Intakte Klasse I HLA / Peptid-Komplexe werden von Krebszellen zu vergießen, was einem Potential von Bedeutung sind Krebs-Biomarker. Verwendung markierungsfreie Sensorik und T-Zell-Rezeptor imitiert monoklonalen Antikörpern, Nachweis von Schuppen MIF / HLA-A * 02: 01-Komplexe in MDA-MB-231 Zellüberstände, Stachelhumanserum und Patientenplasma wird gezeigt, so dass die Entwicklung von ein neuer Krebsdiagnoseplattform.
Nach Angaben der American Cancer Society, werden mehr als 200.000 Frauen mit invasivem Brustkrebs pro Jahr diagnostiziert, und rund 40.000 an der Krankheit sterben. Die menschliche Leukozyten-Antigen (HLA) Klasse-I-Peptide, die von Proben proteasomalen Abbau von Zellproteinen abgeleitet und stellt diese Fragmente auf der Zelloberfläche für die Abfrage durch zirkulierende cytotoxische T-Lymphozyten (CTL). Erzeugung von T-Zell-Rezeptor-Mimetikum (TCRM) monoklonale Antikörper (mAbs), die Brustkrebs erkennen spezifische Peptid / HLA-A * 02: 01-Komplexe, wie sie aus Makrophagen-Migration-Hemmfaktor (MIF 19-27) und NY-ESO- abgeleiteten 1, 157-165 aktivieren Erkennung und Zerstörung von Brustkrebs-Zellen in Abwesenheit einer wirksamen Antitumor-CTL-Antwort. Intakte Klasse I HLA / Peptid-Komplexe werden von Brustkrebszellen zu vergießen und stellen möglicherweise relevanten Biomarkern. In dieser Arbeit wurde ein Durchbruch Biomarker-Screening-System für die Krebsdiagnostiks Einbeziehung T-Zell-Rezeptor mimic monoklonalen Antikörper in Kombination mit einem neuartigen, markierungsfreie Biosensor Verwendung Geführte-Mode-Resonanz- (GMR-) Sensor-Technologie dargestellt. Der Nachweis von Schuppen MIF / HLA-A * 02: 01-Komplexe in MDA-MB-231 Zellüberstände, Stachelhumanserum und Patientenplasma wird demonstriert. Die Auswirkungen dieser Arbeit konnte personalisierten Medizin durch die Entwicklung von Begleiterkrankungen Diagnose gezielter Immuntherapien zu revolutionieren.
Die Klasse-I-Human-Leukozyten-Antigen (HLA) Proben Peptide von 8-11 Aminosäuren in der Länge von der proteasomalen Abbau des intrazellulären Proteins Repertoires abgeleitet und stellt diese Peptide auf der Oberfläche jeder kernhaltigen Zelle 1,2. Der HLA-Komplex ist "Natur Biomarker", was den Zustand jeder Zelle (1) zum umlaufenden zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL). Die Anerkennung der Krankheit assoziierten Peptiden ergibt Beseitigung des betreffenden Zelle durch CTL. Daher ist die adaptive Immunantwort sehr wirksam zur Beseitigung von viralen Infektionen und Tumoren. Allerdings übt das Immunsystem Druck, der oft fördert Auswahl auf Viren oder Tumor der Lage Umgehung eine effektive CTL-Antwort. T-Zell-Rezeptor nachahmen (TCRM) monoklonale Antikörper (mAbs), die spezifische Peptid / HLA-A * 02 zu erkennen: 01-Komplexe, wie die von Brustkrebs-assoziierten Proteinen, Makrophagenmigration-Hemmfaktor, abgeleitet (MIF19-27) 3 und NY-ESO-1, 157-165, ermöglichen Detektion und Zerstörung von Brustkrebs-Zellen in Abwesenheit einer wirksamen Antitumor-CTL-Reaktion 4,5. Diese repräsentative Arbeiten an HLA-A * 0201-Molekül, das durch bis zu 30% der Population exprimiert wird, konzentriert. Die Identifizierung von anderen relevanten HLA / Peptid-Komplexe, gefolgt von der Herstellung von TCRM ermöglicht jedoch die Entwicklung gezielter Immuntherapien und Begleiterkrankungen Diagnostik, erweitern den Nutzen dieser Arbeit zu einem viel breiteren Bevölkerung.
