Methods for mapping in vivo protein-DNA interactions are becoming crucial for every aspect of genomic research but they are laborious, costly, and time consuming. Here a commercially available robotic liquid handling system that automates chromatin immunoprecipitation for mapping in vivo protein-DNA interactions with limited amounts of cells is presented.
Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq has been used for mapping protein-DNA interactions and allocating histones modifications. The procedure is tedious and time consuming, and one of the major limitations is the requirement for high amounts of starting material, usually millions of cells. Automation of chromatin immunoprecipitation assays is possible when the procedure is based on the use of magnetic beads. Successful automated protocols of chromatin immunoprecipitation and library preparation have been specifically designed on a commercially available robotic liquid handling system dedicated mainly to automate epigenetic assays. First, validation of automated ChIP-seq assays using antibodies directed against various histone modifications was shown, followed by optimization of the automated protocols to perform chromatin immunoprecipitation and library preparation starting with low cell numbers. The goal of these experiments is to provide a valuable tool for future epigenetic analysis of specific cell types, sub-populations, and biopsy samples.
Som Next-Generation Sequencing (NGS) teknologi har blitt utbredt og mer tilgjengelig, den primære metoden for genome-wide kartlegging av protein-DNA interaksjoner er nå Kromatin immunoprecipitation fulgt av NGS deteksjon (ChIP-seq), som gjør oppdagelsen av transkripsjonsfaktor bindingsseter eller mønstre av histonmodifikasjonene. ChIP-seq er fordelaktig ved å gi high-throughput data av hele genomet som kan brukes for kvantitativ og kvalitativ analyse av protein-DNA-interaksjoner ved måling av de anrikede DNA-fragmenter. Det finnes imidlertid noen ulemper i standard chip-seq eksperimenter slik som vanskeligheten med å oppnå nok materiale for å skape et sekvense bibliotek.
Chip eksperimenter er delt inn i seks grunnleggende trinn som innbefatter 1) tverrbindingsprotein-DNA-bindende regioner 2) prøvepreparering som omfatter cellelyse og skjære kromatin ved ultralydbehandling, 3) dannelse av immunkomplekser,4) utfelling av immunokomplekser, 5) vasking av immunkomplekser, og 6) eluering av anriket materiale og analyse ved qPCR og NGS.
Suksessen til en chip-analysen er avhengig av tre faktorer: en god kromatin bearbeiding, mengden av antigen i det opprinnelige prøven, og den spesifisitet og affinitet av antistoffet for dets beslektede antigen. En viktig begrensning er behovet for store mengder av startcellenumrene for å oppnå tilstrekkelig anriket DNA-sekvensering for å lage en bibliotek. For forskere som jobber med begrensede prøvemengder, for eksempel biopsiprøver eller celleunderpopulasjoner, Chip-seq eksperimenter er svært utfordrende. Nyere studier har vist at Chip-seq analyser kan utføres når du arbeider med en lav mengde celler 1, 2. DIAGENODE har utviklet en robot væskehåndtering system som fullt ut kan automat Chip-seq eksperimenter når du starter med et begrenset antall celler.
Automatisering girmange fordeler fremfor manuell utarbeidelse av Chip-seq prøvene som det reduserer menneskelige feil, reduserer variasjon, og reduserer eksperimentell kostnad. Semi-automatisert protokoller for kromatin immunoutfelling og biblioteket fremstillingen er blitt rapportert, men ingen av disse studiene har vist data ved bruk av lave celletall 3, 4, 5, 6.
I denne utredningen et komplett automatisert arbeidsflyt er beskrevet for både kromatin immunoutfellingsstudier og bibliotek forberedelse forsøk i en robotvæskehåndtering system som bruker magnetiske kuler-basert teknologi og som kan ta flere parametere i protokollen optimalisering. Her ble automatisert Chip-seq eksperimenter vellykket utført på et begrenset antall celler med mål om å forenkle, standardisere, og gir en pålitelig løsning for å studere epigenetiske profiler i små cellepopulasjoner. Den automatiserte ChIP protokollen er beskrevet i denne artikkelen har blitt optimalisert på HeLa celler ved hjelp av spesifikke histone antistoffer og reagenser bUT arbeidsflyt kan tilpasses til andre cellelinjer og antistoffer med tilsvarende eksperimentelle optimalisering.
Kromatin immunoprecipitation fulgt av sekvensering er nå en standard prosedyre. Her en automatisert ChIP-seq protokoll som kan generere kromatin epigenetiske profiler med så få som 10 000 celler av utgangsmateriale presenteres.
