Интактные HLA класса I / пептидные комплексы пролить раковыми клетками, представляя собой потенциальную соответствующую биомаркеров рака. Использование без наклеек технологии датчика и T-клеточный рецептор, имитирующего моноклональных антител, определение пролитой MIF / HLA-A * 02: 01 комплексов в клеточных супернатантах MDA-MB-231, с шипами человеческую сыворотку, и плазма пациента показал,, что позволяет развитие Рак роман диагностическая платформа.
По данным Американского общества рака, более чем 200 000 женщин будет диагностирован инвазивный рак молочной железы каждый год, и примерно 40 000 умрут от болезни. Образцы класса человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) I пептидов, полученных из протеасомной деградации клеточных белков и представляет эти фрагменты на клеточной поверхности для допроса циркулирующих цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL). Генерация T-клеточного рецептора мимике (TCRM) моноклональные антитела (моноклональные антитела), которые распознают рак молочной железы особый пептид, / HLA-A * 02: 01 комплексы, такие как те, которые получены от миграции макрофагов фактор, ингибирующий (MIF 19-27) и Нью-Йорк-ESO- 1 157-165 включить обнаружение и уничтожение раковых клеток молочной железы при отсутствии эффективных мер в ответ CTL анти-опухоли. Интактные HLA класса I / пептидные комплексы пролить раковыми клетками молочной железы и представляют потенциально подходящих биомаркеров рака. В этой работе, в системы скрининга прорыв биомаркеров для диагностики ракаы включения T-рецептором клеточной мимические моноклональных антител в сочетании с новым, без наклеек биосенсора с использованием руководствоваться режиме резонанса (ГМР) сенсорная технология представлена. Обнаружение пролитой MIF / HLA-A * 02: 01 комплексов в клеточных супернатантах MDA-MB-231, с шипами человеческую сыворотку, а в плазме пациент продемонстрировал. Влияние этой работы может революционизировать персонализированной медицины через развитие диагностики заболеваний компаньон для целевых иммунотерапии.
На образцах класса I человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) пептиды 8-11 аминокислот в длину, полученных от деградации протеосомной внутриклеточного белка репертуара и представляет эти пептиды на поверхности каждой клетки зародышевого 1,2. HLA комплекс "биомаркер природы", что указывает на состояние здоровья каждой ячейки (фиг.1) с циркулирующим цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL). Признание болезней, связанных пептидов приводит к ликвидации нарушителя клетку CTL. Таким образом, адаптивный иммунный ответ является высокоэффективным на устранение вирусной инфекции и опухоли. Тем не менее, иммунная система оказывает давление, которое часто способствует выбор на наличие вирусов или опухоли, способных в уклонении от эффективного реагирования CTL. Т-клеточный рецептор (имитируя TCRM) моноклональные антитела (моноклональные антитела), которые распознают специфические пептид / HLA-A * 02: 01 комплексы, такие как соли, полученные из рака молочной железы, связанных белков, фактор ингибирования миграции макрофагов (MIF19-27) 3 и NY-ESO-1 157-165, включите обнаружения и уничтожения раковых клеток молочной железы при отсутствии эффективного противоопухолевого CTL ответ 4,5. Этот представитель работа направлена на HLA-A * 0201 молекулой, которая выражается до 30% населения. Тем не менее, определение других соответствующих HLA / пептид, с последующим производством TCRM позволяет разрабатывать целевые иммунотерапии и диагностики спутником заболевания, расширяя полезность этой работы в гораздо более широкие слои населения.
Часть пептида / HLA комплексов, связанных на поверхности клетки высвобождается в плазму. Из-за высокой степени сложности пептид / HLA бассейнов, современных методов для минирования immunopeptidome для HLA, связанных биомаркеров времени. Этот процесс требует аффинной очистки растворимого HLA из плазмы, разделение HLA связанных пептидов с помощью обращенно-фазовой жидкостной хроматографии высокого давления(ОФ-ВЭЖХ) и пептид, последовательность с тандемной масс-спектрометрии (МС / МС) 6,7. Хотя этот процесс является жизнеспособным вариантом для открытия новых терапевтических мишеней, это трудоемкий процесс в качестве инструмента компаньона диагностики для HLA соответствующими задачами уже в терапевтической вакцины или биофармацевтической трубопровода 8-10. TCRM направлены против этих целей предоставить средства для быстрого диагностического развития компаньона, направленные на стратификации пациентов в соответствующие клинические испытания и обеспечить более обоснованные терапевтические возможности.
