يتم تسليط سليمة الصف الأول المجمعات HLA / الببتيد من قبل الخلايا السرطانية، وهو ما يمثل العلامات البيولوجية السرطان المحتملة ذات الصلة. استخدام تكنولوجيا الاستشعار خالية من التسمية ومستقبلات الخلايا T-محاكاة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة، والكشف عن سقيفة MIF / HLA-A * 02: 01 المجمعات في supernatants خلية MDA-MB-231، ارتفعت المصل البشري، ويتجلى بلازما المريض، مما يتيح تطوير سرطان رواية منصة التشخيص.
وفقا لجمعية السرطان الأمريكية، وسيتم تشخيص أكثر من 200،000 النساء المصابات بسرطان الثدي كل عام، وحوالي 40،000 سيموت من المرض. مستضد الكريات البيض البشرية (HLA) فئة I عينات الببتيدات المستمدة من تدهور proteasomal من البروتينات الخلوية وتقدم هذه الشظايا على سطح الخلية للتحقيق معهم من خلال تعميم الخلايا الليمفاوية التائية السامة (CTL). جيل من مستقبلات الخلايا T-تقليد (TCRm) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (MABS) التي تعترف سرطان الثدي محددة الببتيد / HLA-A * 02: 01 المجمعات مثل تلك المشتقة من هجرة البلاعم المثبطة عامل (MIF 19-27) وNY-ESO- 1 157-165 تمكين كشف وتدمير خلايا سرطان الثدي في حال عدم وجود المضادة للورم استجابة فعالة CTL. يتم تسليط سليمة الصف الأول المجمعات HLA / الببتيد من قبل خلايا سرطان الثدي وسرطان تمثل المؤشرات الحيوية ذات الصلة المحتملة. في هذا العمل، ونظام فحص اختراق العلامات البيولوجية لسرطان التشخيصويرد ق دمج مستقبلات الخلايا T-الاجسام المضادة تقليد جنبا إلى جنب مع الرواية، خالية من التسمية جهاز الاستشعار البيولوجي باستخدام الموجهة وضع الرنين (GMR) تكنولوجيا الاستشعار. الكشف عن سقيفة MIF / HLA-A * 02: 01 المجمعات في supernatants خلية MDA-MB-231، ارتفعت المصل البشري، ويتجلى بلازما المريض. تأثير هذا العمل يمكن أن تحدث ثورة الطب الشخصي من خلال تطوير وسائل التشخيص مرض مصاحب لالمناعية المستهدفة.
الطبقة I الكريات البيض البشرية مستضد (HLA) عينات الببتيدات من 8-11 الأحماض الأمينية في الطول المستمدة من تدهور proteasomal من البروتين داخل الخلايا ذخيرة وتقدم هذه الببتيدات على سطح كل خلية الأنوية 1،2. مجمع HLA هو "العلامات البيولوجية الطبيعة"، مما يدل على صحة كل خلية (الشكل 1) لتعميم الخلايا الليمفاوية التائية السامة (CTL). الاعتراف المرض المرتبطة الببتيدات النتائج في القضاء على الخلايا المخالف من قبل CTL. وهكذا، فإن الاستجابة المناعية التكيفية فعالة للغاية في القضاء على العدوى الفيروسية والأورام. ومع ذلك، فإن الجهاز المناعي يمارس الضغط والتي غالبا ما يعزز اختيار بحثا عن الفيروسات أو ورم قادرة على التهرب من الاستجابة الفعالة CTL. مستقبلات الخلايا T-محاكاة (TCRm) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (MABS) التي تعترف محدد الببتيد / HLA-A * 02: 01 المجمعات مثل تلك المستمدة من سرطان الثدي البروتينات المرتبطة بها، عامل بلعم المثبطة الهجرة (MIF19-27) 3 وNY-ESO-1 157-165، وتمكين كشف وتدمير خلايا سرطان الثدي في حال عدم وجود المضادة للورم فعال CTL استجابة 4،5. ويركز هذا العمل التمثيلي على HLA-A * 0201 جزيء، وهو ما يعبر عنه بنسبة تصل إلى 30٪ من السكان. ومع ذلك، فإن تحديد غيرها من المجمعات HLA / الببتيد ذات الصلة، تليها إنتاج TCRm ويمكن من تطوير المناعية المستهدفة وتشخيص الأمراض رفيق، وتوسيع فائدة هذا العمل إلى السكان أوسع من ذلك بكثير.