Automatisere Chip og bibliotek forberedelse analyser gir standardisere ChIP optimalisering prosedyre og redusere eksperimentell variabilitet. Den flytende håndteringssystem presenteres her eliminerer mange av de manuelle prosedyrer knyttet ChIP redusere hendene på tide å bare 30 min, minimerer prøve tap, og muliggjør nøyaktig ChIP-seq med bare noen få pikogram av bibliotek innspill. For å oppnå vellykket automatiserte Chip-seq eksperimenter, er det også viktig å bruke høy kvalitet skåret kromatin forberedelser og chip-seq klasse antistoffer i hvert forsøk Systemet bruker magnetiske kuler-basert teknologi, og tilbyr fleksibilitet til å endre viktigste eksperimentelle parametre som inkubasjon tid for antistoffet beleggeing og immunoutfellingsstudier trinn eller modifisering av vaske forholdene tillater forskeren å gjennomføre alle nødvendige eksperimenter for ChIP-seq optimalisering. Det automatiserte system er en "åpen" plattform som også tillater sammenligning av flere reagenser i parallell for optimalisering av eksperimentelle betingelser for hvert enkelt cellelinje og antistoff, og muliggjør direkte sammenligning av forskjellige typer og konsentrasjoner av kromatin, forskjellige antistoffer og til og med forskjellige typer av magnetisk perler.
En av begrensningene til automatisert system er det behov for å automatisere alle protokoller i volumer som spenner fra 5 mL til 200 mL. Imidlertid miniatyrisering av forsøkene i dette automatisert plattformen gjør det også mulig å spare kostnader i reagenser.
I tillegg til de protokoller som er beskrevet i denne studien, er at systemet kan tilpasses og også automatiserer forskjellige andre basert på magnetiske kuler applikasjoner som en immunoutfellingnd fangst av metylert DNA (MeDIP og MethylCap teknologier), immunopresipitering av hydroxylmethylated DNA (hMEDIP), sekvensiell kromatin immunopresipitering (ReChIP), RNA immunopresipitering (RNA-IP), bisulfitt konvertering, og DNA rensing analyser.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the BLUERPINT EU grant (BLUEPRINT – A BLUEPRINT of Haematopoietic Epigenomes). We also thank the Walloon Region (DG06) for its financial support.
Product Description | Company | Catalogue number | Comments |
PBS | Life technologies | 14190-094 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T3924-100ML | |
Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | |
1,25M Glycine Solution | Diagenode | C01020010 | Component of the ideal ChIP-seq kit |
Lysis Buffer iL1 | Diagenode | C01020010 | Component of the ideal ChIP-seq kit |
Lysis Buffer iL2 | Diagenode | C01020010 | Component of the ideal ChIP-seq kit |
Shearing Buffer iS1 | Diagenode | C01020010 | Component of the ideal ChIP-seq kit |
Protease Inhibitors Mix (200x) | Diagenode | C01010130 | Component of the Auto True Micro ChIP kit |
HBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) | Life technologies | 14175-053 | |
Lysis Buffer tL1 | Diagenode | C01010130 | Component of the Auto True Micro ChIP kit |
ChIP Buffer tC1 | Diagenode | C01010130 | Component of the Auto True Micro ChIP kit |
ideal ChIP-seq kit | Diagneode | C01010051 | |
ChIP-Buffer H | Diagenode | C01010020 | Component of the Auto Histone ChIP-seq kit |
Auto Histone ChIP-seq kit | Diagenode | C01010020 | |
Auto True Micro ChIP kit | Diagenode | C01010130 | |
H3K79me3 polyclonal antibody-Classic | Diagenode | C15310068 | |
H3K27me3 polyclonal antibody-Classic | Diagenode | C15410069 | |
H3K4me3 polyclonal antibody-Classic | Diagenode | C15410030 | |
H3K4me2 polyclonal antibody-Classic | Diagenode | C15410035 | |
H3K9ac polyclonal antibody-Premium | Diagenode | C15410004 | |
H3K9/14ac polyclonal antibody-Premium | Diagenode | C15410200 | |
H3K36me3 polyclonal antibody-Premium | Diagenode | C15410058 | |
H3K9me3 polyclonal antibody-Premium | Diagenode | C15410193 | |
Rabbit IgG | Diagenode | C15410206 | |
Protein-A coated paramagnetic beads | Diagenode | C01010020 | |
Auto IPure | Diagenode | C03010010 | |
MicroChIP DiaPure columns | Diagenode | C03040001 | |
Universal SyberGreenMaster Mix 1.25ml | Diagenode | DMMLD2D100 | |
Quant-IT dsDNA | Invitrogen | Q32854 | |
Illumina Sample Preparation kit fro Genomic DNA | Illumina | FC-121-3001 | |
Illumina True-seq kit ChIP library Prep kit | Illumina | IP-202-1012 | |
MicroPlex Library Preparation Kit | Diagenode | C05010010 | |
Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
Illumina Library prep Quantification kit | Kapa Biosystems | KK4844 | |
IP-Star Compact Automated System | Diagenode | B03000002 | |
Bioruptor Plus | Diagenode | B01020001 | |
Bioruptor Pico | Diagenode | B01060001 | |
Qubit system | Invitrogen | Q32857 | |
Illumina Hiseq systems | Illumina |