Intactas classe I complexos HLA / péptido são derramadas por células cancerosas, o que representa um potencial biomarcador câncer relevante. Utilizando tecnologia de sensor livre de marcador e do receptor de células T imitando anticorpos monoclonais, a detecção de barracão MIF / HLA-A * 02: 01 complexos em sobrenadantes de células MDA-MB-231, cravado soro humano, e plasma do paciente é demonstrada, permitindo o desenvolvimento de um romance câncer plataforma de diagnóstico.
De acordo com a American Cancer Society, mais de 200.000 mulheres serão diagnosticadas com câncer de mama invasivo em cada ano e aproximadamente 40.000 morrerão da doença. A classe I amostras de antigénio de leucócitos humanos (HLA) de péptidos derivados de degradação proteossómica de proteínas celulares e apresenta estes fragmentos na superfície celular para serem interrogados pelo circulantes linfócitos T citotóxicos (CTL). Geração de imitador do receptor de células T (TCRm) anticorpos monoclonais (mAbs) que reconhecem o cancro da mama específico peptídeo / HLA-A * 02: 01 complexos, tais como aqueles derivados de factor de inibição de migração de macrófagos (MIF 19-27) e NY-eso 1 157-165 permitir a detecção e destruição de células de câncer de mama, na ausência de uma resposta eficaz CTL anti-tumor. Intactas classe I complexos HLA / péptido são derramadas por células de câncer de mama e representam biomarcadores de câncer potencialmente relevantes. Neste trabalho, um sistema de triagem avanço biomarcador para o diagnóstico de câncers incorporando receptor de células T anticorpos monoclonais imitam combinados com um romance, livre de marcador de biossensor utilizando ressonância de modo guiado (GMR) tecnologia de sensor é apresentado. Detecção de barracão MIF / HLA-A * 02: 01 complexos em sobrenadantes de células MDA-MB-231, cravado soro humano, e plasma do paciente é demonstrada. O impacto deste trabalho poderia revolucionar a medicina personalizada através do desenvolvimento de diagnósticos de doenças de companhia para immunotherapies alvejados.
Os antigénios de classe I de Leucócitos Humanos (HLA) Amostras péptidos de 8-11 aminoácidos de comprimento, derivadas da degradação proteossómica do repertório de proteínas intracelulares e apresenta estes péptidos na superfície de todas as células nucleadas 1,2. O complexo HLA é "biomarcador da natureza", indicando a saúde de cada célula (Figura 1) para circulação de linfócitos T citotóxicos (CTL). Reconhecimento da doença associada peptídeos resulta em eliminação da célula incriminada por CTL. Assim, a resposta imune adaptativa é altamente eficaz na eliminação de infecções virais e tumores. No entanto, o sistema imunitário exerce uma pressão que muitas vezes promove a selecção de vírus ou tumorais capazes de evadir uma resposta de CTL eficaz. Receptor de células T (imitando TCRm) anticorpos monoclonais (mAbs) que reconhecem específico peptídeo / HLA-A * 02: 01 complexos, tais como aqueles derivados a partir de proteínas associadas com cancro da mama, factor de inibição de migração de macrófagos (MIF19-27) 3 e NY-ESO-1 157-165, permitir a detecção e destruição de células de câncer de mama, na ausência de um anti-tumor eficaz CTL de resposta 4,5. Este trabalho representativo é focado sobre a HLA-A * 0201, que é expressa em cerca de 30% da população. No entanto, a identificação de outros complexos de HLA / péptido relevantes, seguida pela produção de TCRm permite o desenvolvimento de imunoterapias para o diagnóstico de doenças visadas e companheiro, expandir a utilidade do presente trabalho para uma população muito mais ampla.
Uma parte dos complexos de péptido / HLA ligados para a superfície da célula é libertado para o plasma. Devido à natureza altamente complexo de peptídeos / piscinas HLA, métodos atuais para a mineração do immunopeptidome de biomarcadores HLA associados são demorados. Este processo requer a purificação por afinidade de HLA solúvel a partir de plasma, a separação de péptidos HLA associados por meio de cromatografia líquida de alta pressão de fase inversa(RP-HPLC) e sequenciação de péptidos por espectrometria de massa em tandem (MS / MS) 6,7. Embora este processo é uma opção viável para a descoberta de novos alvos terapêuticos, é um processo complicado, como uma ferramenta de diagnóstico companheiro para metas associadas HLA já na vacina terapêutica ou gasoduto biofarmacêutica 8-10. TCRm dirigidos contra estes objectivos fornecer as ferramentas para o desenvolvimento de diagnóstico rápido companheiro destinadas a estratificar pacientes em ensaios clínicos relevantes e fornecer opções terapêuticas mais informadas.