В этой работе, Система скрининга прорыв биомаркеров для диагностики рака представляется, которая использует TCRM и системы биопроб без наклеек, которая контролирует биологические взаимодействия с минимальными этапов обработки. Система биоанализ без наклеек основан на методе, который использует руководствоваться режиме резонанса (ГМР) эффект, который возникает в диэлектрических волноводов решеток 11-14. Когда широкополосного излучения контакты дифракционныхрешетка в пластинах, необходимых для этой системы, два конкретных длин волн отражается. Связывание взаимодействие между иммобилизованным рецептором и его лигандом контролируется в режиме реального времени отслеживать сдвиг длины волны резонансной с анализатором спектра 12. Отдельные резонансные пики возникают на падающей TE (электрического вектора нормали к плоскости падения) и ТМ (магнитный вектор нормали к плоскости падения) поляризационных состояний, обеспечивающих несколько точек данных, которые могут потенциально увеличить точность обнаружения 11,14. Использование антител предварительно сенсибилизированных плиты в этом этикетки без тест-системы, время анализа выполнения с анализом данных составляет примерно 45 мин. Кроме того, несколько образцов пациентов могут быть допрошены в формате 96- или 384-луночного, явное преимущество над основанной формате ВЭЖХ-МС / МС.
Способ, описанный здесь, представляет собой систему отбора биомаркеров для диагностики рака, которые позволили бы быстрое обнаружение растворимых пептид / HLA комплексов у пациента сыворотка, плазма, моча или слюна образцов в высокой пропускной 96- или 384-формата также. Эта система анализа с использованием Т-клеточный рецептор, имитирующего моноклональные антитела и систему обнаружения метки, свободной сокращает время анализа менее 1 ч по сравнению с 3,5 ч по обычной ELISA. Эта высокая пропускная подход позволяет быстро стратификации пациентов в клинических испытаниях в терапевтических противоопухолевых вакцин или биофармацевтических препаратов. Современные методы обнаружения этих целей заболевания требуют аффинной очистки и ВЭЖХ-МС / МС отдельных образцов пациентов, громоздкой и длительный процесс. Хотя этот метод поддается обычным методам ИФА, есть опасения, что вторичные реагенты для детекции, таких как микроглобулина антитела анти-β2 может изменить структуру зарождающейся HLМолекула и ингибируют связывание с предельной обнаружения TCRM. Этикетка без обнаружения позволяет устранить эти проблемы. Эта процедура может быть модифицирована для использования в других системах, свободных меток, таких как поверхностного плазмонного резонанса системы. Тем не менее, это было бы значительно уменьшить высшие возможности пропускной сравнению с системой биопроб, используемого в этом исследовании.
Этот протокол может быть эффективно изменена для обнаружения не-HLA биомаркеров в сыворотке пациента и плазмы с соблюдением нескольких критических этапов. Мониторинг процесса первоначального покрытия антитела рекомендуется для оптимизации поверхности, как <200 мкм сдвиг, скорее всего, приведет к низким уровнем сигнала на последующей стадии обнаружения. Исходные и после промывки считывает полезны для анализа конечных точек, как обилие сывороточных белков может маскировать связывание низкой концентрации анализируемого вещества. И, наконец, изменение температуры образцов может привести к так, чтобы также вариации. Рекомендуется, чтобы все образцы предварительно инкубировалид метка свободный biosassay блок управления температурой быть установлен на 2-3 ° С выше комнатной температуры. Холодильные образцы должны быть разрешены достаточно времени, чтобы добраться до рабочей температуры.
Будущие модификации этого протокола будет включать в себя мультиплексирование TCRM на поверхности пластины. Система биоанализ в настоящее время поддаются кровянистые выделения из скважин на плотность, по меньшей мере, 8-Plex. Вводя 4-8 TCRM в каждую лунку, за объемов образцов тестирования сокращается, и позволяют собрать более сложных данных на пациента. Эта возможность может еще информировать пациентов в связи с терапевтических возможностей.
The authors have nothing to disclose.
These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description (optional) |
ResoSens Label-free Bioassay Detection System | Resonant Sensors Incorporated | ||
Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates | Resonant Sensors Incorporated | ||
ResoVu software | Resonant Sensors Incorporated | ||
RL21A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
RL9A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
FLSL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: FLSELTQQL | |
SLLV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: SLLMWITQV | |
YLEV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: YLEPGPVTV | |
KVL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: KVLEYVIKV | |
Pooled Normal Human Serum | ThermoFisher | BP2657100 | |
MDA-MB-231 Cell Supernatant | ATCC | HTB-26 | Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures. |
Iscove's Modification of Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-053 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-63 | |
Sodium Hydroxide | ThermoFisher | 5318-1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | BP665-1 | |
Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST) | ThermoFisher | BP337-500 | |
2,2’-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) | ThermoFisher | 37615 | |
rabbit anti-human β2 microglobulin | Dako | A0072 | |
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111-035-144 | |
Nunc microplates | ThermoFisher | 439454 | |
Synergy 2 microplate reader | Biotek | ||
Immpress Reagent Kit | Vector | MP-7402 | |
Immpact DAB | Vector | SK-4105 | |
Hematoxylin QS | Vector | H3403 | |
IgG2a | MP BioMedicals | 50328 | |
IgG2b | MP BioMedicals | 50330 | |
anti-HLA-A2 (BB7.2) | Experimmune | ||
Prism 5 | Graphpad |