Ein Teil des Peptid / HLA-Komplexen zur Zelloberfläche gebunden ist, in das Plasma freigesetzt. Aufgrund der hohen Komplexität von Peptid / HLA-Pools, aktuelle Methoden für den Bergbau die immunopeptidome für HLA verbundenen Biomarker sind zeitaufwendig. Dieses Verfahren erfordert die Affinitätsreinigung von löslichem HLA aus Plasma, Abscheidung von HLA assoziierten Peptiden durch Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie(RP-HPLC) und Peptidsequenzierung durch Tandem-Massenspektrometrie (MS / MS) 6,7. Obwohl dieses Verfahren eine praktikable Option für die Entdeckung neuer therapeutischer Ziele, es ist ein schwerfälliger Prozess als Begleiter Diagnose-Tool für HLA damit verbundenen Ziele bereits in der therapeutischen Impfstoff oder biopharmazeutische Pipeline 8-10. TCRM gerichtet gegen diese Ziele stellen die Werkzeuge für die schnelle Entwicklung eines diagnostischen Begleit bei Stratifizierung Patienten in relevanten klinischen Studien und bieten fundierte Therapiemöglichkeiten abzielen.
In dieser Arbeit wird ein Durchbruch Biomarker-Screening-System für die Krebsdiagnostik vorgestellt, TCRM und eine markierungsfreie Bioassay-System, das den biologischen Wechselwirkungen mit minimalen Verarbeitungsschritte überwacht nutzt. Die markierungsfreie Bioassay-System basiert auf einem Verfahren, das die Geführte-Mode-Resonanz- (GMR-) Effekt, der in der dielektrischen Wellenleitergitter 11-14 auftritt nutzt basiert. Bei Breitbandlicht Kontakte die diffraktiveGitter in der für dieses System erforderlichen Platten werden zwei bestimmte Wellenlängen reflektiert. Die Bindungswechselwirkung zwischen einem immobilisierten Rezeptor und seinem Liganden wird in Echtzeit durch Verfolgung der Resonanzwellenlängenverschiebung mit einem Spektrumanalysator 12 überwacht. Separate Resonanzspitzen auftreten, für einfallendes TE (elektrische Vektor senkrecht zur Einfallsebene) und TM (Magnetvektor normal zur Einfallsebene) Polarisationszustände Bereitstellen mehrerer Datenpunkte, die möglicherweise erhöhen Erfassungsgenauigkeit 11,14. Verwendung des Antikörpers vorsensibilisierten Platten in diesem markierungsfreien Assaysystem, das Assay Laufzeit mit der Datenanalyse ist ungefähr 45 min. Darüber hinaus können mehrere Patientenproben in einem 96- oder 384-Well-Format über eine HPLC-MS / MS-basiertes Format abgefragt werden, ist klar im Vorteil.