Neste trabalho, um sistema de triagem descoberta de biomarcadores para o diagnóstico de câncer é apresentada, que utiliza TCRm e um sistema de bioensaio livre-label que monitora interações biológicas com passos mínimos de processamento. O sistema de bioensaio livre de marcador baseia-se um método, que utiliza o efeito de modo guiado de ressonância (GMR) que ocorre em grelhas de guias de onda dieléctricas 11-14. Quando os contatos de luz de banda larga a difracçãoralar nas placas necessárias para este sistema, dois comprimentos de onda específicos são reflectidas. A interacção da ligação entre um receptor e o seu ligando imobilizado é monitorado em tempo real, seguindo o deslocamento do comprimento de onda de ressonância com um analisador de espectro 12. Picos de ressonância separadas para ocorrer incidente TE (vector eléctrico normal ao plano de incidência) e TM (vector magnético normal ao plano de incidência) estados de polarização que fornecem vários pontos de dados que pode potencialmente aumentar a precisão da detecção 11,14. Usando placas de anticorpo pré-sensibilizados neste sistema de ensaio livre de marcador, o tempo de execução de ensaio com a análise de dados é de aproximadamente 45 min. Além disso, múltiplas amostras pode ser interrogada em um formato de 96 ou de 384 poços, uma clara vantagem sobre um formato baseado em HPLC-MS / MS.
O método aqui descrito apresenta um sistema de rastreio para o diagnóstico de cancro biomarcador que permitem a rápida detecção de complexos de péptido / HLA solúveis em soro, plasma, urina ou saliva amostras de pacientes em um alto rendimento de formato de 96 ou de 384 poços. Este sistema de ensaio utilizando o receptor de células T imitando anticorpos monoclonais e de um sistema de detecção livre de etiqueta reduz o tempo de análise para menos de 1 h em comparação com 3,5 h por ELISA convencional. Esta abordagem de alto rendimento permite estratificação rápida de pacientes para ensaios clínicos de vacinas contra o câncer terapêuticos ou biofármacos. Os métodos actuais para a detecção de alvos destas doenças requerem purificação por afinidade e HPLC-MS / MS de amostras de doentes individuais, um processo que consome tempo e complicado. Embora este método é susceptível de técnicas de ELISA convencionais, existe a preocupação de que os reagentes de detecção secundárias, tais como o anticorpo anti-microglobulina β2 poderia alterar a estrutura da HL nascenteUma molécula e inibem a ligação para a detecção de limitação TCRm. Detecção de livre-Label alivia essas preocupações. Este procedimento pode ser modificado para ser utilizado em outros sistemas sem etiqueta, tal como um sistema de ressonância de plasmon de superfície. No entanto, isso iria reduzir consideravelmente a capacidade de rendimento mais elevados em comparação com o sistema de bioensaio usado neste estudo.
Este protocolo pode ser modificado de forma eficaz para a detecção de marcadores não-HLA no soro e no plasma de pacientes com aderência aos poucos passos críticos. A monitorização do processo de revestimento inicial anticorpo é recomendado para a optimização da superfície, como um <200 pm mudança irá provavelmente resultar em baixo do sinal para a etapa de detecção subsequente. A linha de base e pós-lavagem leituras são úteis para a análise de ponto final como a abundância de proteínas séricas podem mascarar a ligação de baixa concentração de analito. Finalmente, a variação da temperatura de amostras pode resultar na variação de poço a poço. Recomenda-se que todas as amostras de ser pré-incubada umad o biosassay livre controlador de temperatura unidade rótulo fixado em 2-3 ° C acima da temperatura ambiente. As amostras refrigeradas deve dispor de tempo suficiente para alcançar a temperatura de funcionamento.
Modificações futuras deste protocolo incluirá multiplexação de TCRm na superfície da placa. O sistema de bioensaio é actualmente passível de manchas de poços a uma densidade de, pelo menos, 8-Plex. Com a introdução de 4-8 TCRm a cada poço, por volumes de amostra de teste são reduzidos e permitir a recolha de dados cada vez mais complexos por paciente. Esta capacidade poderia informar mais pacientes no que diz respeito às opções terapêuticas.
The authors have nothing to disclose.
These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description (optional) |
ResoSens Label-free Bioassay Detection System | Resonant Sensors Incorporated | ||
Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates | Resonant Sensors Incorporated | ||
ResoVu software | Resonant Sensors Incorporated | ||
RL21A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
RL9A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
FLSL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: FLSELTQQL | |
SLLV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: SLLMWITQV | |
YLEV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: YLEPGPVTV | |
KVL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: KVLEYVIKV | |
Pooled Normal Human Serum | ThermoFisher | BP2657100 | |
MDA-MB-231 Cell Supernatant | ATCC | HTB-26 | Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures. |
Iscove's Modification of Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-053 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-63 | |
Sodium Hydroxide | ThermoFisher | 5318-1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | BP665-1 | |
Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST) | ThermoFisher | BP337-500 | |
2,2’-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) | ThermoFisher | 37615 | |
rabbit anti-human β2 microglobulin | Dako | A0072 | |
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111-035-144 | |
Nunc microplates | ThermoFisher | 439454 | |
Synergy 2 microplate reader | Biotek | ||
Immpress Reagent Kit | Vector | MP-7402 | |
Immpact DAB | Vector | SK-4105 | |
Hematoxylin QS | Vector | H3403 | |
IgG2a | MP BioMedicals | 50328 | |
IgG2b | MP BioMedicals | 50330 | |
anti-HLA-A2 (BB7.2) | Experimmune | ||
Prism 5 | Graphpad |