後の可視化によってツメガエル 。 インビボでのエレクトロポレーションのパラメータを変えることにより、標識された感覚ニューロンの数を制御することが可能である。それは、感覚上皮のニューロンの大規模なグループ、非常に少数または単一の細胞を標識することが可能となる。
希望する神経細胞のラベリングの延長を保証するためには、マイクロピペット特性および電気穿孔パルス約特に慎重であることが重要です。高いピペット抵抗、電圧パルスの振幅、持続時間及び繰り返し回数の減少は、より広範な標識をもたらすことができるピペット抵抗と高電圧パルスの振幅、持続時間、およびパルスの数を減少させる一方で、標識された細胞の量を減らすことができる。目エレクトロポレーションのための蛍光デキストランの電子の使用は、適用した設定が適切であれば即時の視覚的なフィードバックを提供しています。プロトコルで提供された値を超えたパルスの振幅、持続時間、および数のパラメータを使用すると、潜在的に細胞の損傷、あるいは細胞死17につながる可能性があることに注意してください。マイクロピペットの目詰まりや破損のヒントにも成功したエレクトロポレーションを妨げることができます。
Xの嗅覚器官のin vivoエレクトロポレーションでは postmetamorphoticカエルの皮膚は厳しいですし、簡単にマイクロピペットで浸透することはできませんので、 ツメガエルは幼虫期に限られている。神経突起のin vivo可視化は、より深い脳領域または血管によって励起/発光光の散乱によって妨げられることができる。この問題は、より大きな脳への高い幼虫期に特に顕著になり、細かい軸索のプロセスの明確な識別をより困難にノイズの多い信号につながることができます。
<pクラス= "jove_content">ラベリング中に細胞を損傷、動物を解剖することなく、無傷の嗅覚系における感覚ニューロンを可視化するために提示プロトコル許可、組織切片を準備するか、全細胞パッチ中の標識のような、代替的な方法のために必要に応じて組織を固定-clamp実験18。 in vivoでのタイムラプスイメージングで数または単一の感覚ニューロンの標識を組み合わせる場合には、長い時間間隔にわたって単一の成熟した感覚ニューロンの糸球体の接続を可視化することが可能である。このように、それは数週間にわたって未熟感覚ニューロンの軸索投射パターンの開発を監視することも可能である。それは生きている動物内の単一の軸索の成長パターンを監視することができますので、この後者のオプションは、特に興味深い。これは軸索ガイダンスや経路探索を制御する細胞および分子メカニズムを調査する可能性を開く。嗅覚受容体の発現を含むいくつかの要因は、様々なAXOn個のガイダンス分子と感覚ニューロンの匂い物質誘発性/自発的活動は、感覚ニューロン軸索4,5のターゲット発見を調節することが示されている。プロトコルの適用は、嗅覚感覚ニューロンに限定されず、 例えば、他の細胞型を研究するために適用することができる。、発達中の脳または嗅球の僧帽細胞の神経性ゾーン/前駆幹細胞。さらに実証技術は、標識されたニューロンおよび/ または接続された回路7,19についての機能情報を取得するために、カルシウム感受性デキストランまたは注入された膜透過性カルシウム色素と組み合わせて使用することができる。デキストランに結合されたフルオロフォアの広範囲の利用可能性は、異なる色を持つ複数の個々の細胞または集団の標識化を可能にする。また、蛍光タンパク質のための例示的な符号化のためのDNA溶液を、プラスミドエレクトロポレーションに適しており、さらにversatiliを高めることができるTYとテクニック6の有用性。プロトコルは、さらにデキストランおよびDNAまたは荷電モルホリノの組み合わせエレクトロポレーション、遺伝子発現13,17を操作することができるように拡張することができる。
記載されている方法は確かに複雑であり、脊椎動物の嗅覚系における軸索ガイダンスを調節し、まだ十分に理解されていないプロセスを調査するための新しいツールを表しています。
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by DFG Schwerpunktprogramm 1392 (project MA 4113/2-2), cluster of Excellence and DFG Research Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (project B1-9), and the German Ministry of Research and Education (BMBF; project 1364480).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
SZX16 | Olympus | stereomicroscope with fluorescent illumination | |
Axon Axoporator 800A | Molecular Devices | single cell electroporator | |
ELP-01D | npi electronic | electroporator | |
MMJ | Märzhäuser Wetzlar | manual micromanipulator | |
P-1000 | Sutter | Horizontal micropipette puller | |
G150F-4 | Warner Instruments | glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier | |
Alexa 488-dextran 10kD | Life Technologies | D22910 | |
Alexa 546-dextran 10kD | Life Technologies | D22911 | |
Alexa 568-dextran 10kD | Life Technologies | D22912 | |
Alexa 594-dextran 10kD | Life Technologies | D22913 | |
TMR-dextran 3kD (micro-Ruby) | Life Technologies | D7162 | |
microloader pipette tips | eppendorf | 930001007 | |
tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | anesthetic; use gloves |
A1-MP | Nikon | multiphoton microscope | |
LSM 780 | Zeiss | confocal microscope | |
Imaris | Bitplane | alternative software for neuronal tracing |