يتم تحرير جزء من المجمعات الببتيد / HLA متجهة إلى سطح الخلية في البلازما. ونظرا لطبيعة معقدة للغاية من الببتيد / حمامات HLA، الأساليب الحالية للتعدين وimmunopeptidome عن المؤشرات الحيوية المرتبطة HLA هي مضيعة للوقت. وتتطلب هذه العملية تنقية تقارب من HLA القابلة للذوبان من البلازما، والفصل بين HLA الببتيدات ذات الصلة عن طريق عكس المرحلة ارتفاع ضغط اللوني السائل(RP-HPLC) والببتيد تسلسل التي كتبها جنبا إلى جنب مطياف الكتلة (MS / MS) 6،7. على الرغم من أن هذه العملية هي خيارا قابلا للتطبيق لاكتشاف أهداف علاجية جديدة، بل هو عملية مرهقة كأداة تشخيصية رفيق للأهداف المرتبطة HLA بالفعل في لقاح علاجي أو خط أنابيب الصيدلانية البيولوجية 8-10. TCRm الموجهة ضد هذه الأهداف توفر الأدوات اللازمة لتطوير التشخيص رفيق السريعة التي تهدف إلى تقسيمها المرضى في التجارب السريرية ذات الصلة وتوفير خيارات علاجية أكثر استنارة.
في هذا العمل، يتم تقديم نظام فحص اختراق العلامات البيولوجية لتشخيص مرض السرطان الذي يستخدم TCRm ونظام الأحيائي خالية من التسمية التي تراقب التفاعلات البيولوجية مع خطوات معالجة الحد الأدنى. ويستند هذا النظام الأحيائي خالية من التسمية على الطريقة التي يستخدم الموجهة وضع الرنين (GMR) التأثير الذي يحدث في حواجز شبكية الدليل الموجي عازلة 11-14. عندما الاتصالات ذات النطاق العريض في ضوء إنحرافيصريف في لوحات المطلوبة لهذا النظام، وتنعكس اثنين من موجات محددة. ويتم رصد التفاعل بين مستقبلات ملزمة يجمد ويجند في الوقت الحقيقي من خلال تتبع الطول الموجي تحول الرنين مع محلل الطيف 12. تحدث قمم الرنين منفصلة عن الحادث TE (ناقلات الكهربائي الطبيعي لطائرة من الإصابة) وTM (ناقلات المغناطيسي الطبيعي أن الطائرة من الإصابة) الدول الاستقطاب توفير نقاط البيانات المتعددة التي يمكن أن يحتمل زيادة دقة الكشف 11،14. باستخدام الأجسام المضادة لوحات ما قبل توعيتهم في هذا النظام الفحص خالية من التسمية، ووقت التشغيل مقايسة مع تحليل البيانات ما يقرب من 45 دقيقة. وبالإضافة إلى ذلك، عينات المرضى متعددة يمكن استجوابه في شكل 96- أو 384-جيدا، وميزة واضحة على شكل أساس HPLC-MS / MS.
