बरकरार वर्ग मैं एचएलए / पेप्टाइड परिसरों एक संभावित प्रासंगिक कैंसर बायोमार्कर का प्रतिनिधित्व करने, कैंसर कोशिकाओं द्वारा बहा रहे हैं। मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, शेड MIF / एचएलए-ए का पता लगाने की नकल उतार लेबल से मुक्त सेंसर तकनीक और टी सेल रिसेप्टर उपयोग * 02: एमडीए MB-231 सेल supernatants में 01 परिसरों, मानव सीरम नुकीला, और रोगी प्लाज्मा के विकास को सक्षम करने, प्रदर्शन किया है एक उपन्यास कैंसर निदान मंच।
अमेरिकन कैंसर सोसायटी के अनुसार, 200,000 से अधिक महिलाओं इनवेसिव स्तन कैंसर के हर साल के साथ का निदान किया जाएगा और लगभग 40,000 रोग से मर जाएगा। मानव ल्युकोसैट प्रतिजन (एचएलए) वर्ग मैं नमूनों सेलुलर प्रोटीन की proteasomal गिरावट से व्युत्पन्न पेप्टाइड्स और परिसंचारी साइटोटोक्सिक टी lymphocytes (सीटीएल) द्वारा पूछताछ के लिए कोशिका की सतह पर इन टुकड़ों को प्रस्तुत करता है। टी सेल रिसेप्टर नकल की पीढ़ी (TCRm) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी स्तन कैंसर को पहचान जो (MABS) विशिष्ट पेप्टाइड / एचएलए-ए * 02: ऐसे बृहतभक्षककोशिका प्रवास निरोधात्मक कारक (MIF 19-27) और न्यूयॉर्क-ESO- से ली गई उन के रूप में 01 परिसरों एक 157-165 एक प्रभावी विरोधी ट्यूमर सीटीएल प्रतिक्रिया के अभाव में पता लगाने और स्तन कैंसर की कोशिकाओं के विनाश के लिए सक्षम है। बरकरार वर्ग मैं एचएलए / पेप्टाइड परिसरों स्तन कैंसर की कोशिकाओं द्वारा शेड और संभावित रूप से प्रासंगिक कैंसर बायोमार्कर का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। इस काम के निदान के कैंसर के लिए एक सफलता बायोमार्कर स्क्रीनिंग प्रणाली मेंटी सेल रिसेप्टर निर्देशित मोड प्रतिध्वनि (जीएमआर) सेंसर प्रौद्योगिकी के उपयोग के लिए एक उपन्यास, लेबल से मुक्त biosensor के साथ संयुक्त नकल मोनोक्लोनल एंटीबॉडी शामिल है प्रस्तुत किया है। शेड MIF / एचएलए-ए की पहचान * 02: एमडीए MB-231 सेल supernatants में 01 परिसरों, मानव सीरम नुकीला, और रोगी प्लाज्मा प्रदर्शन किया है। इस काम के प्रभाव को लक्षित immunotherapies के लिए साथी रोग निदान के विकास के माध्यम से व्यक्तिगत चिकित्सा क्रांति आ सकती है।
वर्ग मैं मानव ल्युकोसैट प्रतिजन (एचएलए) नमूने के intracellular प्रोटीन प्रदर्शनों की सूची के proteasomal गिरावट से व्युत्पन्न लंबाई में 8-11 अमीनो एसिड के पेप्टाइड्स और हर एकल कोशिका 1,2 की सतह पर इन पेप्टाइड्स प्रस्तुत करता है। एचएलए जटिल परिसंचारी साइटोटोक्सिक टी lymphocytes (सीटीएल) से (चित्रा 1) प्रत्येक कोशिका के स्वास्थ्य का संकेत "प्रकृति के बायोमार्कर," है। सीटीएल द्वारा हमलावर सेल के उन्मूलन में रोग जुड़े पेप्टाइड्स परिणामों की मान्यता। इस प्रकार, अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया वायरल संक्रमण और ट्यूमर को नष्ट करने में अत्यधिक प्रभावी है। हालांकि, प्रतिरक्षा प्रणाली को अक्सर एक प्रभावी सीटीएल प्रतिक्रिया से बच रहा करने में सक्षम वायरस या ट्यूमर के लिए चयन को बढ़ावा देता है जो दबाव डाल रही है। नकल उतार टी सेल रिसेप्टर (TCRm) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विशिष्ट पेप्टाइड / एचएलए-ए * 02 को पहचान जो (MABS): ऐसे स्तन कैंसर से जुड़े प्रोटीन, बृहतभक्षककोशिका प्रवास निरोधात्मक कारक से ली गई उन के रूप में 01 परिसरों (MIF19-27) 3 और न्यूयॉर्क-ESO -1 157-165, सीटीएल 4,5 प्रतिक्रिया एक प्रभावी विरोधी ट्यूमर के अभाव में पता लगाने और स्तन कैंसर की कोशिकाओं के विनाश के लिए सक्षम है। यह प्रतिनिधि काम जनसंख्या का 30% तक द्वारा व्यक्त की है जो एचएलए-ए * 0201 अणु, पर केंद्रित है। हालांकि, TCRm के उत्पादन के द्वारा पीछा अन्य प्रासंगिक एचएलए / पेप्टाइड परिसरों की पहचान, एक बहुत व्यापक आबादी को इस कार्य की उपयोगिता का विस्तार, लक्षित immunotherapies और साथी रोग निदान के विकास के लिए सक्षम बनाता है।