Das hier beschriebene Verfahren stellt einen Biomarker Screeningsystem für die Krebsdiagnostik, die schnelle Erkennung von löslichen Peptid / HLA-Komplexe in Patientenserum, Plasma, Urin oder Speichel-Proben in einem Hochdurch ermöglichen würde 96- oder 384-Well-Format. Dieses Testsystem unter Verwendung von T-Zell-Rezeptors nachahmt monoklonalen Antikörper und eine markierungsfreie Detektionssystems schneidet die Analysezeit auf weniger als 1 h im Vergleich zu 3,5 Stunden nach herkömmlichen ELISA. Dieses Hochdurchsatz-Ansatz ermöglicht die schnelle Stratifizierung von Patienten mit klinischen Studien für therapeutische Krebsimpfstoffe oder Biopharmazeutika. Derzeitige Verfahren zum Nachweis dieser Krankheitsziele erforderlich Affinitätsreinigung und HPLC-MS / MS individueller Patientenproben, eine mühsame und zeitraubender Prozess. Obwohl dieses Verfahren zugänglich zu herkömmlichen ELISA-Verfahren, gibt es Bedenken, dass sekundäre Nachweisreagenzien wie die anti-β2-Mikroglobulin-Antikörper konnte die Struktur des naszierenden HL verändernEin Molekül, und die Bindung an die TCRM Begrenzungserkennung. Markierungsfreie Detektion lindert diese Bedenken. Dieses Verfahren könnte für die Verwendung auf anderen markierungsfreie Systeme wie ein Oberflächenplasmonresonanz-System modifiziert werden. Dies wäre jedoch erheblich die höhere Durchsatzkapazitäten im Vergleich zum Bioassay-System in dieser Studie verwendet reduzieren.
Dieses Protokoll kann wirksam zum Nachweis von Nicht-HLA-Biomarkern in Patientenserum und Plasma bei Einhaltung einigen kritischen Schritte modifiziert werden. Überwachung der anfänglichen Antikörper-Beschichtungsverfahren ist für die Optimierung der Oberfläche zu empfehlen, da eine <200 pm Verschiebung wird wahrscheinlich bei niedrigen Signal für die nachfolgenden Detektionsschritt führen. Der Studienbeginn und nach dem Waschen liest sind für die Endpunktanalyse als die Fülle von Serumproteinen kann die Bindung von geringer Konzentration Analyt maskieren. Schließlich können Temperaturschwankungen von Proben in Brunnen zu Brunnen Variation führen. Es wird empfohlen, alle Proben vorinkubiert eind das Etikett frei biosassay Einheit Temperaturregler auf 2-3 ° C über der Raumtemperatur eingestellt werden. Gekühlte Proben müssen genügend Zeit, um die Betriebstemperatur zu erreichen gestattet.
Zukünftige Modifikationen dieses Protokolls umfassen Multiplexen TCRM auf der Plattenoberfläche. Das Bioassay-System ist derzeit zugänglich Spek von Vertiefungen in einer Dichte von mindestens 8-plex. Durch die Einführung von 4-8 TCRM in jede Vertiefung, pro Testprobenvolumen reduziert werden und ermöglichen die Erfassung von immer komplexer Daten pro Patient. Diese Fähigkeit könnte weiter Patienten informieren im Hinblick auf Therapiemöglichkeiten.
The authors have nothing to disclose.
These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description (optional) |
ResoSens Label-free Bioassay Detection System | Resonant Sensors Incorporated | ||
Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates | Resonant Sensors Incorporated | ||
ResoVu software | Resonant Sensors Incorporated | ||
RL21A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
RL9A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
FLSL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: FLSELTQQL | |
SLLV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: SLLMWITQV | |
YLEV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: YLEPGPVTV | |
KVL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: KVLEYVIKV | |
Pooled Normal Human Serum | ThermoFisher | BP2657100 | |
MDA-MB-231 Cell Supernatant | ATCC | HTB-26 | Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures. |
Iscove's Modification of Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-053 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-63 | |
Sodium Hydroxide | ThermoFisher | 5318-1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | BP665-1 | |
Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST) | ThermoFisher | BP337-500 | |
2,2’-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) | ThermoFisher | 37615 | |
rabbit anti-human β2 microglobulin | Dako | A0072 | |
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111-035-144 | |
Nunc microplates | ThermoFisher | 439454 | |
Synergy 2 microplate reader | Biotek | ||
Immpress Reagent Kit | Vector | MP-7402 | |
Immpact DAB | Vector | SK-4105 | |
Hematoxylin QS | Vector | H3403 | |
IgG2a | MP BioMedicals | 50328 | |
IgG2b | MP BioMedicals | 50330 | |
anti-HLA-A2 (BB7.2) | Experimmune | ||
Prism 5 | Graphpad |