We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.
The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.
The lifelong turnover of sensory neurons distinguishes the olfactory system from many other sensory and neuronal systems1,2. Newly formed sensory neurons are continuously generated in the basal portion of the olfactory epithelium3 and extend their axons into the olfactory bulb, the first relay station of the olfactory system4. However, the cellular and molecular mechanisms controlling the formation and maintenance of the olfactory map are far from being fully understood4,5.
Here, we describe a protocol for labeling sensory neurons of the olfactory organ of larval X. laevis by in vivo electroporation of fluorophore-coupled dextrans. The presented protocol allows visualization of axonal morphology and connectivity, track axonal development over time and study mechanisms regulating axonal wiring and guidance.
Electroporation is a well established method to introduce charged macromolecules, like dextran-coupled dyes and DNA, into cells6,7. The cell membrane is permeabilized by application of short voltage pulses and the molecules are electrophoretically delivered into the cytosol8. Spatially restricted electroporation using a micropipette permits selective labeling of cells including neurons and has been applied in various neuronal systems including the visual system of X. laevis9,10.
We show how the electroporated animals can be used to study axonal growth patterns and morphology in living animals using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. The described procedure allows identifying the coarse topology of axonal projections of sensory neurons of the main and accessory olfactory system11,12. Using in vivo time lapse imaging, it is also suitable to supervise the glomerular connections of single mature sensory neurons, and to monitor the evolution of the axonal projection patterns of immature sensory neurons12. The described protocol can be applied to investigate the structure and formation of olfactory circuits in the intact animal and can be adapted to other cell types within the olfactory and other neuronal systems.
Den eksperimentelle fremgangsmåte som er beskrevet her tillater merking av sensoriske neuroner av det olfaktoriske organ over larve-X. laevis ved elektroporering av fluoroforen-koplet dekstraner og påfølgende visualisering av sensorisk axon vekst i levende dyr. Ved å variere parametrene av in vivo elektroporering er det mulig å kontrollere antallet av merkede sensoriske nevroner. Det er dermed mulig å merke store grupper av nerveceller av en sensorisk epitel, svært få eller til og med enkeltceller.
For å sikre den ønskede forlengelse av neuronal merking er det viktig å være spesielt forsiktig med mikropipette egenskaper og electroporation pulser. Høyere motstandsverdier pipettes og reduksjon av spenningspuls amplitude, varighet og antall repetisjoner kan redusere mengden av merkede celler, mens avtagende pipettesmotstander og høyere spenningspuls amplitude, varighet og antall pulser som kan føre til mer utbredt merking. The bruk av fluorescerende dekstraner for elektroporering gir umiddelbar visuell tilbakemelding hvis de anvendte innstillingene er riktige. Vær forsiktig at bruk av parametere for amplitude, varighet og antall pulser som overstiger verdiene gitt i protokollen kan potensielt føre til celleskade eller celledød 17. Tette eller ødelagte tips av mikropipetter kan også hindre vellykket elektroporering.
In vivo elektroporering i lukteorganet i X. laevis er begrenset til larvestadier siden huden av postmetamorphotic frosker er tøffere og kan ikke være lett penetrert med en mikropipette. Den in vivo synliggjøring av neuronale prosesser kan bli hindret ved spredning av eksitasjon / emisjon lys i dypere områder av hjernen eller ved blodkar. Dette problemet blir spesielt tydelig i høyere larvestadier som følge av et større hjernen og kan føre til støysignaler som gjør den klar identifikasjon av fine aksonale prosesser vanskeligere.
<pclass = "jove_content"> Den presenterte protokoll tillatelser til å visualisere sensoriske nevroner i intakt luktesystemet uten å dissekere dyr, skade cellene under merking, forberede vev skiver eller feste vevet som er nødvendig for alternative metoder, som merking i hel-celle patch -clamp eksperimenter 18. Når man kombinerer merking av noen få enkle eller sensoriske nevroner med in vivo avbildning tidsforløp, er det mulig å visualisere de glomerulære forbindelser av enkelt modne sensoriske neuroner over lange tidsintervaller. På denne måten er det også mulig å følge utviklingen av de aksonale projeksjons mønstre av umodne sensoriske neuroner i løpet av flere uker. Dette siste alternativet er spesielt interessant fordi den kan overvåke vekstmønstre enkelt axoner i levende dyr. Dette åpner muligheten for å undersøke cellulære og molekylære mekanismer som styrer axon veiledning og pathfinding. Flere faktorer, inkludert odorant reseptor uttrykk, ulike Axon lede molekyler og odorant-indusert / spontan aktivitet av sensoriske neuroner er vist å regulere målet funn av sensoriske nevroner axoner 4,5.Anvendelsen av protokollen er ikke begrenset til olfaktoriske sensoriske neuroner, men kan også anvendes for å studere andre celletyper, f.eks., Stilk / progenitorceller av de nevrogene soner av utviklingen av hjernen eller mitral celler av luktelappen. I tillegg er det demonstrert teknikken kan også anvendes i kombinasjon med kalsiumfølsomme dekstraner eller injisert membran-gjennomtrengelige kalsiumsfargestoffer for å få funksjonell informasjon om den merkede nevroner og / eller den tilkoplede kretser 7,19. Tilgjengeligheten av et bredt spekter av fluoroforer koplet til dekstraner tillater merking av flere enkeltceller eller populasjoner med forskjellige farger. Også plasmid-DNA-oppløsning, for eksempel som koder for fluorescerende proteiner, er egnet for elektroporering og kan ytterligere forbedre versatiliTy og nytten av teknikken 6. Protokollen kan ytterligere bli forbedret slik at den kombinerte dekstraner og elektroporering av DNA eller ladede morpholinos å manipulere genekspresjon 13,17.
Den beskrevne metoden representerer sikkert et nytt verktøy for å undersøke det komplekse og fortsatt ikke fullt ut forstått prosesser som regulerer aksonal veiledning i virveldyr luktsystemet.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by DFG Schwerpunktprogramm 1392 (project MA 4113/2-2), cluster of Excellence and DFG Research Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (project B1-9), and the German Ministry of Research and Education (BMBF; project 1364480).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
SZX16 | Olympus | stereomicroscope with fluorescent illumination | |
Axon Axoporator 800A | Molecular Devices | single cell electroporator | |
ELP-01D | npi electronic | electroporator | |
MMJ | Märzhäuser Wetzlar | manual micromanipulator | |
P-1000 | Sutter | Horizontal micropipette puller | |
G150F-4 | Warner Instruments | glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier | |
Alexa 488-dextran 10kD | Life Technologies | D22910 | |
Alexa 546-dextran 10kD | Life Technologies | D22911 | |
Alexa 568-dextran 10kD | Life Technologies | D22912 | |
Alexa 594-dextran 10kD | Life Technologies | D22913 | |
TMR-dextran 3kD (micro-Ruby) | Life Technologies | D7162 | |
microloader pipette tips | eppendorf | 930001007 | |
tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | anesthetic; use gloves |
A1-MP | Nikon | multiphoton microscope | |
LSM 780 | Zeiss | confocal microscope | |
Imaris | Bitplane | alternative software for neuronal tracing |