कोशिका की सतह के लिए बाध्य पेप्टाइड / एचएलए परिसरों के एक हिस्से प्लाज्मा में जारी की है। कारण एचएलए जुड़े बायोमार्कर के लिए immunopeptidome खनन के लिए पेप्टाइड / एचएलए पूल, मौजूदा तरीकों की अत्यधिक जटिल प्रकृति के लिए समय लगता है। इस प्रक्रिया प्लाज्मा से घुलनशील एचएलए की आत्मीयता शुद्धि की आवश्यकता है, रिवर्स चरण उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा एचएलए एसोसिएटेड पेप्टाइड्स की जुदाईमिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस / एमएस) 6,7 द्वारा (आरपी-एचपीएलसी) और पेप्टाइड अनुक्रमण। इस प्रक्रिया के उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्य की खोज के लिए एक व्यवहार्य विकल्प है, यह पहले से ही उपचारात्मक टीका या बायोफर्मासिटिकल पाइपलाइन 8-10 में एचएलए एसोसिएटेड लक्ष्यों के लिए एक साथी नैदानिक उपकरण के रूप में एक बोझिल प्रक्रिया है। इन लक्ष्यों को प्रासंगिक क्लिनिकल परीक्षण में रोगियों stratifying और अधिक सूचित चिकित्सकीय विकल्प प्रदान करने के उद्देश्य से तेजी साथी नैदानिक विकास के लिए उपकरण उपलब्ध कराने के खिलाफ TCRm का निर्देशन किया।
इस काम में, कैंसर निदान के लिए एक सफलता बायोमार्कर स्क्रीनिंग प्रणाली TCRm और कम से कम प्रसंस्करण कदम के साथ जैविक बातचीत पर नज़र रखता है कि एक लेबल से मुक्त bioassay प्रणाली का इस्तेमाल करता है जो प्रस्तुत किया है। लेबल से मुक्त bioassay प्रणाली ढांकता हुआ waveguide के gratings के 11-14 में होता है कि निर्देशित मोड प्रतिध्वनि (जीएमआर) प्रभाव का इस्तेमाल करता है जो एक विधि पर आधारित है। जब ब्रॉडबैंड प्रकाश संपर्कों diffractiveइस प्रणाली के लिए आवश्यक प्लेटों में झंझरी, दो विशिष्ट तरंग दैर्ध्य परिलक्षित होते हैं। एक स्थिर रिसेप्टर और उसके ligand के बीच बाध्यकारी बातचीत एक स्पेक्ट्रम विश्लेषक 12 के साथ गूंज तरंगदैर्ध्य पारी पर नज़र रखने से वास्तविक समय में निगरानी रखी जाती है। अलग गूंज चोटियों घटना ते (घटना के विमान को सामान्य बिजली वेक्टर) और टीएम (घटना के विमान को सामान्य चुंबकीय वेक्टर) संभावित पता लगाने सटीकता 11,14 वृद्धि कर सकते हैं कि कई डेटा बिंदुओं को उपलब्ध कराने के ध्रुवीकरण राज्यों के लिए होते हैं। इस लेबल से मुक्त परख प्रणाली में एंटीबॉडी पूर्व अवगत प्लेट का उपयोग, डेटा विश्लेषण के साथ परख चलाते समय लगभग 45 मिनट है। इसके अलावा, कई रोगी के नमूने एक HPLC-एमएस / एमएस आधारित प्रारूप पर, एक 96- या 384 अच्छी तरह प्रारूप में एक स्पष्ट लाभ पूछताछ की जा सकती है।
इस के साथ साथ वर्णित विधि एक उच्च throughput में रोगी सीरम, प्लाज्मा, मूत्र या लार के नमूनों में घुलनशील पेप्टाइड / एचएलए परिसरों का तेजी से पता लगाने के लिए सक्षम 96- या 384 अच्छी तरह प्रारूप होता है कि कैंसर के निदान के लिए एक बायोमार्कर स्क्रीनिंग प्रणाली का परिचय। मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और एक लेबल से मुक्त पहचान प्रणाली की नकल उतार टी सेल रिसेप्टर उपयोग यह परख प्रणाली पारंपरिक एलिसा द्वारा 3.5 घंटा की तुलना में कम से कम एक घंटा के लिए विश्लेषण समय काटता है। इस उच्च throughput दृष्टिकोण चिकित्सीय कैंसर के टीके या बायोफार्मास्यूटिकल्स के लिए क्लिनिकल परीक्षण के लिए रोगियों का तेजी से स्तरीकरण सक्षम बनाता है। इन रोग लक्ष्यों का पता लगाने के लिए मौजूदा तरीकों व्यक्ति रोगी के नमूने, एक बोझिल और समय लेने वाली प्रक्रिया की आत्मीयता शुद्धि और HPLC-एमएस / एमएस की आवश्यकता होती है। इस विधि पारंपरिक एलिसा तकनीक के लिए उत्तरदायी है, चिंता इस तरह के विरोधी β2 माइक्रोग्लोब्युलिन एंटीबॉडी के रूप में माध्यमिक पता लगाने अभिकर्मकों नवजात एच एल की संरचना को बदल सकता है कि वहाँ हैएक अणु और TCRm सीमित पता लगाने के लिए बाध्य रोकती हैं। लेबल मुक्त पता लगाने के लिए इन चिंताओं को दूर करता। यह प्रक्रिया एक ऐसी सतह plasmon अनुनाद प्रणाली के रूप में अन्य लेबल से मुक्त सिस्टम पर उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है। बहरहाल, यह बहुत इस अध्ययन में इस्तेमाल bioassay प्रणाली की तुलना में उच्च throughput क्षमताओं को कम करेगा।