الطريقة الموصوفة هنا يدخل نظام فحص العلامات البيولوجية لتشخيص السرطان الذي من شأنه أن يمكن الكشف السريع عن ذوبان المجمعات الببتيد / HLA في مصل الدم والبلازما والبول أو اللعاب عينات من المرضى في إنتاجية عالية 96- أو شكل 384 بئرا. هذا النظام الفحص باستخدام الخلايا التائية مستقبلات محاكاة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ونظام الكشف خالية من التسمية يقطع الوقت التحليل إلى أقل من 1 ساعة مقارنة مع 3.5 ساعة بواسطة ELISA التقليدية. هذا النهج الإنتاجية العالية تمكن الطبقات السريع للمرضى إلى التجارب السريرية للقاحات السرطان العلاجية أو المستحضرات الصيدلانية البيولوجية. الأساليب الحالية للكشف عن هذه الأهداف المرض تتطلب تنقية تقارب وHPLC-MS / MS عينات المريض الفردية، وهي عملية تستغرق ومرهقة والوقت. على الرغم من أن هذه الطريقة هو قابل للتقنيات ELISA التقليدية، هناك قلق من أن الكواشف كشف الثانوية مثل مكافحة β2 المكروغلوبولين الأجسام المضادة يمكن أن يغير هيكل HL الوليدجزيء وتمنع ملزمة للكشف عن الحد TCRm. كشف خالية من التسمية يخفف من هذه المخاوف. يمكن تعديل هذا الإجراء للاستخدام على أنظمة خالية من التسمية الأخرى مثل نظام سطح مأكل الرنين. ومع ذلك، فإن هذا يقلل كثيرا من قدرات إنتاجية أعلى بالمقارنة مع النظام الأحيائي المستخدمة في هذه الدراسة.
هذا البروتوكول يمكن تعديلها على نحو فعال للكشف عن المؤشرات الحيوية غير HLA-في مصل المريض والبلازما مع الالتزام بضع خطوات حاسمة. ويوصى رصد عملية طلاء الأجسام المضادة الأولية لتعظيم الاستفادة من السطح، باعتباره <200 مساء التحول سوف يؤدي على الأرجح في إشارة منخفضة للخطوة الكشف اللاحقة. خط الأساس وبعد غسل-يقرأ مفيدة لتحليل نقطة النهاية حيث وفرة للبروتينات المصل قد يخفي ملزم من انخفاض تركيز تحليلها. وأخيرا، والتباين في درجة الحرارة من العينات يمكن أن يؤدي بشكل جيد لاختلاف الآبار. فمن المستحسن أن جميع العينات تكون مرحلة ما قبل المحتضنة لد يتم تعيين التسمية biosassay مجانا تحكم في درجة الحرارة وحدة في 2-3 درجة مئوية فوق درجة حرارة الغرفة. وينبغي أن يسمح عينات المبردة وقتا كافيا للوصول إلى درجة حرارة التشغيل.
وسوف تشمل التعديلات المستقبلية من هذا البروتوكول مضاعفة من TCRm على سطح اللوحة. النظام الأحيائي هو الانقياد حاليا لاكتشاف آبار في مناطق ذات كثافة ما لا يقل عن 8 الصفيف. عن طريق إدخال 4-8 TCRm إلى كل بئر، في حجم عينة الاختبار يتم تخفيض وتمكين مجموعة من البيانات التي تزداد تعقيدا لكل مريض. يمكن لهذه القدرة مزيد من إبلاغ المرضى فيما يتعلق الخيارات العلاجية.
The authors have nothing to disclose.
These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description (optional) |
ResoSens Label-free Bioassay Detection System | Resonant Sensors Incorporated | ||
Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates | Resonant Sensors Incorporated | ||
ResoVu software | Resonant Sensors Incorporated | ||
RL21A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
RL9A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
FLSL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: FLSELTQQL | |
SLLV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: SLLMWITQV | |
YLEV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: YLEPGPVTV | |
KVL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: KVLEYVIKV | |
Pooled Normal Human Serum | ThermoFisher | BP2657100 | |
MDA-MB-231 Cell Supernatant | ATCC | HTB-26 | Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures. |
Iscove's Modification of Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-053 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-63 | |
Sodium Hydroxide | ThermoFisher | 5318-1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | BP665-1 | |
Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST) | ThermoFisher | BP337-500 | |
2,2’-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) | ThermoFisher | 37615 | |
rabbit anti-human β2 microglobulin | Dako | A0072 | |
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111-035-144 | |
Nunc microplates | ThermoFisher | 439454 | |
Synergy 2 microplate reader | Biotek | ||
Immpress Reagent Kit | Vector | MP-7402 | |
Immpact DAB | Vector | SK-4105 | |
Hematoxylin QS | Vector | H3403 | |
IgG2a | MP BioMedicals | 50328 | |
IgG2b | MP BioMedicals | 50330 | |
anti-HLA-A2 (BB7.2) | Experimmune | ||
Prism 5 | Graphpad |