इस प्रोटोकॉल को प्रभावी ढंग से कुछ महत्वपूर्ण कदम के पालन के साथ रोगी सीरम और प्लाज्मा में गैर एचएलए बायोमार्कर का पता लगाने के लिए संशोधित किया जा सकता है। एक <200 बजे पारी संभावना बाद में पता लगाने के कदम के लिए कम संकेत में परिणाम देगा के रूप में प्रारंभिक एंटीबॉडी कोटिंग की प्रक्रिया की निगरानी, सतह के अनुकूलन के लिए सिफारिश की है। सीरम प्रोटीन की प्रचुरता कम एकाग्रता विश्लेष्य के बंधन मुखौटा हो सकता है के रूप में आधारभूत और बाद धो पढ़ता समापन बिंदु विश्लेषण के लिए उपयोगी होते हैं। अंत में, नमूने के तापमान परिवर्तन में अच्छी तरह से अच्छी तरह से बदलाव के लिए हो सकता है। यह सभी नमूने एक पूर्व incubated जा सिफारिश की है किडी लेबल मुक्त biosassay इकाई तापमान नियंत्रक कमरे के तापमान के ऊपर 2-3 डिग्री सेल्सियस पर सेट किया जा। प्रशीतित नमूने ऑपरेटिंग तापमान तक पहुँचने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति दी जानी चाहिए।
इस प्रोटोकॉल के भविष्य संशोधनों थाली सतह पर TCRm की बहुसंकेतन शामिल होंगे। bioassay प्रणाली में कम से कम आठ-Plex के घनत्व पर कुओं की खोलना करने के लिए वर्तमान में उत्तरदायी है। परीक्षण नमूना संस्करणों के अनुसार, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 4-8 TCRm शुरू करने से कम है और रोगी के प्रति तेजी से जटिल डेटा के संग्रह के लिए सक्षम कर रहे हैं। यह क्षमता आगे चिकित्सीय विकल्पों के संबंध में रोगियों को सूचित कर सकता है।
The authors have nothing to disclose.
These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description (optional) |
ResoSens Label-free Bioassay Detection System | Resonant Sensors Incorporated | ||
Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates | Resonant Sensors Incorporated | ||
ResoVu software | Resonant Sensors Incorporated | ||
RL21A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
RL9A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
FLSL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: FLSELTQQL | |
SLLV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: SLLMWITQV | |
YLEV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: YLEPGPVTV | |
KVL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: KVLEYVIKV | |
Pooled Normal Human Serum | ThermoFisher | BP2657100 | |
MDA-MB-231 Cell Supernatant | ATCC | HTB-26 | Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures. |
Iscove's Modification of Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-053 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-63 | |
Sodium Hydroxide | ThermoFisher | 5318-1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | BP665-1 | |
Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST) | ThermoFisher | BP337-500 | |
2,2’-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) | ThermoFisher | 37615 | |
rabbit anti-human β2 microglobulin | Dako | A0072 | |
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111-035-144 | |
Nunc microplates | ThermoFisher | 439454 | |
Synergy 2 microplate reader | Biotek | ||
Immpress Reagent Kit | Vector | MP-7402 | |
Immpact DAB | Vector | SK-4105 | |
Hematoxylin QS | Vector | H3403 | |
IgG2a | MP BioMedicals | 50328 | |
IgG2b | MP BioMedicals | 50330 | |
anti-HLA-A2 (BB7.2) | Experimmune | ||
Prism 5 | Graphpad |